Article de méthode

Une plate-forme Lab-On-A-Chip pour stimuler la mécanotransduction ostéocyte et analyser les résultats fonctionnels du remodelage des os

7K vues

⸱

DOI :

10.3791/61076

⸱

21 mai 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour analyser le remodelage des os dans une plate-forme de laboratoire sur puce. Un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D peut être jumelé à la plate-forme pour induire la mécanostransduction ostéocyte en déformant la matrice cellulaire. La plate-forme peut également être utilisée pour quantifier les résultats fonctionnels de remodelage des ostéoclastres et des ostéoblastes (résorption/formation).

Résumé

Le remodelage osseux est un processus étroitement réglementé qui est nécessaire pour la croissance et la réparation squelettiques ainsi que pour s’adapter aux changements dans l’environnement mécanique. Pendant ce processus, les ostéocytes mécanosensitifs régulent les réponses opposées entre les ostéoclastes cataboliques et les ostéoblastes anabolisants. Pour mieux comprendre les voies de signalisation très complexes qui régulent ce processus, notre laboratoire a mis au point une plate-forme de laboratoire sur puce (LOC) pour analyser les résultats fonctionnels (formation et résorption) de remodelage osseux au sein d’un système à petite échelle. Comme le remodelage des os est un processus long qui se produit de l’ordre de semaines à des mois, nous avons développé des protocoles de culture cellulaire à long terme dans le système. Les ostéoblastes et les ostéoclastes ont été cultivés sur des substrats d’activité fonctionnelle dans le LOC et maintenus jusqu’à sept semaines. Par la suite, les copeaux ont été démontés pour permettre la quantification de la formation et de la résorption osseuses. En outre, nous avons conçu un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D qui s’associe à la plate-forme LOC et peut être utilisé pour induire la mécanotransduction ostéocyte en déformant la matrice cellulaire. Nous avons optimisé les protocoles de culturation cellulaire pour les ostéocytes, les ostéoblastes et les ostéoclastes au sein de la plate-forme LOC et avons abordé les préoccupations de stérilité et de cytotoxicité. Ici, nous présentons les protocoles pour fabriquer et stériliser le LOC, ensemencement des cellules sur des substrats fonctionnels, en induisant la charge mécanique, et en démontant le LOC pour quantifier les résultats des points de terminaison. Nous croyons que ces techniques je base pour développer un véritable organe sur puce pour le remodelage des os.

Introduction

L’os est un tissu très dynamique qui nécessite une coordination complexe entre les trois principaux types de cellules : ostéocytes, ostéoblastes et ostéoclastes. Les interactions multicellulaires entre ces cellules sont responsables de la perte osseuse qui se produit pendant la paralysie et l’immobilité à long terme et de la formation osseuse qui se produit en réponse à la croissance et à l’exercice. Les ostéocytes, le type de cellule osseuse le plus abondant, sont très sensibles aux stimuli mécaniques appliqués sur l’os. La stimulation mécanique modifie l’activité métabolique des ostéocytes et entraîne une augmentation des molécules de signalisation clés1,2. Grâce à ce processus, connu sous le nom de méchanotransduction, les ostéocytes peuvent coordonner directement les activités des ostéoblastes (cellules formatrices osseuses) et des ostéoclastes (cellules de résorbage des os). Le maintien de l’homéostasie osseuse exige une réglementation stricte entre la formation osseuse et les taux de résorption osseuse; cependant, les perturbations dans ce processus peuvent avoir comme conséquence des états de maladie tels que l’ostéoporose ou l’ostéopétrose.

