Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Summary

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Abstract

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans l’éradication du virus de la variole (VARV), l’agent causatif de la variole, de la nature. Depuis sa première utilisation comme vaccin, vaCV a été développé comme vecteur de vaccins thérapeutiques et de virus oncolytique. Ces applications tirent parti du génome facilement manipulé de VACV et de la large gamme d’hôtes comme plate-forme exceptionnelle pour générer des virus recombinés avec une variété d’applications thérapeutiques. Plusieurs méthodes ont été développées pour générer des VACV recombinés, y compris des méthodes de sélection de marqueurs et une sélection dominante transitoire. Ici, nous présentons un raffinement d’une méthode de sélection de gamme d’hôtes couplée à l’identification visuelle des virus recombinants. Notre méthode tire parti de la pression sélective générée par la protéine antivirale hôte kinase R (PKR) couplée à un gène de fusion fluorescent exprimant mCherry-tagged E3L, l’un des deux antagonistes VACV PKR. La cassette, y compris le gène d’intérêt et la fusion mCherry-E3L, est flanquée de séquences dérivées du génome du VACV. Entre le gène d’intérêt et mCherry-E3L est une région plus petite qui est identique aux premiers nucléotides de 150 pouces du bras 3', pour favoriser la recombinaison et la perte homologues du gène mCherry-E3L après sélection. Nous démontrons que cette méthode permet une génération efficace et transparente de vruvure dans une variété de types de cellules sans nécessiter la sélection de médicaments ou un dépistage approfondi des virus mutants.

Introduction

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans la première éradication réussie d’un agent pathogène humain, le virus de la variole (VARV), de la nature. Depuis l’extermination du virus de la variole, les virus du vaxovirus, y compris le VVC, continuent d’être des virus thérapeutiques utiles pour la médecine humaine et animale. Par exemple, un vaccin contre le virus de la rage à base de VGRI a été très efficace pour prévenir la transmission de la rage sylvatique en Europe¹ et aux États-Unis². Plus récemment, les poxvirus recombinés exprimant une variété de molécules antitumorales (p. ex., anticorps à chaîne uniq....

Protocol

1. Générer le vecteur de recombinaison

1. Amorce de conception pour générer la cassette de sélection. Concevez chaque amplicon individuel avec des séquences qui se chevauchent avec les amplicons voisins et le vecteur pour faciliter l’assemblage enzymatique isothermal des molécules d’ADN, également appelé assemblage Gibson, en utilisant l’un des outils de conception d’apprêt en ligne plusieurs.
   REMARQUE : Ce protocole peut également être complété à l’aide de méthodes traditionnelles de clonage à base d’endonuclease de restriction. Dans ce cas, concevez des amorces avec les sites de restriction appropriés plutôt qu’avec des séquences qui se chevauchent.
....

Results

Nous avons utilisé la procédure diagrammed dans la figure 1 pour générer un VACV manquant à la fois PKR antagonistes E3L et K3L, en remplaçant E3L par EGFP dans un virus déjà supprimé pour K3L (vP872). La figure 2 montre des plaques fluorescentes rouges dans les cellules RK13 compétentes de PKR indicatifs de l’expression virale de mCherry-E3L, ainsi que l’EGFP exprimées dans les cellules RK13-E3L-K3L confirmant la perte de l’E3L et l’effondrement du marqueur de .......

Discussion

Ici, nous présentons une variation d’une stratégie transitoire de sélection des marqueurs ³² pour générer des virus vaccinia recombinants sans retenir l’ADN étranger dans le virus recombinant final. Notre stratégie utilise une pression sélective négociée par la protéine antivirale hôte PKR plutôt que d’autres formes de pression sélective comme les antibiotiques. L’utilisation de gènes antiviraux hôtes élimine la possibilité de changements phénotypiques induits chimiquement dans les cellules, ou un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Polymérase haute fidélité utilisée en PCR
Ampicilline	ThermoFisher Scientific	11593027	Agent sélectif bactérien
Grattoir de cellules jetables	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Grattoir de cellules pour récolter les cellules infectées
EVOS FL Auto 2 Système d’imagerie cellulaire	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscope fluorescent
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Réactif de transfection
Luria Bertani (LB) Bouillon	Gibco	10855021	Milieu de croissance bactérienne
Monarch DNA kit	d’extraction de gelNEB	T1020L	Kit de purification de gel utilisé pour purifier les amplicons et les vecteurs linéarisés
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010L	Miniprep utilisé pour purifier les plasmides
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotomètre utilisé pour mesurer la concentration d’ARN et d’ADN
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Kit d’assemblage enzymatique isotherme utilisé pour générer le vecteur de recombinaison
Q500 Sonicateur	Qsonica	Q500-110	Sonicateur pour lysats de virus
Cellules RK13	ATCC	CCL-37	Cellules rénales de lapin
VWR Multiwell Plaques de culture cellulaire VWR		10062-892	Plaques de culture cellulaire