Article de méthode

Utilisation de la cytométrie du débit pour détecter et quantifier la formation de sang altérée chez le poisson zèbre en développement

DOI :

10.3791/61035

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29 avril 2021

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Dans cet article

Résumé

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Cet essai est une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques dans le développement du poisson zèbre embryonnaire. Les cellules sanguines du poisson zèbre dissocié sont soumises à l’analyse de cytométrie de flux. Cela permet la détection de défauts sanguins chez les animaux mutants et après modification génétique.

Résumé

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La diversité des lignées cellulaires qui composent le sang mature chez les vertébrés provient de la différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (PSHC). Il s’agit d’un processus critique qui se produit tout au long de la durée de vie des organismes, et la perturbation des voies moléculaires impliquées pendant l’embryogenèse peut avoir des conséquences catastrophiques à long terme. Pour une multitude de raisons, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur, et par 7 jours après la fécondation (dpf) ont produit la plupart des sous-types de cellules sanguines définitives qui persisteront pendant leur vie. Des analyses pour évaluer le nombre de cellules hématopoïétiques ont été développées, utilisant principalement des taches histologiques spécifiques, des techniques d’hybridation in situ et la microscopie d’animaux transgéniques qui utilisent des promoteurs spécifiques aux cellules sanguines conduisant à l’expression de protéines fluorescentes. Cependant, la plupart des analyses de coloration et des techniques d’hybridation in situ ne quantifient pas avec précision le nombre de cellules sanguines présentes; seules de grandes différences dans le nombre de cellules sont facilement visualisées. L’utilisation d’animaux transgéniques et l’analyse d’individus avec une microscopie fluorescente ou confococale peuvent être effectuées, mais la quantitation de ces analyses repose soit sur le comptage manuel, soit sur l’utilisation de logiciels d’imagerie coûteux, qui peuvent tous deux faire des erreurs. Le développement de méthodes supplémentaires pour évaluer le nombre de cellules sanguines serait économique, plus rapide, et pourrait même être automatisé pour évaluer rapidement l’effet de la modification génétique CRISPR-médiée, de la réduction de transcription morpholino-médiée, et de l’effet des composés de drogue qui affectent l’hématopoiesis sur une grande échelle. Ce nouvel essai pour quantifier les cellules sanguines est effectué en dissociant des embryons entiers de poisson zèbre et en analysant la quantité de cellules sanguines étiquetées fluorescentes présentes. Ces analyses devraient permettre l’élucidation des voies moléculaires responsables de la génération, de l’expansion et de la régulation des cellules sanguines pendant l’embryogenèse, ce qui permettra aux chercheurs de découvrir davantage de nouveaux facteurs modifiés pendant les maladies du sang, ainsi que des voies essentielles lors de l’évolution de l’hématopoïèse vertébrée.

Introduction

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La production de sang (hématopoïèse) est un processus de développement essentiel qui commence d’abord dans l’embryon précoce. Ce processus commence par générer des globules rouges primitifs et des macrophages directement à partir du mésoderm, puis se déplace vers la production de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Ces cellules souches, qui sont multipotentes, génèrent toutes les variétés de cellules sanguines matures dans l’organisme. Capable de se renouveler, le système est continuellement réapprovisionné par l’intermédiaire de ces SPPC. Bien que ce processus commence tôt dans le développement, l’hématopoïèse se poursuit pour la vie de l’animal, fournissant la capacité de transporter l’oxygène vers des sites éloignés du corps, d’arrêter de saigner après une blessure, et de protéger le corps contre l’infection. Le développement de ce système complexe est contrôlé temporellement et spatialement pendant le développement et toutes les perturbations dans la production de cellules sanguines peuvent être catastrophiques pour l’organisme, ayant pour résultat l’anémie, la thrombocytopénie, la leukopenia, et la leucémie.