La complexité des interactions entre ces trois types de cellules se prête bien à l’investigation utilisant les technologies microfluidiques et de laboratoire sur puce (LOC). À cette fin, notre laboratoire a récemment établi la preuve de concept d’une plate-forme LOC pour analyser la résorption et la formation osseuses (résultats fonctionnels) dans le processus de remodelage des os. La plate-forme peut être utilisée pour l’étude des interactions cellulaires, des environnements de chargement modifiés et du dépistage des médicaments par voie d’investigation. Ces dernières années, divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour étudier les voies de signalisation moléculaire qui régulent le remodelage des os; cependant, beaucoup de ces systèmes quantifient le remodelage par des marqueurs indirects qui sont indicatifs de l’activité fonctionnelle3,4,5,6,7. Un avantage de notre système est qu’il peut être utilisé pour la quantification directe des résultats fonctionnels. Le remodelage osseux est un processus à long terme. En tant que tel, la quantification directe de la résorption osseuse et la formation nécessite un système de culture qui peut être maintenu pendant un minimum de plusieurs semaines à mois8,9,10,11. Ainsi, lors du développement de la plate-forme LOC, nous avons établi des protocoles de culte à long terme nécessaires à la formation et à la résorption et avons maintenu des cellules dans le système jusqu’à sept semaines11. En outre, nous avons incorporé des substrats de culture appropriés pour les deux types de cellules dans la plate-forme; les ostéoclastres ont été cultivés directement sur l’os, et les ostéoblastes, qui sont connus pour être adhérents en plastique, ont été cultivés sur des disques de polystyrène. En outre, nous avons abordé les questions concernant la stérilité, la cytotoxicité à long terme et le démontage des puces pour la refonte de l’analyse11,12.

La plate-forme LOC peut également être utilisée pour induire la mécanotransduction ostéocyte par déformation de la matrice. Un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D a été développé pour jumeler avec le LOC et appliquer une distension statique hors de l’avion pour étirer les cellules13. Pour tenir compte de cette charge mécanique, la profondeur du puits à l’intérieur du COL a été augmentée. Ce dispositif de chargement mécanique simple à petite échelle peut être facilement produit par des laboratoires avec une expérience d’ingénierie limitée, et nous avons déjà partagé des dessins des composants imprimés 3D13. Dans les travaux en cours, nous démontrons quelques-unes des nouvelles techniques nécessaires à l’utilisation réussie du LOC. Plus précisément, nous démontrons la fabrication de puces, l’ensemencement cellulaire sur les substrats fonctionnels, le chargement mécanique et le démontage des copeaux pour remodeler la quantification. Nous croyons que l’explication de ces techniques bénéficie d’un format visuel.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation de masque de puce

REMARQUE : Les étapes 1.1 - 1.3 n’ont qu’à être exécutées une fois à la réception initiale du masque à puce. Ils s’assurent que le masque ne s’incline pas pendant l’utilisation. La conception des masques microfluidiques a été précédemment décrite11,14. Les masques ont été conçus à l’interne et fabriqués commercialement à l’aide d’une stéréolithographie haute résolution(figure 1A).

  1. Couvrir la surface supérieure du masque avec des bâches en plastique pour protéger cette surface de l’adhésif. Fixez le masque à puce sur une feuille acrylique de taille égale à l’aide d’adhésifs en spray. Serrez les morceaux ensemble pendant la nuit pour permettre à l’adhésif de guérir complètement. Une fois l’adhésif sec, retirer les bâches en plastique du haut du masque.
  2. Fixez le bas de la feuille acrylique à une boîte de nivellement imprimée en 3D(figure supplémentaire 1, fichiers supplémentaires 1-4) à l’aide de ruban adhésif recto-verso. Appuyez fermement pour assurer un lien serré.
  3. Scellez les petites ouvertures près de la paroi amovible de la boîte de nivellement avec un scellant imperméable. Laisser le scellant guérir pendant 24 h.
  4. Nettoyer la surface du masque avec 70% d’éthanol (EtOH). Placer la boîte de nivellement avec le masque à puce désiré dans le four. Utilisez un protracteur numérique pour vous assurer que le haut du masque est de niveau. Ajuster les vis de nivellement si nécessaire.

2. Fabrication PDMS

REMARQUE : Une conception de copeaux peu profonde (1 mm) est utilisée pour les essais d’activité fonctionnelle (formation et résorption), et une conception de copeaux de puits profonds (10 mm) est utilisée pour des études de chargement mécanique. Le fond du puits profond est formé en attachant une membrane PDMS mince séparée(figure 1B).

