Article de méthode

Quantifier les particules humaines de norovirus ressemblant à un virus se liant aux bactéries commensales utilisant la cytométrie des débits

DOI :

10.3791/61048

⸱

29 avril 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de ce protocole est de quantifier la liaison du norovirus humain d’agent pathogène eucaryote aux bactéries. Après avoir effectué un premier essai d’attachement de virus-bactérie, la cytométrie d’écoulement est employée pour détecter des bactéries virales-liées dans la population.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les bactéries commensales sont bien établies pour avoir un impact sur l’infection des virus eucaryotes. La liaison directe entre l’agent pathogène et le microbiome hôte est responsable de la modification de l’infection pour bon nombre de ces virus. Ainsi, la caractérisation de la nature de la liaison virus-bactéries est une étape fondamentale nécessaire pour élucider le mécanisme (s) par lequel les bactéries modifient l’infection virale. Pour le norovirus humain, les bactéries commensales améliorent l’infection de cellules B. Le virus se lie directement à ces bactéries, ce qui indique que cette interaction directe est impliquée dans le mécanisme d’amélioration de l’infection. Une variété de techniques peuvent être utilisées pour quantifier les interactions entre les bactéries et les virus, y compris le comptage de scintillation des virus radiolacés et la réaction en chaîne de polymérase (PCR). Les deux méthodes nécessitent l’utilisation du virus vivant, qui peut devoir être généré en laboratoire. À l’heure actuelle, aucun des systèmes de culture in vitro établis disponibles pour le norovirus humain n’est suffisamment robuste pour permettre la production de stocks viraux hautement concentrés. Au lieu du virus vivant, des particules virales (VVL) ont été utilisées pour caractériser les interactions entre le norovirus et les bactéries. Ici, une méthode de cytométrie de flux est décrite avec des anticorps spécifiques au virus pour quantifier la liaison VLP aux bactéries gram-négatives et gram-positives. L’inclusion des deux bactéries seulement et des contrôles d’isotype a permis l’optimisation de l’essai pour réduire la liaison d’anticorps de fond et la quantification précise de l’attachement de VLP aux bactéries testées. Les rapports élevés de VLP:bactérie ont comme conséquence des VVL se liant aux pourcentages importants de la population bactérienne. Cependant, lorsque les quantités de VLP sont diminuées, le pourcentage de bactéries liées diminue également. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée dans de futures expériences élucidant les conditions spécifiques et les composants structurels qui régulent le norovirus : les interactions bactériennes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les norovirus humains (VHS) sont la principale cause de maladie gastro-intestinale dans le monde, responsable de 685 millions d’infections et de plus de 200 000 décès chaque année1. Comme avec d’autres virus entériques, la présence de bactéries commensales a été montré pour améliorer l’infection de cet agent pathogène ainsi que son virus de substitution, le norovirus murine2,3. Il ya aussi des rapports contradictoires que les bactéries peuvent inhiber l’infection par le norovirus humain4,5,6. Pour plusieurs virus, l’interaction directe entre le virus et les bactéries semblent sous-tendre les mécanismes qui ont un impact sur l’infection virale2,7,8,9,10, et il a été démontré par microscopie électronique que les norovirus humains se lient directement aux surfaces des bactéries11,12. Par conséquent, la caractérisation de ces interactions est devenue essentielle pour déterminer les mécanismes par lesquels les bactéries ont un impact sur l’infection virale. Cette caractérisation a classiquement commencé avec la quantification de la liaison virale à un tableau d’espèces bactériennes qui sont des composants du microbiome hôte7,12,13. Ces essais d’attachement révèlent non seulement la quantité de virus lié aux bactéries, mais aident également à déterminer l’impact de cette interaction sur la forme physique virale et la survie.

Pour quantifier l’attachement viral, les méthodes traditionnellement utilisées comprennent des essais basés sur pcR qui quantifient les génomes viraux12 ou la génération de virus radiolacés et l’utilisation de scintillation comptant pour quantifier les particules virales7,8,9,13. L’utilisation de ces méthodes nécessite généralement l’accès à des stocks de virus à haute teneur en particules et à des techniques de culture in vitro pour les générer. Alors que plusieurs systèmes de culture pour le norovirus humain existent maintenant2,14,15, aucun ne supporte la réplication robuste nécessaire pour générer ces stocks très concentrés qui restreint ou élimine l’utilisation de PCR et scintillation compter pour quantifier les norovirus humains / interactions bactériennes.

