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Article de méthode

Un test de motilité planaire pour évaluer les propriétés biomodulantes des produits naturels

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DOI :

10.3791/61070

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30 mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Dans cet article

Résumé

La motilité planaire est utilisée pour évaluer les propriétés stimulantes et de retrait des produits naturels par rapport au mouvement des animaux dans l’eau de source seulement.

Résumé

Un moyen simple et contrôlable d’utiliser le planaire non parasitaire, Dugesia tigrina, un ver plat aquatique vivant libre, pour étudier les propriétés stimulantes et de sevrage des produits naturels est décrit. Des essais expérimentaux bénéficiant d’aspects uniques de la physiologie planaire ont été appliqués aux études sur la cicatrisation des plaies, la régénération et la tumeur. En outre, parce que les planaires présentent une sensibilité à une variété de stimuli environnementaux et sont capables d’apprendre et de développer des réponses conditionnées, ils peuvent être utilisés dans des études comportementales examinant l’apprentissage et la mémoire. Les planaires possèdent une symétrie bilatérale de base et un système nerveux central qui utilise des systèmes de neurotransmetteurs pouvant être utilisés pour étudier les effets des biomodulateurs neuromusculaires. Par conséquent, des systèmes expérimentaux de surveillance des mouvements planaires et de la motilité ont été développés pour examiner la toxicomanie et le sevrage. Parce que la motilité planaire offre le potentiel d’un système sensible et facilement standardisé d’analyse de motilité pour surveiller l’effet des stimuli, le test de vitesse locomotrice planaire (pLmV) a été adapté pour surveiller à la fois les comportements de stimulation et de retrait par les planaires par la détermination du nombre de lignes de grille croisées par les animaux avec le temps. Ici, la technique et son application sont démontrées et expliquées.

Introduction

Le protocole décrit utilise la motilité planaire pour fournir un moyen d’évaluer les effets de biomodulisation des substances naturelles. Il a été spécifiquement adapté pour déterminer si ces substances fonctionnent comme stimulants, et si elles ont ensuite été associées à un comportement de retrait mesurable1. Ce test, connu sous le nom de test de vitesse locomotrice planaire (pLmV), a d’abord été utilisé pour tester les agents pharmacologiques connus2,3. L’application de ce test à base de motilité planaire a depuis gagné en popularité et a été adoptée par différents laboratoires intéressés par des substances autres que les produits naturels4,5. Pour ce test, un planaire est placé dans une boîte de Pétri contenant de l’eau de source ou de l’eau de source contenant un biomodulateur dissous. Étant donné que le plat lui-même est placé sur du papier graphique, le nombre de lignes de grille traversées par l’animal avec le temps pendant qu’il se déplace sur le récipient peut être utilisé pour déterminer le taux de mouvement dans chaque état. Le critère de la lumière/obscurité, autrement appelé le critère de préférence des lieux conditionnés (RPC), est une autre variation sur le thème de la surveillance de la motilité planaire, et évalue la rapidité avec laquelle les animaux réagissent et migrent vers un environnement obscurci6,7. Le suivi vidéo des mouvements planaires peut également être analysé à l’aide de programmes informatiques et de suivi du centre de masse (COM)8,9,10,11.

L’utilisation du planaire comme modèle animal pour de telles études offre plusieurs avantages par rapport aux autres animaux en ce que l’expérimentateur peut facilement contrôler l’environnement d’essai. Plus précisément, la faim des planaires avant l’expérimentation peut empêcher leur exposition à d’autres agents nutritionnels ou pharmacologiques qui pourraient autrement confondre les résultats, et le biomodulateur spécifique à l’étude peut être introduit aux planaires simplement en l’ajoutant directement à l’eau de culture, standardisant ainsi l’exposition. Puisque les planaires ont un système nerveux et des neurotransmetteurs qui rappellent des animaux « d’ordre supérieur », la physiologie et les réponses expérimentales de ces animaux aux stimuli neuromusculaires sont considérés biologiquement pertinents pour d’autres organismes12,13,14,15,16. De plus, comme les planaires sont relativement peu coûteux et faciles à entretenir en laboratoire, ils offrent un modèle biologique accessible à de nombreux chercheurs.