Un modèle animal populaire utilisé pour la recherche hématopoïétique est le poisson zèbre (Danio rerio) parce qu’ils ont un développement sanguin similaire par rapport aux humains. En fait, bon nombre des gènes et des voies moléculaires utilisés pendant l’hématopoïèse sont conservés tout au long de l’évolution des vertébrés, ce qui nous permet d’en apprendre davantage sur les gènes humains en étudiant le poisson zèbre. Fait important, les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur du corps et dans les 7 jours ont généré la plupart des types de cellules sanguines matures, permettant une visualisation directe du système hématopoïétique en peu de temps. Le poisson zèbre est également extrêmement fécond, ce qui permet aux chercheurs d’observer un plus grand nombre d’échantillons dans un court laps de temps, ce qui est également important pour générer des données reproductibles. Le temps de courte génération et le développement externe du poisson zèbre facilitent la manipulation et l’observation pendant les études de mutagenèse1,2,3,4,5 et le dépistage des médicaments6,7,8,9,10. Cela permet de tester rapidement et efficacement un panel de composés thérapeutiques prometteurs pour les troubles sanguins humains.

Fait important, le poisson zèbre est également génétiquement aménageable, et le génome est séquencé et annoté. Cette tractabilité permet d’effectuer des techniques génétiques inverses telles que le knockdown morpholino-(MO-) et l’ablation génétique crispr-médiée. Le poisson zèbre a également prouvé son utilité en tant que modèle pour effectuer des écrans génétiques avancés; de nombreux gènes et voies essentiels impliqués dans la formation de sang vertébré ont été découverts de cette manière. De nombreuses méthodes d’observation des cellules sanguines ont également été développées chez le poisson zèbre. Bien qu’il existe des techniques traditionnelles de coloration histologique, il est également possible d’effectuer une hybridation in situ pour les transcriptions spécifiques au sang. Fait important, il existe également de nombreuses lignées de poissons transgéniques par lesquelles les protéines fluorescentes sont exprimées par des promoteurs spécifiques à la lignée, ce qui permet l’étiquetage de cellules sanguines spécifiques avec des protéines fluorescentes11. Cela permet aux chercheurs d’effectuer une observation à jour de la genèse, de l’expansion et de la régulation des cellules sanguines dans un organisme vivant au fil du temps.

Dans l’ensemble, la conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignes transgéniques, la visualisation facile et le temps de génération courte ont fait du poisson zèbre un modèle économique, rapide et adaptable d’hématopoïèse. Afin d’améliorer la boîte à outils des techniques mises à la disposition des chercheurs du poisson zèbre, nous avons mis au point cet essai pour quantifier solidement le nombre de cellules sanguines dans les embryons. La méthode consiste à digérer les animaux transgéniques et à effectuer une cytométrie d’écoulement pour les cellules sanguines fluorescentes. De cette façon, les cellules sanguines des animaux mutants, l’effet de la modification MO et CRISPR, et l’effet des petites molécules peuvent être analysés quantitativement d’une manière rapide et reproductible. Ces analyses sont des moyens conviviaux et économiques d’énumérer les cellules sanguines, permettant d’examiner leur génération, leur prolifération et leur entretien au fil du temps.

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Protocole

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Le conseil consultatif du Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la California State University de Chico a approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous.

REMARQUE : Il est conseillé de traiter les embryons avec 1-phényle 2-thiourea (PTU; Tableau 1) à 24 heures postfertilization (hpf) pour empêcher la pigmentation qui affecte négativement la discrimination de fluorescence par cytométrie de flux. Toutes les procédures énumérées ci-dessous sont acceptables pour la cytométrie du débit et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Cependant, si son but est de culture des cellules hématopoïétiques après FACS, puis adhérer à des pratiques stériles lors du traitement des échantillons. Le protocole de blanchiment et de préparation des échantillons d’embryons de manière stérile a été décrit précédemment12.

1. Déchorionation de 48 embryons de poisson zèbre hpf

  1. Avec des embryons (au moins 5, mais pas plus de 200 embryons) dans une boîte de Pétri en plastique de 10 cm, inclinez le plat de sorte que les embryons descendent au bord inférieur.
    REMARQUE : Il est facile d’incliner le plat en enlevant son couvercle et en plaçant le couvercle sous un bord de la boîte de Pétri.
  2. Retirer et jeter autant d’E3 moyen(tableau 1)que possible et ajouter 500 μL de protéase de déchorionation (10 mg/mL). Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  3. Après 5 min, ramasser la boîte de Pétri (en gardant tous les embryons au bord inférieur de l’assiette), et tapoter doucement le côté de la boîte de Pétri, permettant aux embryons de frotter doucement contre le fond de la plaque pour enlever complètement les chorions.
  4. Avec une bouteille presser, ajouter ~20 mL de moyen E3 pour diluer la protéase. Permettre aux embryons de se déposer et d’enlever le milieu de l’E3 en décantant.
  5. Répétez l’étape 1.4 3x pour enlever toutes les traces de la protéase de déchorionation.
    REMARQUE : Pour que chaque échantillon soit analysé, au moins 5 embryons sont nécessaires. Cette procédure de déchorionation peut accueillir jusqu’à 200 embryons par boîte de Pétri. Les échantillons peuvent être regroupés à ce stade et séparés plus tard si désiré. Alternativement, la déchorionation manuelle peut être effectuée en déchirant doucement les chorions avec les forceps de l’horloger. C’est avantageux lorsqu’il y a un petit nombre d’embryons. Habituellement, le poisson zèbre éclose de leurs chorions de 72 hpf. Toutefois, les embryons gravement malformés peuvent ne pas être désossés et nécessiteront une déchorionation (manuelle ou chimique) après cette période.