Pour contourner ce problème, les particules virales (VVL) peuvent être utilisées comme substitut au virus vivant pour étudier les interactions entre le norovirus humain et les bactéries16,17. Les VVL sont des particules non infectieuses qui ressemblent étroitement au virus d’où elles sont dérivées. Dans le cas du norovirus humain, ces particules sont générées à partir de l’expression de la protéine VP1 (et parfois du VP2), qui s’assemble pour créer des capsids viraux intacts dépourvus de matériel génétique (c.-à-d. ARN pour les norovirus). Ces VP ont été bien caractérisés, sont structurellement et antigéniquement similaires aux virus de type sauvage à partir de laquelle ils sont dérivés18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les VJR servent de substitut idéal pour étudier les interactions de surface entre le norovirus humain et les bactéries commensales. Étant donné que les VVL ne disposent pas de matériel génétique, les essais à base de PCR ne peuvent pas être utilisés pour quantifier la liaison virale. Une méthode de cytométrie de flux à base d’anticorps a été précédemment décrite et capable de détecter de faibles niveaux de liaison VLP aux bactéries d’une manière semi-quantitative16. Cette méthode a été optimisée pour permettre une quantification précise de la liaison humaine de norovirus VLP à la fois gram-négative et gram-positive bactéries commensales16.

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Protocole

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REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne décrites dans le protocole sont des conditions de culture standard pour le cloacae d’Enterobacter et le gasseri de Lactobacillus. Pour effectuer le virus : l’analyse d’attachement des bactéries avec d’autres espèces bactériennes, les bactéries choisies doivent être cultivées dans des conditions standard appropriées à la bactérie.

1. Préparation du milieu de croissance bactérienne

  1. Médias de croissance de cloacae enterobacter
    1. Préparer le milieu liquide en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 1 L d’eau déionisée (DI) (voir Tableau des matériaux). Mélanger tous les médias à fond et stériliser en autoclaving pendant 30 min.
    2. Préparer le milieu solide en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 15 g d’agar dans 1 L d’eau DI. Mélanger tous les médias à fond et stériliser en autoclaving pendant 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri médias de croissance
    1. Préparer le milieu liquide en dissolvant 55 g de poudre De Man, Rogosa et Sharpe (MRS; voir Tableau des matériaux)dans 1 L d’eau DI. Utilisez le milieu dans un mois suivant la préparation. Pour stériliser, chauffer à feu moyen pendant 15 minutes jusqu’à ébullition suivi d’autoclaving pendant 15 min.
    2. Préparer le milieu solide en dissolvant 55 g de poudre de MRS et 15 g d’agar dans 1 L d’eau DI. Pour stériliser, chauffer à feu moyen pendant 15 minutes jusqu’à ébullition suivi d’autoclaving pendant 15 min.

2. Établir une courbe standard corréléssant la densité optique (OD) et la concentration de bactéries