En tant qu’animal expérimental, les planaires conviennent à un large éventail d’études. Par exemple, notre groupe, ainsi que d’autres chercheurs utilisent des planaires pour étudier tumorigenesis17,18,19. Les planaires présentent également une foule de comportements de réponse aux stimuli chimiques, thermiques, gravitationnels, électriques, photographiques et magnétiques qui ont formé la base d’autres systèmes d’essai. Certains de ces effets ont été utilisés pour étudier l’apprentissage et la mémoire chez ces animaux20,21,22,23,24,25,26,27. L’utilisation principale du modèle planaire dans la littérature se concentre actuellement sur l’activité des cellules souches pluripotentes planaires, appelées néoblastes, et leur rôle dans la régénération28,29,30. Ainsi, l’adoption du modèle décrit ici permet d’étudier plus en détail d’autres tests basés sur des planaires afin de fournir une compréhension plus large de la façon dont les produits naturels et autres biomodulateurs affectent l’organisme.

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Protocole

1. Élevage planaire

  1. Utilisez des planaires achetés auprès d’une société d’approvisionnement biologique ou capturés à l’état sauvage si nécessaire. Les planaires utilisés dans ce protocole sont Dugesia tigrina, comme indiqué dans la liste de fournitures. Cette espèce est également appelée Girardia tigrina31. D’autres espèces planaires aquatiques sont également acceptables2,3.
    REMARQUE : Le protocole décrit s’adresse aux animaux achetés auprès d’une société d’approvisionnement biologique. Ce système d’essai n’a pas été testé avec des planaires capturés à l’état sauvage. Toutefois, si des planaires capturés à l’état sauvage sont utilisés, il est recommandé qu’ils soient habitués à l’eau utilisée dans les expériences, ainsi qu’à l’environnement de laboratoire pendant au moins une semaine avant l’utilisation.
  2. À l’arrivée, transférer les planaires dans des contenants de stockage d’aliments en plastique contenant de l’eau de source propre et garder les couvercles entrouverts.
  3. Maintenir les planaires dans un environnement sombre.
  4. Nourrir les planaires nouvellement livrés après 24-36 h dans leur nouvel environnement.
  5. Permettre aux planaires de s’acclimater au laboratoire au moins 1 semaine avant l’expérimentation.
  6. Nourrir les planaires selon un horaire régulier deux fois par semaine.
    1. Laisser les planaires nourrir l’ad libitum sur les œufs bouillis biologiques hachés ou le foie de bœuf biologique mélangé pendant 1 à 2 h.
    2. Placer les planaires nourris dans un contenant propre après l’alimentation.
      1. Retirez l’eau souillée des planaires.
      2. Utilisez un petit pinceau à aquarelle plat (numéro 3–6) pour transférer les débris alimentaires et la boue adhérant au récipient d’environ planarians à une serviette en papier.
      3. Avec de l’eau de source fraîche et un léger tourbillon ou agitation, déloger les planaires et les verser dans un récipient propre.
      4. Tous les planaires restant adhérés au récipient peuvent être transférés à l’aide d’un pinceau à aquarelle ronde (numéro 3–6) ou transférer une pipette avec un large alésage.
      5. Décanter l’eau de transfert.
      6. Couvrir les planaires d’eau de source propre.
      7. Après 24 h, retirez les planaires de tout déchet alimentaire expulsé en les transférant dans un contenant propre tel que décrit ci-dessus (étapes 1.6.2.1–1.6.2.6).
  7. Pour nettoyer les contenants et les ustensiles utilisés pour l’élevage planaire, n’utilisez pas de savon ou de détergent. Nettoyez ces articles en les rinçant bien avec de l’eau propre (l’eau du robinet est acceptable) et en les séchant avec un chiffon propre ou un essuie-tout.