  1. Couche de couvercle (Couche 1)
    1. Combinez 63 g de prepolymer PDMS et 6,3 g d’agent de durcissement (rapport 10:1) dans une tasse en plastique. Mélanger soigneusement avec une spatule cellulaire jetable et degas dans un desiccateur de vide pendant 30 min.
    2. Verser lentement le mélange dans la boîte de nivellement préparée. Laisser reposer le PDMS pendant 30 min, puis cuire au four à 45 oC pendant 18 h.
    3. Desserrer les bords du PDMS à l’aide d’une spatule de laboratoire effilée et retirer la feuille de polymère de la boîte de nivellement.
    4. Couper les couvercles individuels à la taille (70 mm x 34 mm) à l’aide d’un scalpel et d’un modèle imprimé 3D.
    5. Percer les trous d’accès à travers chaque couvercle avec un poinçon de biopsie (1 mm de diamètre).
    6. La surface nettoie les couvercles avec du ruban adhésif.
      REMARQUE : Si les couvercles ne sont pas utilisés immédiatement, enveloppez-les dans du ruban adhésif et entreposez-les à température ambiante (RT).
  2. Couche de puits et de microcanal (couche 2)
    1. Dans une tasse en plastique, mélanger l’agent de prépollyme et de durcissement PDMS (10:1. La conception de puits peu profonds exige 43 g de prepollymer et 4,3 g d’agent de durcissement, et la conception de puits profonds nécessite 227 g de prepolymer et 22,7 g d’agent de durcissement. Mélanger vigoureusement le polymère et les dégazages pendant 30 min.
      REMARQUE : Cela suppose une dimension de masque de 152,4 mm x 152,4 mm.
    2. Versez lentement le mélange sur le masque pré-nivelé approprié. Laisser reposer le PDMS pendant 30 min, puis cuire au four à 45 oC pendant 18 h.
    3. Desserrer les bords du PDMS avec une spatule de laboratoire effilée et éplucher soigneusement le polymère loin du masque. Utilisez un modèle imprimé scalpel et 3D pour découper les puces individuelles.
      REMARQUE : Pour les études de chargement, il est important que les dimensions des puces (70 x 34 mm) soient précises et que le puits soit situé au centre de la puce.
    4. Surface nettoyer le PDMS avec du ruban adhésif.
      REMARQUE : Si les puces ne sont pas utilisées immédiatement, enveloppez chaque puce dans du ruban adhésif et entreposez-les à RT.
  3. Membrane PDMS mince (couche 3)
    REMARQUE : Cette couche n’est utilisée que pour la conception de puits profonds.
    1. Ajouter 12,7 g de prepolymer PDMS et 1,3 g d’agent de durcissement (10:1 ratio) à une tasse en plastique. Mélanger vigoureusement et les dégazages pendant 30 min.
    2. Versez lentement le polymère dans la boîte de nivellement préparée et grattez soigneusement la tasse en plastique pour enlever autant de PDMS que possible.
    3. Utilisez la spatule cellulaire pour étendre le PDMS sur toute la surface.
      REMARQUE : Si le polymère n’est pas étalé manuellement, la tension de surface sera suffisante pour empêcher le polymère de former une feuille uniforme.
    4. Laisser reposer le PDMS pendant 30 min, puis cuire au four à 45 oC pendant 18 h.
    5. Desserrer les bords du PDMS à l’aide d’une spatule effilée et retirer soigneusement la feuille PDMS de la boîte de nivellement. Couper les membranes individuelles qui correspondent aux dimensions de la couche 2.
    6. Mesurer l’épaisseur de la membrane au centre de la membrane à l’aide d’étriers. Jetez les membranes qui ne sont pas à l’écart de l’épaisseur désirée (0,5 mm à 0,1 mm).
    7. Nettoyer soigneusement les membranes avec du ruban adhésif et le placer sur un morceau de film de paraffine.
      REMARQUE : Si les membranes ne sont pas utilisées immédiatement, recouvrez le haut de la membrane de ruban adhésif et rangez-la à RT.

3. Substrats d’activité fonctionnelle

REMARQUE : Les disques en polystyrène et les gaufrettes osseuses doivent être fixés au fond des puits qui seront utilisés pour les cultures ostéoblastiques et ostéoclastres, respectivement.