2. Préparation d’échantillons d’embryons pour la dissociation

  1. À l’aide d’une pipette P1000, placer 5−10 embryons dans un seul tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
  2. Retirer le milieu E3 à l’l’l’insurfurité et jeter.
    ATTENTION: Pipette avec soin que les embryons peuvent facilement être jetés au cours des étapes suivantes.
  3. Ajouter 1 mL de 10 mM de dithiothreitol (DTT) dans le milieu E3 pour enlever le revêtement mucus entourant le poisson zèbre embryonnaire11,12,13,14. Déposer le tube de microcentrifugeuse horizontalement et incuber à température ambiante pendant 30 min.

3. Dissociation embryonnaire

  1. Lavez les embryons 3x avec 1 mL de saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco avec Ca2+ et Mg2+ pour enlever les traces de TNT. Après le dernier lavage ajouter 500 μL de DPBS avec Ca2+ et Mg2+ et 5 μL de 5 mg/mL (26 U/mL) de protéase de dissociation.
    REMARQUE : D’autres solutions tamponnées isotoniques peuvent être utilisées, mais elles doivent contenir Ca2+ et Mg2+ pour que l’enzyme de dissociation fonctionne correctement.
  2. Incuber des échantillons à 37 °C sur un shaker orbital horizontal à 185 rpm pendant 60 min. Triturer les embryons avec une pipette P1000 jusqu’à ce que les échantillons soient entièrement dissociés.
    MISE EN GARDE : Prenez soin de ne pas trop digérer les embryons; certains tissus solides devraient être présents, et il ne doit pas être complètement homogène. Il est possible de surdigester, ce qui détruira les cellules sanguines cibles à observer sur le cytomètre d’écoulement (Figure supplémentaire 1).
    REMARQUE : Cette procédure fonctionne le mieux pour les embryons de 48−72 hpf. Les stades ultérieurs peuvent nécessiter une incubation plus longue avec protéase de dissociation. Le calendrier des différentes étapes doit être déterminé empiriquement. Il existe des méthodes alternatives plus rapides pour dissocier le tissu embryonnaire, mais on trouve empiriquement que cette méthode, bien qu’elle prenne 60 min, est assez douce et approfondie pour permettre l’isolement efficace des cellules hématopoïétiques vivantes.

4. Préparation d’embryons dissociés pour la cytométrie du flux

  1. Pipette les 5 embryons dissociés sur le réservoir supérieur d’un tube de fond rond en polystyrène de 5 mL avec un bouchon de passoire cellulaire de 35 μmM.
  2. Rincer les cellules en ajoutant 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2+ ou Mg2+ au capuchon de la passoire du tube de polystyrène de 5 mL contenant les cellules filtrées.
    REMARQUE : D’autres solutions tamponnées isotoniques peuvent également être utilisées, mais elles devraient manquer de Ca2+ ou mg2+ pour diluer et rendre l’enzyme de dissociation inefficace.
  3. Tubes de centrifugeuse à 4 °C et 300 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules. À l’à l’œur d’une pipette, retirer et jeter le surnatant. Resuspendez les cellules en 500 μL de PBS (sans Ca2+ ou Mg2+).