2. Préparation des planaires pour les expériences

  1. Permettre aux planaires nouvellement livrés de s’acclimater à leur environnement au moins 1 semaine avant l’expérimentation.
  2. Starve planarians pendant 5 à 10 jours avant l’expérimentation.
  3. Changer l’eau de culture au moins 1x pendant la période de famine.

3. Test de vitesse locomoteur planaire (pLmV) : Comportements stimulants

  1. Avant l’expérimentation, assurez-vous que les planaires affamés sont entièrement formés, avec une tête et une queue complètes et pigmentées.
  2. Préparer un verre ou un plat petri en verre ou en plastique de 10 cm et un récipient d’accoutumance pour le test pLmV avant de commencer l’expérience.
    1. Placez une boîte de Pétri propre de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’essai pLmV sur du papier de grille prélamé (avec des carrés de 0,5 cm).
    2. Ajouter 20 mL d’eau de source intacte pour les contrôles, ou de l’eau de source contenant la concentration appropriée du produit naturel testé, à la boîte De Petri de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’essai pLmV.
    3. Placez une caméra (p. ex., téléphone cellulaire ou caméra haute résolution) au-dessus de la boîte Petri préparée de 10 cm de diamètre pour enregistrer la motilité planaire sur le papier de grille pendant l’expérience. Un support d’anneau est un moyen pratique de positionner la caméra à une distance qui peut enregistrer toute la vue de la boîte de 10 cm Petri et les lignes de grille.
    4. Préparer un récipient d’accoutumance avec 5 à 10 ml d’eau de source (contrôles) nondulés ou d’eau de source contenant la concentration appropriée du produit naturel testé. Un récipient semblable à une fiole de scintillation ou à une petite boîte de Pétri de 5 cm convient.
  3. Utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond pour transférer doucement un planaire du récipient de stock avec de l’eau de source au récipient d’accoutumance ayant 5–10 ml d’eau de source intacte ou d’eau de source contenant le produit naturel testé.
    REMARQUE : Lorsque vous manipulez des planaires pour l’essai pLmV, utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond (numéro 3–6). Lors du déplacement des planaires, la brosse doit être placée sous l’animal pour la soulever doucement. Pour s’assurer que les planaires ne sont pas endommagés lors de l’utilisation de la brosse, les poils de la brosse ne doivent pas être étalés sous l’animal. L’étalement des poils pourrait nuire au planaire s’il est pris entre les fibres de la brosse.
    REMARQUE : Une pipette de transfert de forage large peut également être utilisée pour transférer le planaire dans un récipient d’accoutumance propre et sec.
    1. Si vous utilisez la pipette, retirez l’excès d’eau déplacé avec le planaire du récipient d’accoutumance à l’aide de la pipette de transfert.
    2. Ajoutez soigneusement la solution d’accoutumance (c.-à-d. l’eau de source pour les contrôles ou l’eau de source contenant la concentration de produit naturel testé) au récipient d’accoutumance contenant le planaire.
  4. Les périodes d’accoutumance dépendront de la dynamique de stimulation évaluée pour le produit naturel testé. Un temps d’accoutumance de 2 min s’est avéré acceptable pour détecter la stimulation dans ce travail1.
  5. Après la période d’accoutumance de 2 min, utilisez un pinceau à aquarelle pour transférer doucement le planaire au centre de la boîte de Pétri préparée de 10 cm pour l’expérience de stimulation pLmV.
  6. Démarrez la caméra pour enregistrer le mouvement du planaire. Record 10–11 min de vidéo.
  7. Préparez le récipient d’accoutumance et le plat Petri de 10 cm pour l’expérience pLmV avec des solutions fraîches pour chaque planaire.
  8. Utilisez des pipettes, des plats, des contenants et des pinceaux dédiés pour chaque concentration expérimentale du produit naturel testé afin d’éviter d’exposer par inadvertance les planaires à la mauvaise solution lors de l’expérimentation.
  9. Étant donné que les planaires présentent des comportements appris, chaque planaire (contrôle ou test) ne doit être utilisé qu’une fois21,22.