  1. Inoculer 5 ml de milieu liquide approprié avec une colonie isolée simple d’une plaque d’agar (E. cloacae) ou directement à partir du stock de glycérol congelé (L. gasseri).
  2. Cultivez la bactérie pendant la nuit, dans des conditions atmosphériques appropriées (Cloacae Enterobacter: 37 oC avec secousse aérobie à 200 tr/min; L. gasseri: bain d’eau à 37 oC sans secousses dans un récipient hermétique).
  3. Transférer 2 aliquots de 1,3 mL de culture de nuit en deux tubes de centrifugeuses distincts de 1,5 ml et bactéries centrifugeuses à 10 000 x g pendant 5 min.
  4. Retirer les échantillons supernatants et laver avec 1 ml de saline tamponnée stérile de 1x de phosphate (PBS). Répétez cette étape de lavage pour un total de 2 lavages.
  5. Centrifugez à nouveau les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min, retirez le supernatant et la résuspendance dans 1,3 mL de 1x PBS stérile.
  6. Commençant par 0.5 mL de culture lavée, diluez en série les bactéries dans 1x PBS de 10-1 à 10-4.
  7. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de la culture lavée et non diluée et chacune des quatre dilutions à 600 nm (OD600).
  8. Effectuez des dilutions en série 10 fois en 1x PBS pour chaque dilution de l’étape 2.6. Étendre la plaque 100 L des 3 dernières dilutions pour chaque série sur le milieu solide approprié pour déterminer le nombre d’unités de formation de colonies par millilitre (CFU/mL) de chaque échantillon. Plaquez chaque dilution en triplicate.
  9. Laisser sécher les plaques à température ambiante pendant 5 min. Inverser les plaques et incuber dans les conditions atmosphériques appropriées (E. cloacae: aérobic à 37 oC, plaques d’incubation toute la nuit; L. gasseri: anaérobie à 37 oC, plaques d’incubation pour 48 h dans un contenant hermétique avec des sachets d’air anérobie (voir Tableau des matériaux)).
    REMARQUE : Utilisez 1 sachet d’air anaérobie par pot de 2,5 L ou 3 sachets par pot de 7,0 L (voir Tableau des matériaux).
  10. Utilisez le nombre de plaques pour déterminer CFU/mL pour chacun des 5 échantillons (c.-à-d., non dilué, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Générer une courbe standard comparant OD600 vs CFU/mL. L’équation de cette ligne sera utilisée dans les essais d’attachement VLP-bactéries pour déterminer CFU/ mL basé sur OD600.

3. VLP-bactéries Attachement Assay

CAUTION : Les VLP de norovirus humain sont un risque de biosécurité (BSL)-2 et tous les travaux impliquant des VVL doivent être exécutés dans une armoire de biosécurité. La préparation des cultures bactériennes, avant l’analyse d’attachement, doit être effectuée en utilisant des conditions de sécurité appropriées pour l’organisme.

