Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin

S-acylation est une modification post-translationnelle réversible impliquant l’ajout d’une chaîne d’acyl gras à un résidu interne de cystéine sur une protéine cible via un lien de thioester labile¹. Il a d’abord été rapporté comme une modification des protéines avec le palmitate, un acide gras saturé de 16-carbone², et donc cette modification est souvent appelée S-palmitoylation. En plus du palmitate, les protéines peuvent être modifiées de façon réversible par une variété d’acides gras saturés plus longs et plus courts (myristate et stéarate), monoinsaturés (oleate) et polyinsaturés (arachidonate et eicosapentanoate)^3,4,5,6,7. Dans les cellules eucaryotes, S-acylation est catalysée par une famille d’enzymes connues sous le nom d’acyltransferases de protéines DHHC et la réaction inverse de la déphalatation de la cystéine est catalysée par des thioesterases protéiques, dont la plupart restent énigmatiques⁸.

La labilité du lien thioester rend cette modification lipidique réversible, lui permettant de réguler dynamiquement le regroupement des protéines, la localisation de membrane plasmatique, le trafic intracellulaire, les interactions protéines-protéines et la stabilité protéique^9,10. Par conséquent, la S-acylation a été liée à plusieurs troubles, y compris la maladie de Huntington, la maladie d’Alzheimer et plusieurs types de cancer (prostate, gastrique, vessie, poumon, colorectal), qui nécessite le développement de méthodes fiables pour détecter cette modification de protéine post-translationnelle¹¹.

L’étiquetage métabolique avec le palmitate radioactif^([3H], [¹⁴C] ou [¹²⁵I]) a été l’une des premières approches développées pour assayer la protéine S-acylation^12,13,14. Cependant, les méthodes radio-étiquetées présentent des problèmes de santé, ne sont pas très sensibles, prennent beaucoup de temps, et ne détectent la lipidation des protéines très abondantes¹⁵. Une alternative plus rapide et nonradioactive à la radiolabeling est l’étiquetage métabolique avec des sondes d’acides gras bioorthogonal, qui est utilisé régulièrement pour assayer la dynamique de la protéine S-acylation¹⁶. Dans cette méthode, un acide gras avec un journaliste chimique (alkyne ou groupe d’azide) est incorporé dans la protéine S-acylated par une ayltransferase de protéine. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (click chemistry) peut alors être utilisé pour attacher un groupe fonctionnalisé, comme un fluorophore ou une biotine, à l’acide gras intégré permettant la détection de la protéine S-acylé^17,18,19.

L’échange d’acyl-biotine (ABE) est l’une des méthodes biochimiques largement utilisées pour la capture et l’identification des protéines sycylées qui contourne certaines des lacunes de l’étiquetage métabolique tels que l’inadapté pour les échantillons de tissus¹⁵. Cette méthode peut être appliquée pour l’analyse de l’acylation S dans une gamme variée d’échantillons biologiques, y compris les tissus et les échantillons de cellules congelées^20,21. Cette méthode est basée sur le clivage sélectif du lien de thioester entre le groupe d’acyl et le résidu de cystéine par hydroxylamine neutre. Les groupes de thiol libérés sont ensuite capturés avec un dérivé de la biotine thiol-réactif. Les protéines biotinylated générées sont alors affinity-purified utilisant l’agarose de streptavidine et analysées par immunoblotting.

Une approche alternative appelée capture assistée acyl-résine (Acyl-RAC) a été plus tard introduite pour remplacer l’étape de biotinylation par la conjugaison directe des cystéines libres par une résine thiol-réactive^22,23. Cette méthode a moins d’étapes par rapport à ABE et peut également être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans un large éventail d’échantillons¹.

Acyl-RAC se compose de 4 étapes principales (figure 1),
1. Blocage des groupes de thiol libres;
2. Clivage sélectif du lien cystéine-acyl thioester avec l’hydroxylamine neutre (HAM) pour exposer les groupes de thiol de cystéine ;
3. Capturer les cystéines lipidées avec une résine thiol-réactive ;
4. Enrichissement sélectif des protéines S-acylated après l’elution avec la réduction du tampon.

Les protéines capturées peuvent ensuite être analysées par immunoblotting ou soumises à la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SEP) pour évaluer le protéome S-acylé dans une gamme variée d’espèces et de tissus^22,24,25. Les sites individuels d’acylation de S peuvent également être identifiés par la digestion de trypsine des protéines capturées et l’analyse des peptides résultants par LC-MS/MS²². Ici, nous démontrons comment l’acyl-RAC peut être employé pour la détection simultanée de S-acylation des protéines multiples dans une ligne cellulaire et un échantillon de tissu.

