Présenté ici est le protocole pour un test de chimiotaxis in situ, un dispositif microfluidique récemment développé qui permet des études du comportement microbien directement dans l’environnement.
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Article de méthode
Test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les comportements microbiens, tels que la motilité et la chimiotaxis (la capacité d’une cellule à modifier son mouvement en réponse à un gradient chimique), sont répandus dans les domaines bactérien et archéal. Les chimiotaxis peuvent se traduire par d’importants avantages d’acquisition de ressources dans des environnements hétérogènes. Il joue également un rôle crucial dans les interactions symbiotiques, les maladies et les processus mondiaux, tels que le cyclisme biogéochimique. Cependant, les techniques actuelles limitent la recherche de chimiotaxis au laboratoire et ne sont pas facilement applicables sur le terrain. Présenté ici est un protocole étape par étape pour le déploiement de l’essai in situ chemotaxis (ISCA), un dispositif qui permet un interrogatoire robuste de chimiotaxis microbienne directement dans l’environnement naturel. L’ISCA est un dispositif microfluidique composé d’un réseau de 20 puits, dans lequel les produits chimiques d’intérêt peuvent être chargés. Une fois déployés dans des environnements aqueux, les produits chimiques se diffusent hors des puits, créant des gradients de concentration auxquels les microbes sentent et réagissent en nageant dans les puits par le biais de chimiotaxis. Le contenu du puits peut ensuite être échantillonné et utilisé pour (1) quantifier la force des réponses chimiotaxiques à des composés spécifiques par cytométrie de flux, (2) isoler et la culture des micro-organismes sensibles, et (3) caractériser l’identité et le potentiel génomique des populations répondantes par des techniques moléculaires. L’ISCA est une plate-forme flexible qui peut être déployée dans n’importe quel système avec une phase aqueuse, y compris les milieux marins, d’eau douce et de sol.
Introduction
Divers micro-organismes utilisent la motilité et la chimiotaxis pour exploiter des environnements nutritifs irréguliers, trouver des hôtes, ou éviter les conditions délétères1,2,3. Ces comportements microbiens peuvent à leur tour influencer les taux de transformation chimique4 et favoriser des partenariats symbiotiques entre les écosystèmes terrestres, d’eau douce et marins2,5.
Chemotaxis a été largement étudié dans des conditions de laboratoire pour les 60 dernières....
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Protocole
Nous recommandons d’exécuter la section 1 avant les expériences sur le terrain afin d’optimiser les résultats.
1. Optimisation de laboratoire
REMARQUE : Les volumes décrits dans la procédure d’optimisation sont suffisants pour un seul ISCA (composé de 20 puits).
- Préparation du produit chimique d’intérêt
REMARQUE : La concentration optimale pour chaque chimioattractant doit souvent être déterminée dans des conditions de laboratoire avant les déploiements sur le terrain. Le champ de concentration chimique diminuera en magnitude avec la distance de la source (puits ISCA), ce qui signifie que la concentr....
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Résultats
Cette section présente les résultats de laboratoire utilisant l’ISCA pour tester la réponse chimiotaxique des microbes marins à une gamme de concentration de glutamine, un acide aminé connu pour attirer les bactéries du sol14. La concentration de glutamine qui a suscité la réponse chimiotactique la plus forte dans les essais de laboratoire a été employée pour effectuer un essai de chemotaxis dans l’environnement marin.
Pour effectuer les tests de laboratoire, les commun.......
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Discussion
À l’échelle des micro-organismes aquatiques, l’environnement est loin d’être homogène et se caractérise souvent par des gradients physiques/chimiques qui structurent les communautés microbiennes1,15. La capacité des micro-organismes motiles à utiliser le comportement (c.-à-d. la chimiotaxis) facilite la recherche de nourriture dans ces microenvironnements hétérogènes1. L’étude de la chimiotaxis directement dans l’environnement a le potenti.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Cette recherche a été financée en partie par la Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, par le biais de la subvention GBMF3801 à J.R.S. et R.S., et un prix d’enquêteur (GBMF3783) à R.S., ainsi qu’une bourse du Conseil australien de recherche (DE160100636) à J.B.R., un prix de la Fondation Simons à B.S.L. (594111), et une subvention de la Fondation Simons (542395) à R.S. dans le cadre des Principes microbiens des écosystèmes microbiens (PriME) Collaborative.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Colle acrylique | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Feuille acrylique | McMaster-Carr | 8505K725 | Ou autre entreprise |
| Ruban adhésif | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic |
| tape Autoclave | Systec | D-200 | Ou autre entreprise |
| Centrifugeuse de paillasse | Fisher Scientific | 75002451 | Ou autre entreprise |
| Cordon élastique | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Tube à centrifuger - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Tube Eppendorf |
| Tube à centrifuger conique - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Tube Falcon |
| Tube à centrifuger conique - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Tube Falcon |
| Bras de déploiement | Irwin | 1964719 | Ou une autre entreprise |
| Connecteur de boîtier de déploiement | Fisher Scientific | 21-236-4 | Voir les alternatives dans le manuscrit |
| Essuie-glaces jetables | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Cytometer Beckman | C09756 | CYTOFlex | |
| Glutaraldehyde 25 % | Sigma Aldrich | G5882 | Ou autre société |
| Colorant fluorescent vert | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Vert I - dilution finale 1:10 000 |
| Cartouche filtrante GP hydrophile - 0,2 & micro ; m | Merck | C3235 | Filtre Sterivex |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contacter les auteurs correspondants |
| Découpeuse laser | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Ou autre société |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Ou autre société |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon vis à tête plate fendue | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 & times ; 4 & times ; 8 mm |
| Set de pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | Ou d’une autre entreprise |
| Pointes de pipette - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Ou d’une autre entreprise |
| Pointes de pipette - 20 & micro ; L | Fisher Scientific | 21-236-4 | Ou une autre société |
| Pointes de pipette - 200 & micro ; L | Fisher Scientific | 21-236-1 | Ou une autre entreprise |
| Sel de mer Sigma Aldrich | S9883 | Pour l’eau de mer artificielle | |
| Pipette sérologique - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Ou une autre entreprise |
| Filtre à seringue - 0,02 & micro ; m | Whatman | WHA68091002 | Anatop filtre |
| seringue - 0.2 & micro ; m | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Seringue aiguille 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × ; 12 mm |
| Seringues - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Seringues - 10 mL | BD | 303134 | ou autre société |
| Seringues - 50 mL | BD | 15899152 | Ou autre société |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Ou autre entreprise |
| Rack de tube - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Ou autre entreprise |
| Robinet à usage général en acier rapide non revêtu | McMaster-Carr | 8305A77 | Ou autre société |
| Filtre à vide - 0.2 µ ; m | Filtre Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Références
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
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Réimpressions et autorisations
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