  1. Disques de polystyrène(figure 1C)
    1. Placer du ruban adhésif de masquage sur le côté arrière d’un couvre-mélire traité par culture tissulaire. Couper les disques circulaires du coverlip à l’aide d’un bourracheur de liège aiguisé (5,4 mm de diamètre). Submergez les disques dans 70% EtOH et partez toute la nuit.
    2. Frotter délicatement la surface supérieure du disque avec un applicateur à pointe de coton imbibé de 70% EtOH. Assurez-vous que le bord extérieur du disque est soigneusement nettoyé.
    3. À l’aide de deux paires de forceps, maintenez le disque et retirez le support de bande de masquage. Placez le côté traité du disque vers le bas et nettoyez le côté arrière avec un applicateur à pointe de coton.
    4. Trempez l’extrémité en bois d’un applicateur à pointe de coton dans un mélange dégazé de PDMS non durci et placez une petite quantité de polymère sur le fond du puits désiré.
      REMARQUE : Le SIP non sécurisé peut être stocké à -20 oC.
    5. Placer le disque de polystyrène, côté traité vers le haut, dans le puits et appuyez doucement sur le disque avec un coton-tige. Assurez-vous qu’aucun PDMS non sécurisé n’entre en contact avec le côté traité du disque.
      REMARQUE : Si PDMS entre en contact avec la surface traitée du disque, retirez le disque du puits et répétez les étapes 3.1.4 et 3.1.5 avec un nouveau disque.
    6. Laisser reposer la puce sur une surface plane pendant 30 min, puis cuire au four à 65 oC pendant 4 h.
  2. Gaufrettes osseuses
    1. Utilisez des forceps pour placer une plaquette osseuse (6 mm de diamètre, 0,4 mm d’épaisseur) au fond d’un plat de 100 mm. Maintenez la plaquette stable avec les forceps et émanez doucement un « X » sur le dos de la plaquette avec un scalpel.
      REMARQUE : Pendant le processus d’imagerie, le « X » est utilisé pour distinguer entre l’arrière de la plaquette et la surface sur laquelle les cellules ont été ensemencées.
    2. Utilisez l’extrémité en bois d’un applicateur à pointe de coton pour ajouter une petite quantité de PDMS non sécurisé au fond du puits désiré. Placez la plaquette osseuse, marquée latérale vers le bas, dans le puits et utilisez un applicateur à pointe de coton pour appuyer sur la plaquette vers le bas.
    3. Laisser reposer la puce sur une surface plane pendant 30 min, puis cuire au four à 65 oC pendant 4 h.

4. Assemblage et stérilisation des copeaux

  1. Activer les surfaces de la couche 1 et de la couche 2 avec un nettoyant plasma pour 30 s à l’aide d’un réglage de puissance à fréquence radio moyenne (RF) (équivalent à environ 10,2 W).
  2. Alignez les trous d’accès dans la couche 1 avec les microcanaux en couche 2 et appuyez fermement sur les deux couches ensemble.
  3. Pour la conception de puits profonds, répétez l’étape 4.1 avec la couche 2 et la couche 3. Pendant le traitement plasmatique, utilisez du ruban adhésif recto-verso pour attacher le film de paraffine de la couche 3 à une surface plane.
  4. Utilisez un scalpel pour couper l’excès de matière de la membrane PDMS. Peler soigneusement la feuille de film de paraffine du bas de la puce
  5. Cuire la puce à 65 oC pendant 10 minutes afin d’augmenter la résistance des liaisons entre les couches PDMS.
  6. Insérer des conseils de distribution inclinés (18 Gauge, 0,5 dedans, 90 degrés) dans les trous d’accès dans le couvercle. Fixez les conseils de distribution sur le couvercle avec une époxy en deux parties. Utilisez une pointe de micropipette pour appliquer l’époxy autour de chaque pointe de distribution.
  7. Une fois l’époxy entièrement guéri, la surface nettoie la puce avec 70% EtOH et placez-la dans une armoire de biosécurité. Effectuez toutes les étapes suivantes dans l’armoire de biosécurité.
  8. Connectez une seringue de 5 ml aux conseils de distribution avec des tubes stériles en silicone (1/32'' ID, 10 cm de longueur) et remplissez la puce entière de 70% EtOH pour au moins 30 s. Pour la conception peu profonde de puits, administrer tous les liquides avec une pompe à seringue réglée à un débit de 4 ml/h. Pour la conception de puits profonds, administrer tous les liquides en distribuant lentement la seringue à la main.
  9. Retirer l’EtOH de la puce et stériliser la puce avec la lumière UV pendant la nuit.
  10. Laver la puce 3 fois avec dH2O. Remplir la puce avec dH2O, retirer les tubes des conseils de distribution et incuber pendant au moins 48 h à 37 oC.

5. Assemblage mécanique du dispositif de chargement

REMARQUE : Les processus de conception et de fabrication du dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D(figure 2A-C) ont été décrits précédemment et tous les fichiers de conception pour les composants imprimés ont été précédemment fournis13.