4. Test de vitesse locomotrice planaire (pLmV) : Comportements de retrait

  1. Avant l’expérimentation, assurez-vous que les planaires affamés sont entièrement formés, avec une tête et une queue complètes et pigmentées.
  2. Préparez une boîte de Pétri de 10 cm (verre ou plastique) pour l’expérience pLmV, une boîte de Pétri de 5 cm (verre ou plastique) pour rincer le planaire suivant l’accoutumance, et un récipient d’accoutumance avant de commencer l’expérience.
    1. Placez une boîte de Pétri propre de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’expérience pLmV sur du papier de grille prélamé avec des carrés de 0,5 cm).
    2. Ajouter 20 mL d’eau de source intacte à la boîte de Pétri de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’expérience pLmV.
    3. Placez une caméra au-dessus de la boîte Petri préparée de 10 cm de diamètre comme à l’étape 3.2.3 pour enregistrer la motilité planaire sur le papier de grille pendant l’expérience.
    4. Préparer le récipient de rinçage planaire en ajoutant 5 ml d’eau de source seul à la boîte de Pétri de 5 cm.
    5. Préparer un récipient d’accoutumance avec 5 à 10 ml d’eau de source (contrôles) ou d’eau de source contenant le produit naturel testé. Un récipient semblable à une fiole de scintillation ou à une petite boîte de Pétri de 5 cm (verre ou plastique) convient.
  3. Utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond pour transférer un planaire de l’eau de source au récipient d’accoutumance préparé ayant 5–10 ml d’eau de source (contrôles) ou d’eau de source contenant le produit naturel testé. Déplacez doucement l’animal du récipient de stock au récipient d’accoutumance. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
    REMARQUE : Lorsque vous manipulez des planaires pour l’essai pLmV, utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond (numéro 3–6). Lors du déplacement des planaires, la brosse doit être placée sous l’animal pour la soulever doucement. Pour s’assurer que les planaires ne sont pas endommagés lors de l’utilisation de la brosse, les poils de la brosse ne doivent pas être étalés sous l’animal. L’étalement des poils pourrait nuire au planaire s’il est pris entre les fibres de la brosse.
    REMARQUE : Une pipette de transfert de forage large peut également être utilisée pour transférer le planaire dans un récipient d’accoutumance propre et sec.
    1. Si vous utilisez la pipette, l’excès d’eau déplacé avec le planaire doit être retiré du récipient d’accoutumance à l’aide de la pipette de transfert.
    2. Ajoutez soigneusement la solution d’accoutumance (c.-à-d. l’eau de source intacte pour les commandes ou l’eau de source contenant le produit naturel testé) au récipient d’accoutumance contenant le planaire.
  4. Les périodes d’accoutumance pour le retrait dépendront de la dynamique de stimulation évaluée pour le produit naturel testé; 2–5 min se sont avérés suffisants.
  5. Après la période d’accoutumance, utilisez un pinceau à aquarelle pour transférer doucement le planaire dans la boîte petri préparée de 5 cm contenant de l’eau de source pour rincer tout produit naturel du récipient d’accoutumance. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
  6. Transférer immédiatement le planaire au centre de la boîte de Pétri préparée de 10 cm contenant de l’eau de source pour l’expérience de retrait pLmV. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
  7. Démarrez la caméra pour enregistrer le mouvement du planaire. Record 10–11 min de vidéo.
  8. Préparez le récipient d’accoutumance, le récipient de rinçage et la boîte de Pétri de 10 cm pour l’expérience pLmV avec des solutions fraîches pour chaque planaire.
  9. Utilisez des pipettes, des plats, des contenants et des pinceaux dédiés pour chaque concentration expérimentale du produit naturel testé afin d’éviter d’exposer par inadvertance les planaires à la mauvaise solution lors de l’expérimentation.
  10. Parce que les planaires présentent des comportements appris, utilisez chaque planaire (contrôle ou test) qu’une fois26,27.

