Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

Summary

Décrit ici est un protocole pour la détermination de quatre métabolites différents de tryptophane produits dans la voie de kynurenine (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, acide xanthurenic, acide 3-hydroxyanthranilic) dans le milieu recueilli des cultures de cellules cancéreuses analysées par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse quadrupole simple.

Abstract

La voie kynurenine et les catabolites de tryptophane appelées kynurenines ont reçu une attention accrue pour leur participation à la régulation immunitaire et à la biologie du cancer. Un test de culture cellulaire in vitro est souvent utilisé pour en apprendre davantage sur la contribution de différents catabolites tryptophane dans un mécanisme de la maladie et pour tester des stratégies thérapeutiques. Le milieu de culture cellulaire qui est riche en métabolites sécrétés et molécules de signalisation reflète l’état du métabolisme du tryptophane et d’autres événements cellulaires. De nouveaux protocoles pour la quantification fiable de kynurenines multiples dans le milieu complexe de culture cellulaire sont souhaités pour permettre une analyse fiable et rapide de plusieurs échantillons. Ceci peut être accompli avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cette technique puissante est utilisée dans de nombreux laboratoires cliniques et de recherche pour la quantification des métabolites et peut être utilisée pour mesurer les kynurenines.

Présente ici est l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse quadrupole unique (LC-SQ) pour la détermination simultanée de quatre kynurenines, c.-à-kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, et acide xanthurnique dans le milieu recueilli à partir de cellules cancéreuses en culture in vitro. Détecteur SQ est simple à utiliser et moins cher par rapport à d’autres spectromètres de masse. Dans l’analyse SQ-MS, plusieurs ions de l’échantillon sont générés et séparés en fonction de leur rapport masse-charge spécifique(m/z),suivi de la détection à l’aide d’un mode de surveillance ion unique (SIM).

Cet article attire l’attention sur les avantages de la méthode signalée et indique certains points faibles. Il est axé sur des éléments critiques de l’analyse LC-SQ, y compris la préparation de l’échantillon ainsi que la chromatographie et l’analyse de spectrométrie de masse. Le contrôle de la qualité, les conditions d’étalonnage des méthodes et les problèmes d’effet matriciel sont également discutés. Nous avons décrit une application simple de 3-nitrotyrosine comme norme analogique pour tous les analytes cibles. Comme le confirment les expériences menées auprès d’ovaires humains et de cellules cancéreuses du sein, la méthode LC-SQ proposée génère des résultats fiables et peut être appliquée à d’autres modèles cellulaires in vitro.

Introduction

Kynurenine pathway (KP) est la voie principale du catabolisme tryptophane (Trp) dans les cellules humaines. L’indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO-1) dans les cellules extrahépatiques est la première enzyme limitative de KP et convertit Trp en N-formylkynurenine¹. D’autres étapes au sein de KP génèrent d’autres métabolites secondaires, à savoir les kynurenines qui présentent diverses propriétés biologiques. Kynurenine (Kyn) est la première catabolite Trp stable montrant des propriétés toxiques et régulant les événements cellulaires après s’être liant au récepteur des hydrocarbures aryl (AhR)². Par la suite, Kyn est transform....

Protocol

1. Préparation des solutions standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock

1. Peser les réagenouillements dans un flacon avec la plus grande précision (0,3 mg chacun). Pour une meilleure précision, augmenter les reagents, en ajustant le volume du solvant en fonction de l’étape 1.2.
2. Dissoudre les reagents dans 300 μL du solvant pour obtenir une solution de stock de 1 g/L. Dissoudre 3NT en acide formique (FA) de 1 % (v/v) dans l’eau; Kyn, 3HAA, et XA dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO); 3HKyn dans l’eau acidifiée au pH 2.5 avec de l’acide chlorhydrique (HCl).
   ATTENTION: 3HAA irrite les yeux, le nez, la gorge et les poumons. Il est nocif lorsqu’....

Results

LC-MS présente des avantages incontestables dans la quantification des molécules biologiquement actives, même si certaines composantes de spécimens complexes provoquent des effets matriciels et compromettent l’ionisation des analytes. Elle conduit à la suppression des ion ou à l’amélioration de l’ion, diminuant fortement la précision et affectant une limite de détection/quantification de la LC-MS, qui est considérée comme un point « faible » de la méthode. Dans notre protocole, les ions sont générés par l’ionisation d’él.......