  1. Préparation de réactif
    1. 1x phosphate tamponné salin (PBS)
      1. Préparer 1 L de 10x PBS en dissolvant un paquet entier dans 1 L d’eau DI.
      2. Solution Autoclave pour 30 min.
      3. Préparer une solution 1x en dilant la solution ci-dessus 1:10 dans l’eau DI.
      4. Filtrer stériliser la solution en la passant à travers un filtre de 0,22 m et le stocker à température ambiante.
    2. 5% BSA
      1. Ajouter 5 g de poudre d’albumine de sérum bovin (BSA) à 100 ml de PBS pour générer une solution de 5 % (w/v).
      2. Mélanger la solution en vortexing ou sur une plaque à remuer à l’aide d’une barre de remuer en métal jusqu’à ce que les touffes se soient dissous.
      3. Filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
      4. Conservez la solution à 4 oC.
    3. Tampon de tache de cytométrie d’écoulement (FCSB)
      1. Filtre acheté FCSB (voir Tableau des matériaux) à travers un filtre de 0,22 m.
      2. Conserver la solution restante à 4 oC.
    4. 5% Tampon de blocage (BB)
      REMARQUE : Préparez-vous frais à chaque fois.
      1. Ajouter 0,5 g de BSA à 10 ml de FCSB stérile.
      2. Vortex pour mélanger complètement l’échantillon et laisser sur la glace jusqu’à l’utilisation.
  2. Conjugaison d’anticorps
    1. Anticorps gastro-intestins humains conjugués (voir Tableau des matériaux)avec r-phycoerythrine (PE) à l’aide d’un kit d’étiquetage des anticorps R-PE selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
    2. Conservez l’anticorps conjugué dans l’obscurité à 4 oC pour une utilisation future dans l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d
      REMARQUE : L’anticorps primaire doit être titré avant utilisation dans l’essai d’attachement de VLP-bactéries pour déterminer la concentration appropriée nécessaire pour l’analyse de cytométrie d’écoulement. La titration d’anticorps doit être effectuée chaque fois que la réaction de conjugaison est effectuée et pour chaque bactérie utilisée dans l’essai d’attachement.
  3. Titration d’anticorps
    1. Diluer l’anticorps anti-humain conjugué GII 100 fois, avec une dilution de départ de 1:100 et une dilution de fin de 1:600 (six dilutions au total).
    2. Effectuez un essai de fixation du virus tel que décrit ci-dessous à l’exception suivante : dans l’étape 3.5.7 résumance la granule bactérienne dans 350 'L de 5% BB.
    3. Diviser l’échantillon en sept aliquots de 50 L.
    4. Ajouter 50 l de chaque dilution d’anticorps dans un tube.
    5. Ajoutez 50 L de 5% de BB au septième tube comme contrôle non souillé.
    6. Effectuez la cytométrie d’écoulement sur tous les échantillons décrits ci-dessous.
    7. Comparez les échantillons d’anticorps dilués aux commandes non contaminées et les uns aux autres. La concentration d’anticorps la plus faible qui n’entraîne pas une diminution ou une perte de signal positif doit être choisie pour être utilisée dans les essais suivants.
  4. Préparation des bactéries
    1. Cultivez les bactéries en 40 ml de milieu liquide approprié dans des conditions atmosphériques appropriées jusqu’à ce que les bactéries soient en phase stationnaire.
      1. Cultivez les cultures E. cloacae aérobie pendant la nuit à Luria Broth à 37 oC, secouant à 200 tr/min pour atteindre la phase stationnaire.
      2. Cultivez les cultures L. gasseri dans le bouillon de MRS dans des tubes à vis noir sans trembler dans un bain d’eau réglé à 37 oC pendant 18 h pour atteindre la phase stationnaire.
    2. Transférer les cultures de phase stationnaire pour nettoyer les tubes coniques et les échantillons de centrifugeuses de 50 ml à 2 288 x g pendant 10 min pour pelleter la bactérie.
    3. Retirez le supernatant et la résuspendance dans 13 ml de PBS stérile 1x. Répétez cette étape de lavage pour un total de deux lavages.
    4. Centrifugez à nouveau les échantillons, retirez les échantillons supernatants et résutilisons dans 20 ml de PBS 1x.
      REMARQUE : Si la boulette cellulaire est petite, le volume de résuspension peut être diminué.
    5. Mesurer l’OD600 de la culture.
    6. À l’aide de la courbe standard préparée précédemment, déterminez l’UMC par ml de la culture lavée.
    7. Diluer les bactéries au besoin avec 1x PBS pour ajuster la concentration de la culture à 1 x 108 CFU/mL.
    8. Transférer 1 ml de la culture bactérienne 1 x10 8 CFU/mL au nombre requis de tubes de centrifugeuse de 1,5 mL.
    9. Centrifuge les tubes à 10.000 x g pendant 5 min.
    10. Résuspendez la granule bactérienne dans 1 ml de sterile 5% BSA.
    11. Incuber les tubes pendant 1 h à 37 oC avec rotation constante.
  5. Pièce jointe au virus
    1. Travailler à l’intérieur d’une armoire de biosécurité BSL-2, ajouter 10 g de RLP HuNoV (voir Tableau des matériaux) à chaque tube contenant des bactéries résiliées dans PBS et mélanger à fond par tuyauterie.
      REMARQUE : La concentration de VLP diffère avec chaque préparation VLP. Par conséquent, le volume ajouté aux bactéries varie d’un lot de préparation à l’autre et doit être ajusté en conséquence afin que 10 g soient ajoutés à chaque tube de l’expérience. Pour les bactéries ne contrôlent que les bactéries (p. ex., les échantillons sans VLP), ajoutez un volume de PBS qui équivaut au volume de VLP ajouté aux échantillons expérimentaux.
    2. Tubes incubés pour 1 h à 37 oC avec rotation constante.
      REMARQUE : Un revolver à tube (voir tableau des matériaux) réglé à 40 tr/min est utilisé pendant l’incubation.
    3. Après l’incubation, centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
    4. Jeter les granulés bactériens supernatants et résutilisables dans 1 ml de PBS.
    5. Répétez les étapes de lavage 3.5.3 et 3.5.4.
    6. Centrifuge les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    7. Jetez les granules bactériennes supernatants et résutilisables dans 150 L de 5 % DE BB.
  6. Coloration d’anticorps
    1. Préparer frais 5% BB.
      REMARQUE : Tous les travaux à l’aide de l’anticorps marqué fluorescent doivent être exécutés dans l’obscurité et l’anticorps, le BB et le FCSB doivent être conservés sur la glace.
    2. Diluer l’anticorps gastro-intestinal humain dilué 1:125 pour les échantillons de cloacae E. et 1:150 pour les échantillons de gazeri de L. dans 5% BB, préparant 50 l d’anticorps dilué par échantillon.
    3. Diluer l’anticorps isotype de la même manière que l’anticorps gastro-intestinal de norovirus humain a été dilué pour chaque bactérie dans 5% BB, préparant 50 l de contrôle dilué d’isotype par échantillon.
    4. Répartir chaque échantillon d’analyse d’attache de l’étape 3.3.7 en trois aliquots de 50 L en les transférant dans des tubes de centrifugeuse propres de 1,5 mL.
    5. Pour la première série d’échantillons, ajouter 50 L de BB. Cet ensemble sera le non-détenu (Uns) contrôles.
    6. Au deuxième set, ajouter 50 L de dilution des anticorps GII. Il en résulte une concentration finale d’anticorps de 1:250 pour E. cloacae et 1:300 pour L. gasseri. Cet ensemble d’échantillons sera les échantillons tachés (AB).
    7. Au troisième set, ajoutez 50 l d’anticorps isotype dilué. Cet ensemble sera le contrôle de l’isotype (IC). Bien mélanger en tuyautant. Incuber les échantillons sur la glace et dans l’obscurité pendant 30 min.
    8. Centrifuger tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    9. Jetez le supernatant et réutilisez les échantillons dans 100 L de FCSB.
    10. Centrifuge tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ressinner les échantillons dans 100 L de FCSB.
    11. Centrifuger tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    12. Jetez le supernatant et réutilisez les échantillons dans 150 L de FCSB.
    13. Transférer chaque échantillon dans un tube FCSB contenant 400 l de tampon FCSB pour un volume total de 550 ll.
    14. Conserver les échantillons à 4 oC jusqu’à ce qu’ils soient analysés par cytométrie d’écoulement.
      REMARQUE : La cytométrie d’écoulement est exécutée dans un rayon de 4 h de coloration d’anticorps.