5. Analyse des données

  1. Préparez une table de collecte de données pour documenter le comportement et la motilité des planaires comme le nombre de lignes de grille croisées pour chaque minute pendant l’exécution pLmV. Le tableau devrait permettre de documenter également le nombre cumulé de lignes par minute franchies par le planaire. Inclure des lignes pour les notes et un tableau de définitions pour compter l’observation des comportements au cours de la période expérimentale, tels que « erre » et « stop » (voir Discussion).
  2. À l’aide de la vidéo, comptez le nombre de lignes de grille complètes franchies par le planaire par minute pendant 10 min et enregistrez ce nombre sur la table de données. Le comportement planaire typique se compose de la vitesse continue, du mouvement horizontal dirigé vers l’avant, avec des virages périodiques, et sans arrêts.
    1. Commencez à chronométr l’expérience au point que le planaire a quitté le pinceau utilisé pour le transférer à la boîte de Pétri de 10 cm. Enregistrez cette heure de début.
    2. Pour déterminer quand l’animal traverse un carré de grille complète, concentrez-vous sur la tête et marquez une ligne lorsque la tête traverse entièrement un carré.
    3. Pour marquer une grille complète lorsque le ver se déplace autour du bord du plat, visualiser une distance de 0,5 cm en se référant aux lignes comme ils s’étendent à partir des marges du plat. Si le planaire traverse le coin d’une boîte, reportez-vous à la deuxième ligne franchie pour marquer une ligne de grille. Encore une fois, concentrez-vous sur la tête pour prendre ces décisions.
    4. Arrêtez la vidéo après chaque minute pour enregistrer les données.
    5. Lors du redémarrage de la vidéo pour compter la minute suivante, si la tête du ver se trouvait entre les lignes de grille lorsque la vidéo a été arrêtée, enregistrez la première ligne franchie comme une boîte complète.
    6. Marquez le nombre de lignes de grille croisées pendant 10 min.
  3. Si l’animal cesse de se déplacer pendant un test pLmV et ne traverse plus les lignes de grille pendant le temps d’enregistrement de 10 minutes, documentez le comportement du planaire dans le tableau comportemental (p. ex., « erre » ou « stop »). Les animaux qui cessent leur trajectoire avant pendant l’essai pLmV devraient plutôt être pris en compte et les données présentées comme une fréquence du nombre total d’animaux exposés à cette concentration de réactifs. Le comportement enroulé ou convulsif (connu sous le nom de comportement C) empêchant tout mouvement vers l’avant pendant la période d’accoutumance indique que la concentration du produit naturel n’est pas appropriée pour une utilisation dans un essai pLmV parce que le test pLmV est basé sur la motilité. Les comportements de type C peuvent être analysés à l’aide d’un autre type d’analyse (voir Discussion).
  4. Si possible, tester plusieurs concentrations expérimentales du produit naturel à l’aide d’au moins 9 à 12 vers à des jours et à des moments différents de la journée si vous déterminez l’effet global du réactif sur la physiologie planaire. Cependant, si les chercheurs s’efforcent de réduire la variabilité induite par le rythme circadien, des expériences peuvent être menées avec un éclairage constant à une heure définie de la journée à l’aide de vers qui sont cultivés avec des cycles chronométrés lumière / obscurité et définir les temps d’alimentation. Avoir au moins deux expérimentateurs impliqués dans le projet pour permettre la possibilité d’avoir une donnée d’enregistrement individuelle, tandis que le second individu compte les lignes de grille « n aveugle » aux conditions utilisées pour la collecte de données. Le fait que différentes personnes participent à la collecte de données, ainsi que des calculs et des analyses statistiques, réduit également les biais possibles.
  5. Calculer le nombre de lignes de grille pour chaque concentration naturelle de produit chaque jour par rapport au nombre de témoins pour chaque minute afin que les données de différents jours, heures et expérimentateurs puissent être combinées. Ces données peuvent être calculées en moyenne, puis analysées à l’aide des tests T de l’élève. Les valeurs P pour chaque test peuvent être évaluées par minute par rapport au contrôle et entre les concentrations de réactifs. Les évaluations ANOVA à l’aide d’ensembles de données dérivés de différentes concentrations expérimentales fournissent une autre méthode d’analyse.