5. Cytométrie d’écoulement

  1. Vortex doucement la suspension cellulaire et ajouter 1:1,000 tache de cellules mortes rouges (Tableau des matériaux).
    REMARQUE: La tache rouge des cellules mortes est un colorant perméable aux cellules qui permet l’exclusion des cellules mortes et des débris des cellules cibles et est un excellent choix de colorant pour la discrimination des cellules mortes, parce qu’il est excité par le laser 633 nm, qui est différent du laser 488 nm utilisé pour exciter les fluorophores communs tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et DSRed. De cette façon, il n’y a pas de chevauchement spectral des cellules mortes et des cellules sanguines transgéniques. Propidium iodure (PI) à 1 mg / mL est une alternative peu coûteuse à la tache de globules morts rouges, mais assurez-vous de réserver certains échantillons tachés uniquement avec PI ainsi que des échantillons seulement avec le fluorophore d’intérêt pour définir la compensation de l’instrument. Dans le cas contraire, les signaux de pi et de fluorophores tels que GFP se chevaucheront, ce qui se traduira par des résultats faussement positifs. Si le cytomètre d’écoulement a également un laser de 405 nm, d’autres colorants tels que la tache bleue de cellules de papa sont également un excellent choix.
    AVERTISSEMENT : En analysant des cellules sanguines, notez qu’après 30 min certains types de cellules commenceront à phagocytose la tache rouge de cellules mortes. Protégez les cellules de la lumière et de la glace jusqu’à l’analyse et effectuez la cytométrie d’écoulement dans les 30 minutes qui s’écoulent après l’ajout du colorant.
  2. Analyse de cytométrie de flux
    REMARQUE : Chaque cytomètre d’écoulement est un peu différent, mais les étapes suivantes aideront à préparer des échantillons pour l’analyse sur la plupart des machines. Pour les utilisateurs nouveaux à couler cytométrie, demandez l’avis de quelqu’un qui est un expert sur la pièce d’équipement en particulier. Les instructions suivantes concernent le cytomètre d’écoulement BD FACSAria Fusion.
    1. Allumez le cytomètre et laissez les lasers se réchauffer pendant 20 min. Réservoir de déchets vide, réservoir de gaine de remplissage avec une solution appropriée (varie en fonction du cytomètre d’écoulement) et démarrer le système fluidique.
      REMARQUE : Il existe habituellement une procédure de démarrage particulière pour chaque type de cytomètre d’écoulement; suivre attentivement cette procédure de démarrage.
    2. Dans le logiciel d’analyse, dessiner cinq parcelles( Figure 1A).
      1. Avoir la première parcelle de point mesurer la dispersion vers l’avant (FSC) sur l’axe x et la dispersion latérale (SSC) sur l’axe y. Définissez FSC comme linéaire et SSC comme journal.
        REMARQUE : Le FSC est une mesure de la taille des cellules, et le SSC est une mesure de la granularité; cela permettra la discrimination des cellules contre les débris. Les populations embryonnaires de cellules sanguines du poisson zèbre ne se séparent pas par taille et granularité de la même manière que les globules adultes du poissonzèbre décrits précédemment 15. Au lieu de cela, ils apparaîtront dans la même population avec toutes les autres cellules embryonnaires digérées.
      2. Définir la deuxième parcelle pour examiner la hauteur fsc (H) par rapport à la largeur FSC (W). Définissez la troisième parcelle pour mesurer SSC (H) par rapport à SSC (W).
        REMARQUE : Cette étape est utilisée pour exclure les doublets (cellules collées ensemble lorsqu’elles passent par le laser).
      3. Réglez la quatrième parcelle de point pour mesurer la tache rouge de cellules mortes sur l’axe x (selon le cytomètre ceci est habituellement équivalent au filtre utilisé pour l’allophycocyanine [APC]) et le SSC sur l’axe y. Cela permettra la discrimination des cellules vivantes à partir de cellules mortes.
        REMARQUE : Les ensembles de filtres de chaque cytomètre peuvent être différents. Assurez-vous d’utiliser le filtre de détection correct pour le colorant de discrimination des cellules mortes.
      4. La cinquième parcelle mesure le fluorophore de choix. Visualisez ceci comme un histogramme du fluorophore (figure 1) ou utilisez une parcelle de point(figure supplémentaire 2).
        REMARQUE : Lors de l’examen de plus d’un fluorophore chez le même animal, il est recommandé d’utiliser une parcelle à points pour afficher les deux paramètres en même temps. S’il y a une chance que les fluorophores aient un chevauchement spectral les uns avec les autres(figure supplémentaire 2),une parcelle à points est également recommandée. Utilisez les paramètres zone (A) pour calculer la zone sous la courbe générée par l’impulsion laser du cytomètre pour tous les paramètres, car ils sont plus précis.
    3. Chargez l’échantillon et réduisez le débit de sorte que l’échantillon ne s’épuise pas rapidement. Ajuster les paramètres FSC et SSC afin que la majeure partie de la population cellulaire puisse être clairement visible (figure 1A).
    4. Dessinez une barrière autour de la population cellulaire et étiquetez-la cellules. S’assurer que la deuxième parcelle à points est fermée sur les cellules, exclure les doublets en tétant d’abord sur FSC, puis sur les singlets SSC.
    5. Sur la quatrième parcelle ajuster les paramètres de tache de cellules mortes rouges de sorte qu’il ya clairement une population négative. Dessinez une porte autour de ces cellules et étiquetez-les comme des cellules vivantes. Sur la cinquième parcelle, portez sur les cellules vivantes et examinez les cellules négatives et positives du fluorophore. Dessinez une porte autour des cellules positives.
      REMARQUE : Cette stratégie hiérarchique de gating examine le fluorophoreunique + cellules qui résident dans la porte vivante de cellules, qui résident également dans la barrière cellulaire. Prenez soin de bien fixer les portes. Ces portes peuvent être personnalisées en fonction de l’expérience.
    6. Exécutez chaque échantillon, en recueillant au moins 25 000 événements de cellules vivantes.
    7. Suivez la procédure d’arrêt pour éteindre la fluidité. Remplissez le réservoir de gaine et videz le réservoir de déchets.
      REMARQUE : Il est souvent difficile de visualiser le fluorophore+ les cellules lorsque l’expression protéique est faible ou que la population cellulaire est rare. Pour s’assurer que les paramètres sont bien définis, fluorophore- embryons frères et sœurs doivent être préparés à côté de dessiner correctement les portes et ajuster les tensions laser (Figure supplémentaire 2). Si la population cellulaire cible est rare, recueillir plus de 25 000 événements. Avec 5−10 animaux digérés, on devrait être en mesure de recueillir des millions d’événements. Le nombre total de fluorophore+ cellules peut également être obtenu avec ces données. Il suffit de compter le nombre total de cellules dans l’échantillon à l’aide d’un hémocytomètre et de multiplier le pourcentage de fluorophore+ cellules pour obtenir le nombre absolu de fluorophore+ cellules par poisson.