Les souris utilisées dans ce protocole ont été euthanasiées selon les lignes directrices des NIH. Le Comité du bien-être des animaux de l’Université du Texas Health Science Center à Houston a approuvé tous les travaux sur les animaux.

1. Préparation des lysates cellulaires

1. Préparer le tampon de lyse tel que décrit dans le tableau 1. À 10 ml de PBS, ajouter 0,1 g de détergent n-dodecyl -D-maltoside (DDM) et tourner pour se dissoudre. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de phosphatase 2, ML211 (10 M), PMSF (10 mM) et cocktail inhibiteur de protéase (1x) et réfrigérer le tampon sur la glace avant utilisation.
2. Transférer les supports nécessaires contenant des cellules de l’incubateur en tubes coniques de 15 ml ou 50 ml et cellules de rotation à 350 x g pendant 5 min et aspirer pour se débarrasser de tout débris cellulaire.
   REMARQUE : Nous avons utilisé 1 x 10⁷ cellules pour chaque réaction d’acyl-RAC à effectuer.
3. Laver la boulette en la ressumant en 5 ml de PBS et en tournant à 350 x g pendant 5 min.
   REMARQUE : Effectuez rapidement l’étape 1.3 pour éviter la lyse cellulaire due à une incubation prolongée dans PBS.
4. Ajouter 600 L de tampon de lyse préparé à l’étape 1.1 à la granule et le lyse en secouant à 1500 tr/min dans un shaker thermique pendant 30 min à 4 oC.
5. Effacer les lysates par centrifugation à 20 000 x g à 4 oC pendant 30 min pour les matériaux insolubles de détergent à granulés. Recueillir le lysate déblayé dans des tubes de microfuge de 1,5 mL pré refroidis et les garder sur la glace.
6. Effectuez un essai Bradford/BCA pour estimer la concentration de protéines. Il est essentiel d’assurer la même quantité de protéines entre différents échantillons avant d’effectuer l’expérience. Nous vous recommandons d’utiliser au moins 500 g de protéines par réaction.
   REMARQUE : Dans les expériences décrites, nous avons employé des cellules cultivées (Jurkat) et des spénocytes primaires du tissu de souris. La méthode de lyse décrite ci-dessus peut être adoptée à d’autres types de cellules ainsi. La concentration moyenne de protéines obtenue pour les types de cellules susmentionnées est d’environ 500 g par 1 x 10⁷ cellules. Les cellules de jurkat ont été maintenues dans le RPMI-1640 moyen modifié pour contenir 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate de sodium, 4.500 mg/L de glucose, et 1.500 mg/L bicarbonate de sodium complété avec 10% FBS à 37 oC avec 5% de CO₂. Nous avons utilisé 1 x 10⁷ cellules Jurkat par réaction. Les ratenocytes primaires ont été isolés du tissu de rate de souris tel que décrit²⁶. En bref, le tissu de rate a été macéré sur la glace, suivi par la lyse des érythrocytes dans la solution hypotonique et la séparation des lymphocytes par centrifugation. Nous avons utilisé 1 x 10⁷ cellules primaires par réaction.

2. Acyl-RAC: Blocage des groupes de thiol libre

REMARQUE : Toutes les étapes suivantes peuvent être effectuées à température ambiante (RT).