4. Cytométrie d’écoulement

REMARQUE : Les paramètres de tension décrits ci-dessous sont basés sur le cytomètre de débit et le logiciel énumérés dans le tableau des matériaux et varieront probablement avec différents cytomètres de débit. Les paramètres doivent être optimisés pour chaque bactérie. Assurez-vous que les axes pour tous les graphiques sont en phase biexponentielle.

  1. Mise en place de l’espace de travail
    REMARQUE : La configuration des parcelles utilisées pour établir l’espace de travail diffère de celle utilisée dans l’analyse des données et du gating. Le but de la mise en place de l’espace de travail est de visualiser la population cellulaire, de s’assurer qu’il n’y a pas d’agglomération excessive des cellules bactériennes qui pourraient avoir un impact sur l’analyse en aval et de distinguer entre les cellules tachées et non contaminées pendant la collecte de données.
    1. Afin de s’assurer que les bactéries ne s’agglutinent pas, mettez en place une série de parcelles de densité.
      1. Générer une zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) par rapport à la zone de dispersion latérale (SSC-A) pour visualiser la population totale.
      2. Configurez des parcelles pour évaluer les cellules simples par rapport aux amas cellulaires en créant deux graphiques qui comparent à la fois la largeur vers l’avant (FSC-W) et la largeur de dispersion latérale (SSC-W) pour avancer (FSC-H) et la hauteur de dispersion latérale (SSC-H), respectivement.
      3. Créez une parcelle qui ne montre que la population positive PE (PE-A vs SSC-A).
    2. Définissez la tension de base à 500 pour E. cloacae et 340 pour L. gasseri. Ceux-ci seront ajustés plus tard.
    3. Définissez le total des événements comptés à 10 000 événements.
  2. Échantillons en cours d’exécution
    1. Créez trois parcelles histogrammes distinctes qui montrent le nombre tracé contre SSC-A, FSC-A ou PE-A.
    2. Placez un échantillon non souillé sur le cytomètre de débit et acquérez les événements de l’échantillon, en veillant à ce que le pic maximum sur l’histogramme pour SSC-A soit dans les 102 à 103 et le pic maximum sur l’histogramme pour FSC-A est entre 104 à 105 sur l’axe x. Si ce n’est pas le cas, les pics ne se situent pas dans les plages spécifiées, ajustez les tensions FSC et SSC en conséquence.
    3. Placez un échantillon taché (AB) sur le cytomètre d’écoulement et ajustez le PE de tension pour faire le pic maximum passé 103 sur l’axe x.
    4. Sur la base de ces mesures, définissez la porte PE positive et placez la porte sur le graphique de densité PE-A par rapport à SSC-A.
    5. Exécuter tous les échantillons sous les paramètres déterminés à basse ou moyenne vitesse.