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Résultats

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Pour énumérer les globules rouges dans le poisson zèbre embryonnaire, lcr:GFP16 embryons ont été injectés au stade d’une cellule avec PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, ou 7,0 ng/nL ism1 MO avec 7,0 ng ism1 mRNA12. À 48 hpf ils ont été digérés et soumis à l’analyse de cytométrie de flux. Après avoir analysé le pourcentage de GFP+ globules rouges de chaque échantillon (chaque échantillon est de 5 embryons c...

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Discussion

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Le poisson zèbre est un excellent système modèle pour étudier l’hématopoïèse vertébrée primitive et définitive. Au cours des dernières décennies, de multiples essais ont été développés et affinés, permettant au poisson zèbre de devenir un modèle rapide et économique pour tester des médicaments, générer et tester des mutants génétiques, et dans l’ensemble permettant aux chercheurs d’analyser les voies moléculaires essentielles à l’hématopoïèse. Ce protocole utilise le poisson zèbre embryonnaire qui permet la collecte rapi...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L.S. est un consultant scientifique et a reçu une compensation de Finless Foods, Inc. et Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. ne déclare aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le financement a été fourni par les National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 à D.L.S.), la National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 à D.L.S.), et du Programme d’honneur à l’Université d’État de Californie Chico (à K.F.R.). Les auteurs remercient Betsey Tamietti pour la gestion de laboratoire et Kathy Johns pour leur assistance administrative.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube MCF de 1,5 mlFisherBrand05-408-129
Boîte de Pétri en polystyrène 10 mmCorning Falcon 351008
5 ml Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépineCorning Falcon352235
BD FACSAria Fusion Cytomètreen flux BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich
646563 DPBS (10x) avec Ca2+ et Mg2+Life Technologies14080-055
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
LibreaseRoche Sigma-Aldrich5401119001dissociation protéase
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001déchorionation protéase
SYTOX Red Dead Cell StainInvitrogen  ;Réf. S34859

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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