1. Transférer le lysate dans un tube de microfuge frais de 1,5 mL et effectuer des précipitations de chloroforme-méthanol (CM) comme décrit ci-dessous.
   1. Ajouter le méthanol (MeOH) et le chloroforme (CHCl₃) au lysate à un rapport final de lysate: MeOH: CHCl₃ de 2:2:1 et secouer vigoureusement pour créer une suspension homogène.
   2. Tourner à 10 000 x g pendant 5 minutes pour former une boulette (« crêpe ») à l’interphase entre les phases aqueuses et organiques.
   3. Incliner le tube et aspirer autant de solvant que possible à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe de chargement de gel.
   4. Aérez le granule de protéines pendant quelques minutes et lavez-le doucement en ajoutant 600 l’un de MeOH et en mélangeant doucement pour éviter de briser la pastille
   5. Retirez soigneusement le reste du MeOH et séchez la boulette de protéines sur un banc pendant environ 5 minutes.
   6. (Facultatif) Effectuez une étape de centrifugation supplémentaire pour faire tourner n’importe quelle granule cassée après le lavage MeOH pour éviter la perte d’échantillon.
      REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée après l’étape de précipitations CM. Une fois la boulette obtenue, elle peut être stockée dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine.
      1. Dissoudre la boulette de protéines en 200 L de tampon de 2SHB en vortexing à 42 oC/1500 tr/min dans un shaker thermique jusqu’à ce que la pastille soit dissoute.
   7. (Facultatif) Incuber pendant 5 à 10 minutes supplémentaires dans un bain d’eau sonore pour dissoudre la boulette.
      REMARQUE : La durée de la sonication varie en fonction de la solubilité du matériau. Cependant, une sonication prolongée peut causer une dégradation des protéines.
2. Préparer 0,2 % de méthane méthylethiosulfonate (MMTS) (v/v) en 2SHB en ajoutant 2 L de MMTS à 998 L de tampon de 2SHB.
   REMARQUE : Utilisez des MMTS fraîchement préparés de 0,2 % pour chaque expérience.
3. Ajouter 200 L de MMTS de 0,2 % dans 2SHB à chaque tube à une concentration finale de 0,1 % de MMTS. Incuber pendant 15 min à 42 oC avec secousses à 1500 tr/min dans un shaker thermique.

3. Acyl-RAC : clivage hydroxylamine (HAM) et capture de protéines S-acylés

1. Répétez les précipitations cm 3-4x comme décrit ci-dessus pour enlever MMTS. L’élimination du MMTS peut être estimée par le manque d’odeur distincte de MMTS. Après chaque précipitation, dissoudre la granule dans 100 L de tampon de 2SHB en vortexing à 42 oC/1500 tr/min dans un shaker thermique jusqu’à ce que la pastille se dissout, puis diluer avec 300 lil de tampon A.
2. Après les précipitations finales, dissoudre les échantillons dans 200 L de tampon de 2SHB tel que décrit ci-dessus et diluer avec 240 lil de tampon A.
3. En cas de comparaison des changements dans la S-acylation en réponse à plusieurs conditions de traitement, mesurer la concentration de protéines à nouveau et procéder avec une quantité égale de protéines pour chaque condition.
4. Conserver 40 ll de chaque échantillon comme contrôle des intrants.
5. Diviser les échantillons en deux parties égales de 200 L et marquer les tubes comme « HAM » et « HAM ». Ajoutez 50 L de HAM neutre fraîchement préparé de 2 M HAM (pH 7,0-7,5) à une concentration finale de 400 mM à l’un des tubes (HAM) et de 50 l de neutre 2 M NaCl au deuxième tube (- HAM), qui sera utilisé comme un contrôle négatif. Procéder à l’ajout de perles thiopropyl-Sepharose (TS).
   REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée après l’une des étapes de précipitations DE CM. Une fois la boulette obtenue, elle peut être stockée dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine. Le pH neutre de 2 M HAM assure sa sélectivité pour le lien thioester acyl-cystéine et doit être soigneusement ajusté. Il faut faire attention lors de la manipulation d’échantillons dans un tampon de 2SHB afin d’éviter la perte d’échantillon en raison d’une mousse excessive. Toutes les étapes suivantes sont identiques pour - échantillons HAM et HAM.
6. Ajouter 30 L de perle-lis à chaque tube et faire pivoter les tubes pendant 1-2 h à RT.
7. Laver les perles TS 4x avec 1% SDS dans tampon A pour enlever HAM résiduel.
   1. Faire tourner doucement tous les échantillons de perles à l’aide d’une microfuge pendant 1 min et aspirer soigneusement le supernatant.
   2. Resuspendez les perles en 500 L de 1% SDS dans le tampon A.
   3. Étape répétitive 3.7.1-3.7.2 trois fois.
      REMARQUE : Le thiopropyl-Sepharose activé (TS) est fourni lyophilisé en présence d’additifs qui doivent être emportés au pH neutre avant le couplage. L’eau distillée est recommandée pour l’enflure et le lavage. Pesez 0,1 g de perles et de résuspendance dans 1 ml d’eau distillée et laissez-la gonfler tout en tournant pendant 30 min-1 h à RT. Laver les perles 1x avec tampon A et préparer une boue avec tampon A, dans un rapport de 50% réglé moyen à 50% tampon. Le TS gonflé peut être stocké au pH neutre en présence de 20 % d’éthanol à 4 oC jusqu’à une semaine. N’utilisez pas l’azide de sodium comme agent bactériostatique puisque les ions d’azide réagissent avec les groupes de disulfide de 2-pyridyl. Pour une plus grande efficacité, préparez des perles fraîches. Pendant la manipulation des perles, la pointe d’une pointe de pipette P200 peut être coupée légèrement afin d’éviter tout dommage.
      REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée à n’importe quel stade après les précipitations de CM. Le granulé peut être entreposé dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine.