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Résultats

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Les stratégies de gating utilisées pour quantifier la liaison humaine de norovirus VLP aux bactéries commensales sont montrées dans la figure 1. Le point de densité représentatif donne un aperçu de la façon dont les échantillons ont été fermés pour éliminer les débris cellulaires et les amas cellulaires afin que l’attachement VLP a été déterminé sur les populations de singlet(figure 1A). Les histogrammes représen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité de quantifier la liaison des virus entériques aux bactéries est une première étape cruciale pour élucider les mécanismes par lesquels ces bactéries modifient l’infection virale. Les méthodes décrites ici ont été optimisées pour mesurer les interactions humaines norovirus VLP avec E. cloacae (bactérie gram-négative) et L. gasseri (une bactérie gram-positive), mais peuvent être adaptées pour une utilisation avec n’importe quel virus de mammifères et bactérie d’...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Sutonuka Bhar et Chanel Mosby-Haundrup pour leur examen critique du manuscrit écrit, ainsi que Alfonso Carrillo pour l’aide à générer des courbes bactériennes standard. Ces travaux sont financés en partie par une subvention du National Institute of Health (R21AI140012) et par une subvention de semences de l’Université de Floride, Institute of Food and Agricultural Sciences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à fond rond en polystène de 5 ml avec capuchon de filtre cellulaireCorning352235Après la coloration des anticorps, l’échantillon est transféré dans des tubes pour une analyse par cytométrie en flux.
AgarSigmaA7002Utilisé pour la préparation des milieux
AnaeroPackThermo ScientificR681001Bloc de gaz anaérobie utilisé pour la culture de Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa Cytomètre
Albumine sérique bovineFisher BioréactifsBP1605Utilisé pour la cytométrie en flux
Tampon de coloration par cytométrie en flux (FCSB)BD Biosciences554657Utilisé pour le
contrôle des isotypes IgG2b kappa de la souris (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281Contrôle des isotypes. Cet anticorps est acheté sous forme conjuguée auprès du fabricant.
MRS PowderBD Biosciences288130Utilisé pour la préparation des milieux et pour la culture de Lactobacillus gasseri.
Anticorps monoclonal G2 de la capside du norovirus (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241. Cet anticorps n’est disponible que sous forme non conjuguée et doit donc être conjugué par fluorescence avant d’être utilisé dans les tests de cytométrie en flux décrits. Dans ce protocole, le PE a été choisi comme fluor, cependant, d’autres molécules fluorescentes peuvent être choisies comme étant les mieux adaptées au cytomètre en flux utilisé par le chercheur.
Norovirus GII.4 VLPBiostructure créativeCBS-V700norovirus humain comme particule, les VLP ont été générés à l’aide du système baculovirus et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 10 % de glycérol. Les auteurs ont effectué une analyse indépendante de suivi par nanovisée pour déterminer la concentration de particules des VLP. La concentration est d’environ 1011 VLP par millilitre. D’après la concentration en protéines des VLP, environ 200 particules sont ajoutées par bactérie dans les essais de fixation des VLP.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Diluer à 1X avant utilisation.
SiteClick R-PE Kit de marquage d’anticorpsThermo Fisher ScientificS10467Kit de conjugaison utilisé pour l’étiquetage des anticorps non conjugués.
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271Utilisé pour la préparation des milieux
TryptoneOxoidLP0042Utilisé pour la préparation des milieux
Revolverà tube ThermoFisher Scientific88881001Utilisé dans le test de fixation virus :bactérie. Réglez sur la vitesse maximale (40 tr/min).
Extrait de levureBD Biosciences212750Utilisé pour la préparation des milieux
en fluxAnticorps anti-norovirus GII

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017(2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699(2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559(2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768(2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009(2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659(2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607(2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586(2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

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