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Résultats

Le laboratoire mis en place et la préparation de l’espace de travail pour l’exécution de l’essai pLmV doivent être terminés avant le début de l’expérimentation. Cela comprend la préparation du récipient d’accoutumance, le récipient de rinçage si nécessaire (pour les expériences de retrait), la boîte de Pétri sur le papier de grille laminé, et la caméra correctement placée (Figure 1). Une fois toutes les vidéos prises, il est conseillé d’utiliser une feuille de données commune pour normaliser...

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Discussion

Un test de motilité planaire simple et accessible est décrit pour déterminer les effets stimulants et de sevrage des produits naturels. En tant que modèle comportemental, il est nécessaire d’avoir des protocoles rigoureux pour marquer le mouvement et des définitions claires de tout comportement pour normaliser les observations entre les différents expérimentateurs. Les idées présentées offrent une démonstration de la façon dont cela peut être réalisé. Chaque laboratoire utilisant ce protocole doit adapter les information...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs souhaitent reconnaître le bureau de l’avancement institutionnel et la Morrisville College Foundation pour une subvention de publication à l’appui de ce travail, ainsi que le SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) pour leur aide continue et leur soutien à la recherche de premier cycle à SUNY Morrisville. Nous tenons également à remercier Sophia Hutchens pour leurs commentaires utiles sur la technique décrite.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eau embouteillée - 1 gal.Pologne SourceN/AEau de source pour la culture planaire et pour préparer des solutions
Planaire brun (Dugesia tigrina)Carolina Biological Supply Company132954Planaire brun vivant (les autres espèces sont acceptables)
Pinceau platRoyal Crafter’s Choice9159Pinceaux aquarelles plats pour le nettoyage des récipients de culture planaire
Boîte de Pétri en verre - 10 cmKimaxN/ABoîtes de Pétri de 10 cm de diamètre (verre) pour le dosage de la pLmV
Boîte de Pétri en verre - 5 cmKimaxN/A5 cm et boîtes de Pétri pour le rinçage des planaires lors des expériences de sevrage et pour l’habituation aux stimulants
Papier quadrilléN’importe quelN/APapier quadrillage standard de 0,5 cm pour le dosage de la pLmV
Visualiseur iPEVO (logiciel)iPEVOhttps://www.ipevo.com/software/visualizerLogiciel de caméra de documents pour la capture et l’enregistrement vidéo
Ensemble d’articles métalliques avec support et anneau d’autoclaveN’importe quelsupportd’anneau de laboratoire de chimie standard pour tenir l’appareil photo d’un téléphone portable s’il est utilisé
Œuf biologiqueToutS.O. Œuf ou foie de bœuf biologique pour l’alimentation des planarains
Bouteille en polycarbonate avec bouchon à visser - 10 mLBeckmanN/AFlacons en plastique pour contenir des volumes de 5 à 10 mL pour l’accoutumance aux stimulants
Récipient de stockage rond - 10 cmZiplocN/D10 cm Récipients ronds de conservation des aliments pour environ 90 planaires ou moins
Pinceau rond à l’eauLOEW-CornellN/APetits pinceaux ronds à l’aquarelle (numéros 3 à 6) -
Pipette de transfertN’importe quelN/APipettes de transfert en plastique de large calibre (5 ml) pour déplacer les planaires
Caméra de documents USBiPEVOCDVU-06IPCaméra de document (ou autre caméra ou caméra de téléphone portable)
souple

Références

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