  1. Autoclavez tous les composants du dispositif de chargement pendant 30 min à 121 oC.
    REMARQUE : Pour éviter de déformer les composants imprimés, enveloppez chaque pièce individuellement dans du papier d’aluminium et placez-les sur une surface plate dure pendant le processus d’autoclaving. Le matériel métallique peut être emballé ensemble. Remplissez toutes les étapes suivantes dans un coffret de biosécurité.
  2. Placez une source de compression autour de l’arbre de la plaque et insérez la plaque dans le trou central au fond de la base(figure 2D).
  3. Fixez le bloc de cadran au bas de la base à l’aide de quatre vis auto-tapotant.
  4. Placer un deuxième ressort de compression autour de la vis centrale. Insérez la vis dans le trou hexagonal dans le bas du cadran et visser l’assemblage dans le trou fileté au centre du bloc de cadran.
  5. Vis quatre impasses hommes-femmes dans le bas de la base.
  6. Retirez le mou de l’appareil en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le haut de la plaque soit en dessous du haut de la base. Puis tourner lentement le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le haut de la plaque est de niveau avec le haut de la base.

6. Expérimentation

REMARQUE : Les protocoles pour les expériences d’activité fonctionnelle ont été précédemment fournis11,12.

  1. Études de chargement(figure 3)
    1. Après l’étape 4.9, utilisez une seringue de 5 ml pour retirer le dH2O de la puce de puits profonds. Enrober le fond du puits avec 200 L de collagène de type I de 0,15 mg/mL (CTI) dans 0,02 M d’acide acétique pendant 1 h.
    2. Rincer la puce trois fois avec la saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec du calcium et du magnésium (DPBSMD).
    3. Placez la puce dans le porte-puce et la graine avec des ostéocytes MLO-Y4 à une densité de 2 x 104 cellules/mL dans un milieu alpha essentiel minimum (MEMMD) complété par 5 % de sérum de veau, 5 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine.
    4. Retirer le tube des pointes de distribution et placer la puce dans un plat de culture de puits profonds (150 mm x 25 mm). Cellules incubées à 37 oC et 5% DE CO2 pour 72 h.
    5. Attachez les tubes stériles aux pointes de distribution et utilisez une seringue de 5 ml pour enlever le milieu de culture dépensé de la puce. Distribuez lentement dans le milieu de culture fraîche pour remplir la puce.
    6. Placez le porte-puce dans l’encart rectangulaire sur le dessus de la base de l’appareil de chargement. Alimentez les tubes à travers les fentes situées sur le couvercle de l’appareil de chargement et fixez le couvercle à la base avec quatre vis de tête de casserole et des écrous de hex.
      REMARQUE : Pour s’assurer que le couvercle reste de niveau, fixez d’abord deux vis situées en diagonale l’une de l’autre avant de fixer les deux autres vis.
    7. Appliquer la charge sur les cellules en tournant le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le déplacement plaqueur désiré soit atteint.
      REMARQUE : L’appareil est conçu de sorte qu’une rotation du cadran équivaut à un déplacement plaquen de 1 mm. Le champ de contrainte généré sur le dessus de la membrane PDMS a été précédemment modélisé en fonction du déplacement des plaques à l’aide de l’analyse des éléments finis (FEA)13.
    8. Placez l’appareil de chargement dans une boîte à pourboires P1000 vide. Incuber les cellules avec la charge appliquée pendant 15 min.
      REMARQUE : La période de chargement utilisée ici sert d’exemple. D’autres temps de chargement peuvent être utilisés.
    9. Après l’incubation, retirez la charge des cellules en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le plaqueur retourne à la position de départ d’origine. Retirez le couvercle de l’appareil et placez le porte-puce dans la plaque de culture de puits profonds. Incuber les cellules pour une période de récupération post-charge de 90 minutes.
      REMARQUE : Encore une fois, la période de récupération utilisée ici sert d’exemple. D’autres temps de récupération peuvent être utilisés. Pour des études à long terme, nourrir les cellules tous les 72 h.
    10. Utilisez une seringue de 5 ml pour retirer le milieu conditionné de la puce.
      REMARQUE : Ce support peut être enregistré et stocké à -80 oC.
    11. Retirez la puce du porte-puce et utilisez une spatule effilée pour briser le lien entre le couvercle PDMS et la couche de puits.
      REMARQUE : Les essais cellulaires peuvent maintenant être exécutés suivant n’importe quel protocole établi pour une plaque de culture cellulaire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La configuration des puits peu profonds peut être utilisée pour analyser l’activité fonctionnelle des ostéoblastes et des ostéoclastres. La formation osseuse par ostéoblastes et la résorption par l’intermédiaire d’ostéoclastes nécessite des temps de culture de l’ordre de plusieurs semaines à des mois. La formation osseuse des pré-ostéoblastes MC3T3-E1 a été quantifiée à l’aide de taches alizarin rouge et von Kossa11,15. Au jour 49...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Cet article décrit les fondations pour la fabrication d’une plate-forme LOC remodelant osseuse pour la culture des ostéocytes, des ostéoclastes et des ostéoblastes. En modifiant la profondeur et la taille du puits à l’intérieur de la puce, de multiples configurations ont été développées pour stimuler les ostéocytes avec une charge mécanique et quantifier les résultats fonctionnels du remodelage osseux(figure 1B).

