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Article de méthode

Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

11.8K vues

DOI :

10.3791/61060

8 juin 2020

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette méthode décrit les étapes pour améliorer la qualité et la quantité de données de séquence qui peuvent être obtenues à partir d’échantillons d’ARN formalin-fixes paraffin-embedded (FFPE). Nous décrivons la méthodologie pour évaluer plus précisément la qualité des échantillons FFPE-ARN, préparer des bibliothèques de séquençage et analyser les données des échantillons FFPE-ARN.

Résumé

L’analyse de l’expression génique par séquençage de l’ARN (ARN-seq) permet un aperçu unique des échantillons cliniques qui peuvent potentiellement mener à une compréhension mécaniste de la base de diverses maladies ainsi que des mécanismes de résistance et/ou de susceptibilité. Cependant, les tissus ffPE, qui représentent la méthode la plus commune pour préserver la morphologie des tissus dans les spécimens cliniques, ne sont pas les meilleures sources pour l’analyse de profilage d’expression génique. L’ARN obtenu à partir de tels échantillons est souvent dégradé, fragmenté et chimiquement modifié, ce qui conduit à des bibliothèques de séquençage sous-optimales. À leur tour, ceux-ci génèrent des données de séquence de mauvaise qualité qui peuvent ne pas être fiables pour l’analyse de l’expression des gènes et la découverte de la mutation. Afin de tirer le meilleur parti des échantillons de la FFPE et d’obtenir les meilleures données possibles à partir d’échantillons de mauvaise qualité, il est important de prendre certaines précautions tout en planifiant la conception expérimentale, en préparant les bibliothèques de séquençage et lors de l’analyse des données. Cela comprend l’utilisation de mesures appropriées pour un contrôle précis de la qualité de l’échantillon (QC), l’identification des meilleures méthodes pour diverses étapes au cours de la génération de bibliothèque de séquençage, et la bibliothèque soigneuse QC. En outre, l’application d’outils logiciels et de paramètres corrects pour l’analyse des données de séquence est essentielle afin d’identifier les artefacts dans les données ARN-seq, filtrer la contamination et les lectures de faible qualité, évaluer l’uniformité de la couverture génétique et mesurer la reproductibilité des profils d’expression génique parmi les répliques biologiques. Ces étapes peuvent assurer une grande précision et une reproductibilité pour le profilage d’échantillons d’ARN très hétérogènes. Ici, nous décrivons les différentes étapes pour l’échantillon QC, la préparation de bibliothèque et QC, le séquençage, et l’analyse de données qui peuvent aider à augmenter la quantité de données utiles obtenues à partir de l’ARN de mauvaise qualité, comme celui obtenu à partir de tissus FFPE-ARN.

Introduction

L’utilisation d’approches de séquençage de nouvelle génération nous a permis de glaner une mine d’informations provenant de divers types d’échantillons. Cependant, les échantillons anciens et mal conservés restent inapplicables pour les méthodes couramment utilisées pour générer des données de séquence et nécessitent souvent des modifications à des protocoles bien établis. Les tissus FFPE représentent un tel type d’échantillon qui a été largement utilisé pour les spécimens cliniques1,2,3. Tandis que la préservation de FFPE maintient la morphologie de tissu, les acides nucléiq....

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Protocole

1. Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN

  1. Sélectionnez les échantillons FFPE selon des critères prédéfinis et extrayez l’ARN selon une méthode appropriée (p. ex., kit d’extraction d’acide FFPE-nuclei, Tableau des matériaux).
    REMARQUE: Il existe plusieurs méthodes différentes disponibles pour l’extraction FFPE-ARN, y compris les méthodes de microdissection plus récentes qui peuvent travailler avec très peu de tissu et d’extraire l’ARN de bonne qualité12,13,14.
  2. Il faut faire le plus grand soin de préserver l’intégrité de l’AR....