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé de LC-SQ pour la quantification simultanée de quatre métabolites principaux de Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) qui sont mesurés dans un milieu des cellules cancéreuses humaines culturenées in vitro. Une attention particulière est accordée à la préparation de l’échantillon, à la procédure chromatographic/spectrométrie de masse et à l’interprétation des données, les points les plus importants de l’analyse.

En général, l’analyse LC-MS, en raison d’un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
Acide 3-hydroxyanthranilique	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tyrosine	Sigma-Aldrich	N7389
Acétonitrile	Supelco	1.00029	hypergrade pour LC-MS LiChrosolv
Charbon actif	Supelco	05105
Balance analytique	Ohaus
Colonne analytique	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 résolution rapide HT (2,1 x 100 mm, 1,8 & micro ; m)
au formate d’ammonium	Supelco	7022	pour LC-MS, LiChropur, &ge ; 99.0 %
Sérum bovin Albumine	Sigma	1001887398
Bouchons pour flacons chromatographiques	Agilent Technologies	5185-5820	bouchons à vis bleus, PTFE/sil sepa rouge
Plat de culture cellulaire	Nest	704004	polystyrène, apyrogène, stérile
Plaque de culture cellulaire	Biologix	07-6012	12 puits, non pyrogène, non cytotoxique, stérile
Incubateur	de cellules Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i
Cu Centrifugeuse	Eppendorf		modèle 5415R
Centrifugeuse	Eppendorf		modèle 5428
Tubes à centrifuger	Bionovo	B-2278	type Eppendorf, 1,5 mL
Tubes à centrifuger	Bionovo	B-3693	type Falcon, 50 mL, PP
Données chromatographiques logiciel d’acquisition et d’analyse	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Flacons chromatographiques à insert	Agilent Technologies	9301-1387	100 µ ; L
Flacons chromatographiques Agilent	Technologies	5182-0714	2 mL, verre transparent
Diméthylsulfoxyde	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Double mètre pH/conductivité	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		model EZ-2.3 Elite
Fetal bovin	sérum Sigma-Aldrich	F9665
Acide formique	Supelco	5.33002	pour LC-MS LiChropur
Flacon en verre pour stockage des	réactifsBionovo	S-2070	50 mL, colonne de protection en verre transparent
	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Colonne de protection à alésage étroit (2,1 x 12,5 mm, 5 & micro ; m)
Acide chlorhydrique	Merck	1.00317.1000
L-kynurénine	Sigma-Aldrich	K8625	&ge ; 98 % (HPLC)
Agitateur magnétique	Wigo		ES 21 H
Microbalance	Mettler Toledo		modèle XP6
Système Milli-Q Millipore		ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV avec pompe
Spectromètre de masse quadripolaire	Agilent Technologies	G1948B	modèle 6120
Pénicilline-Streptomycine	Sigma-Adrich	048M4874V
Lecteur de plaques	Bio Tek		Synergy 2 exploité par Gen5
Chlorure de potassium	Merck	1.04936.1000
Dihydrogénophosphate de potassium	Merck	1.05108.0500
Concentré de réactifs de colorant pour dosage de protéines	BioRad	500-0006
Bascule à bascule	Stuart	SSL4
Pipette sérologique	Nest	326001	5 mL, polystyrène, apyrogène, stérile
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	7647-14-5
Phosphate de sodium dibasique	Merck	1.06346.1000
Filtre d’entrée de solvant	Agilent Technologies	5041-2168	Filtre en verre, 20 &mu ; m taille des pores
Réservoir de solvant (pour LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, verre transparent
Réservoir de solvant (pour LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, verre ambré
Tableur	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Barre d’agitation	Bionovo	6-2003	revêtus de téflon
pour la culture filtration moyenne	Bionovo	7-8803	cellulose régénérée, & Oslash ; 30 mm, 0,45 & micro ; m
Filtres à seringue pour la filtration des composants en phase mobile	Bionovo	6-0018	nylon, & Oslash ; 30 mm, 0,22 & micro ; m
Plaques de culture tissulaire	VWR	10062-900	96 puits,
solution stérile de trypsine-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Système de chromatographie liquide à ultra-haute performance	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Système Infinity composé d’un échantillonneur automatique (G1367D), d’un dégazeur (G1379B), d’une pompe binaire (G1312B), d’un thermostat de colonne (G1316C)
Bain à ultrasons	Polsonic	104533	modèle 6D
Vortex	Biosan		modèle V-1 plus
acide xanthurénique	Sigma-Aldrich	D120804	96 %