Pendant l’assemblage des puces, l’...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation sous Grant Nos. (CBET 1060990 et EBMS 1700299). De plus, ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program dans le cadre de la subvention no 2018250692). Les opinions, les conclusions, les conclusions ou les recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille acryliqueOptix--3.175 mm d’épaisseur
Embouts de distribution coudésJensen GlobalJG18-0.5X-90Retirer le connecteur en plastique avant utilisation
Poinçon de biopsieRobbins InstrumentsRBP-101 mm de diamètre
Plaquettes osseusesBoneslices.com0,4 mm d’épaisseurOs cortical bovin
Sérum de veau bovinHyclone
ÉtriersGlobal IndustrialT9F534164
Cell spatuleTPP99010
Masque à puceProtoLabsConçu sur mesureMatériau d’impression : Accura SL 5530
Perceuse de liègeFisher Scientific07-865-10B
Applicateur à embout en cotonPuritan806-WCL
Culture Boîte (100 mm)Corning430591Stérile, sans culture tissulaire
(150 mm)Corning430597Stérile, sans culture tissulaire
Ruban adhésif double face3M CompanyScotch 237
Sérum fœtal bovinHycloneSH30910
PinceFisher Scientific22-327379
Boîte de nivellementSur mesure--Imprimé en 3D
Ruban de masquage3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 préostéoblastesATCCCRL-2593Subclone 4
Dispositif de chargement mécaniqueSur mesure--Imprimé en 3D
essentiel alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 ostéocytes----Don de la Dre Lynda Bonewald
Ruban d’emballageMarque Duck- Ruband’emballage standard
Film de paraffineBemis ParafilmPM999
Pénicilline / streptomycineInvitrogenp4333
Nettoyant plasmaHarrick PlasmaPDC-001Nettoyeur de plasma expansé
Kit de polydiméthylsiloxaneDow CorningSylgard 184
Lamelles en polystyrèneNunc Thermanox174942Stérile, traité par culture tissulaire
FourQuincy Lab12-180
RAW264.7 préostéoclastesATCCTIB-71
ScalpelBD Medical372611
Tube en siliconeSaint-Gobain Tygon ABW00001ID : 1/32 » (0,79 mm), OD : 3/32 » (2,38 mm)
Logiciel SolidWorksDassault Systè ; mes--Utilisé pour générer des modèles imprimés en 3D et effectuer des FEA
Spray adhésifLoctite2323879Seringue adhésive polyvalente
(5 ml)BD Medical309646Pompe
seringueHarvard Apparatus70-2213Pompe 11 Pico Plus
Spatule de laboratoire coniqueFisher Scientific21-401-10
En deux parties expoxyLoctite13953915 minutes quick set
Collagène de type ICorning354236Collagène queue de rat
Dessiccateur sous videBel-ArtF42010-0000
Mastic imperméableGorilla8090001Mastic 100 % silicone
SH30072 Minimum à stérile

Références

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Analyse du remodelage osseuxcouche membranaire en PDMSdispositif de charge m caniqueculture cellulaire long termequantification de la formation osseusevaluation de la r sorption osseuseco culture d ost oblastes et d ost oclastesdistension statique hors plan

Articles connexes