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Résultats

La méthodologie décrite ci-dessus a été appliquée à 67 échantillons de FFPE qui avaient été stockés dans une variété de conditions différentes pendant 7 à 32 ans (le délai médian d’entreposage de l’échantillon était de 17,5 ans). Le jeu de données et les résultats d’analyse présentés ici ont déjà été décrits et publiés dans Zhao et coll.11. En vérifiant la qualité de l’échantillon telle que décrite précédemment (c.-à-d. des traces par exemple dans la figure 2),le DV

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Discussion

La méthode décrite ici décrit les principales étapes nécessaires pour obtenir de bonnes données de séquence à partir d’échantillons FFPE-ARN. Les principaux points à considérer avec cette méthode sont les suivants : (1) Assurez-vous que l’ARN est conservé le mieux possible après l’extraction en minimisant les cycles de manipulation et de congélation et de décongélation de l’échantillon. Les aliquots de QC séparés sont très utiles. (2) Utilisez une mesure QC qui est la meilleure pour l’ensemble d’échantillons donné. Les v.......

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Déclarations de divulgation

Ces travaux ont été financés par le National Cancer Institute (NCI), les National Institutes of Health (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. est l’entrepreneur en opérations et en soutien technique du Laboratoire national de recherche sur le cancer de Frederick, qui est entièrement financé par les NIH. Plusieurs auteurs (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) sont affiliés à Leidos Biomedical Research, Inc., mais tous les auteurs sont entièrement financés par l’Institut national du cancer, y compris les salaires des auteurs et le matériel de recherche. Leidos Biomedical Research, Inc. n’a pas fourni de salaire aux auteurs (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) ou du matériel pour l’étude, ni dans la conception de l’étude, la collecte de données, l’analyse, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Remerciements

Nous remercions la Dre Danielle Carrick (Division de la lutte contre le cancer et des sciences de la population, Institut national du cancer) d’avoir continué à aider, en particulier pour le lancement de cette étude, pour nous fournir les échantillons et pour des suggestions utiles au cours de l’analyse des données. Nous remercions sincèrement tous les membres de l’installation de séquençage du CCR au Laboratoire national de recherche sur le cancer de Frederick pour leur aide pendant la préparation et le séquençage de l’échantillon, en particulier Brenda Ho pour l’aide dans l’échantillon QC, Oksana Allemand pour la bibliothèque QC, Tatyana Smirnova pour la gestion des....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2100 BioanalyseurAgilentG2939BA
Agilent DNA 7500 KitAgilent5067-1506
Kit ADN haute sensibilité Agilent5067-4626
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511
AllPrep DNA/RNA FFPE KitQiagen80234
CFX96 Touch SystemBio-Rad1855195
Library Quantification Kit v2-IlluminaKapaBiosystemsKK4824
NEBNext Ultra II Kit de préparation de bibliothèque d’ARN directionnel pour IlluminaNew England BiolabsE7765Shttps://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit
NEBNext Kit de déplétion de l’ARNr (Humain/Souris/Rat)Nouvelle-Angleterre BiolabsE6310L
NextSeq 500 Système de séquençageIlluminaSY-415-1001NextSeq 500 Guide du système : https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf
NextSeq PhiX Control KitIlluminaFC-110-3002
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)Illumina
10X Genomics Séparateur magnétique 10XGenomics120250
Rotateur MultimixeurVWR13916-822
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad
Kit de réactifs de séquençageIllumina20024907
Package de cellulesIllumina20024907
Cartouche tampon et cartouche de réactifIllumina20024907
Solution d’hydroxyde de sodium (0,2N)Millipore SigmaSX0607D-6
TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0Fisher Scientific50-151-871
20024907 1851197

Références

  1. Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
  2. Hedegaard, J., et al.

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

S quen age de l ARNContr le qualit des chantillonsPr paration de banquesAnalyse des donn esAnalyse en composantes principalesCriblage FastQCAlignement STARStatistiques RSeQCRapport Multi QC