4. Elution et détection des protéines S-acylés

1. Après le dernier lavage, tournez doucement vers le bas les perles comme décrit ci-dessus et aspirent autant de supernatant que possible sans déranger les perles.
2. Récupérez les protéines des perles avec un tampon d’échantillon SDS 4x avec de la TNT.
   1. Ajouter 50 L de tampon d’échantillon SDS de 4x aux perles et incuber à 80 oC, 1500 tr/min pendant 15 min dans un shaker thermique. Laissez les tubes refroidir.
   2. Centrifuge les perles à 5.000 x g pendant 3 minutes pour pelleter complètement les perles et transférer les protéines elfées à un tube frais de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de chargement de gel.
3. Exécutez SDS-PAGE et analysez la S-acylation de la protéine (s) d’intérêt par le ballonnement occidental.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons d’abord utilisé acyl-RAC pour détecter simultanément S-acylation de plusieurs protéines dans les cellules de Jurkat, une lignée immortalisée de lymphocytes T à l’origine dérivée du sang périphérique d’un patient de leucémie de cellule T27. Les protéines de cellules T réglementaires précédemment identifiées comme S-acylated9,28,29 ont été choisies pour démontrer l’utilité de cette méthode. Comme le montre la figure 2A, la tyrosine kinase Lck peut être détectée dans les lysates traités avec de l’hydroxylamine neutre de 2 M pour couper le lien thioester entre les résidus de cystéine et une moiety d’acide gras (voie HAM). L’échantillon traité avec 2 M NaCl (- VOIE HAM) représente un contrôle négatif important, indiquant la sélectivité de l’essai pour la détection des liaisons thioester. La voie d’entrée confirme en outre la spécificité du signal et peut servir de contrôle positif si la protéine d’intérêt n’est pas S-acylated. La membrane a ensuite été dépouillée et réprobée d’anticorps contre les protéines Fyn et LAT pour démontrer que l’analyse acyl-RAC peut être utilisée pour analyser l’acylation S de plusieurs protéines en même temps (figure 2A).

Pour démontrer l’utilité de cette méthode pour détecter la protéine S-acylation dans les échantillons de tissus, nous avons appliqué le protocole acyl-RAC à la rate de souris. Comme le montre la figure 2B, l’acylation S de Lck, Fyn et LAT peut être facilement détectée dans les ratenocytes primaires de souris indiquant que cette modification est conservée entre deux espèces.

Figure 1. Représentation schématique de l’acyl-RAC. La méthode se compose de 4 étapes principales : (1) bloquant les groupes de thiol libre avec le méthane de méthylethiosulfonate (MMTS), (2) clivage sélectif du lien cystéine-acyl thioester avec hydroxylamine neutre (HAM) pour exposer les groupes de thiol de cystéine, (3) capture des protéines avec le thiol cystéine nouvellement exposé par conjugaison directe avec une résine thiol-réactive et (4) la récupération des protéines capturées utilisant un tampon d’elution réduisant, suivie par l’immunoblotting ou l’analyse de LA MILLIE. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Détection des protéines S-acylated. Un essai acyl-RAC a été utilisé pour détecter l’acylation S des protéines de signalisation des lymphocytes T dans les lymphocytes T de Jurkat (A) et les tissus de rate murine(B). L’immunoblotting avec des anticorps spécifiques à Lck, Fyn et LAT montre l’acylation S de ces protéines dans l’échantillon traité à l’hydroxylamine (voie HAM). Un échantillon traité avec du chlorure de sodium (- voie HAM) sert de contrôle négatif. Les lysates non traités sont indiqués dans la voie d’entrée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Composition tampon des tampons couramment utilisés requis dans le protocole. Le tampon 2SHB et le tampon A peuvent être préparés à l’avance, mais leur pH doit être vérifié régulièrement. Lysis tampon et HAM doit être préparé le jour de l’expérience.

Aucun conflit d’intérêts déclaré.