Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

Yelena Levin; Keyur Talsania; Bao Tran; Jyoti Shetty; Yongmei Zhao; Monika Mehta

doi:10.3791/61060

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

11.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/61060

⸱

8 juin 2020

Yelena Levin^*¹ , Keyur Talsania^*¹^,² , Bao Tran¹ , Jyoti Shetty¹ , Yongmei Zhao¹^,² , Monika Mehta¹

¹NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, ²Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette méthode décrit les étapes pour améliorer la qualité et la quantité de données de séquence qui peuvent être obtenues à partir d’échantillons d’ARN formalin-fixes paraffin-embedded (FFPE). Nous décrivons la méthodologie pour évaluer plus précisément la qualité des échantillons FFPE-ARN, préparer des bibliothèques de séquençage et analyser les données des échantillons FFPE-ARN.

Résumé

L’analyse de l’expression génique par séquençage de l’ARN (ARN-seq) permet un aperçu unique des échantillons cliniques qui peuvent potentiellement mener à une compréhension mécaniste de la base de diverses maladies ainsi que des mécanismes de résistance et/ou de susceptibilité. Cependant, les tissus ffPE, qui représentent la méthode la plus commune pour préserver la morphologie des tissus dans les spécimens cliniques, ne sont pas les meilleures sources pour l’analyse de profilage d’expression génique. L’ARN obtenu à partir de tels échantillons est souvent dégradé, fragmenté et chimiquement modifié, ce qui conduit à des bibliothèques de séquençage sous-optimales. À leur tour, ceux-ci génèrent des données de séquence de mauvaise qualité qui peuvent ne pas être fiables pour l’analyse de l’expression des gènes et la découverte de la mutation. Afin de tirer le meilleur parti des échantillons de la FFPE et d’obtenir les meilleures données possibles à partir d’échantillons de mauvaise qualité, il est important de prendre certaines précautions tout en planifiant la conception expérimentale, en préparant les bibliothèques de séquençage et lors de l’analyse des données. Cela comprend l’utilisation de mesures appropriées pour un contrôle précis de la qualité de l’échantillon (QC), l’identification des meilleures méthodes pour diverses étapes au cours de la génération de bibliothèque de séquençage, et la bibliothèque soigneuse QC. En outre, l’application d’outils logiciels et de paramètres corrects pour l’analyse des données de séquence est essentielle afin d’identifier les artefacts dans les données ARN-seq, filtrer la contamination et les lectures de faible qualité, évaluer l’uniformité de la couverture génétique et mesurer la reproductibilité des profils d’expression génique parmi les répliques biologiques. Ces étapes peuvent assurer une grande précision et une reproductibilité pour le profilage d’échantillons d’ARN très hétérogènes. Ici, nous décrivons les différentes étapes pour l’échantillon QC, la préparation de bibliothèque et QC, le séquençage, et l’analyse de données qui peuvent aider à augmenter la quantité de données utiles obtenues à partir de l’ARN de mauvaise qualité, comme celui obtenu à partir de tissus FFPE-ARN.

Introduction

L’utilisation d’approches de séquençage de nouvelle génération nous a permis de glaner une mine d’informations provenant de divers types d’échantillons. Cependant, les échantillons anciens et mal conservés restent inapplicables pour les méthodes couramment utilisées pour générer des données de séquence et nécessitent souvent des modifications à des protocoles bien établis. Les tissus FFPE représentent un tel type d’échantillon qui a été largement utilisé pour les spécimens cliniques¹^,²^,³. Tandis que la préservation de FFPE maintient la morphologie de tissu, les acides nucléiq....