Dosage basé sur le flux pour l’identification des modulateurs de l’autophagie dans l’arthrose

Résumé

Cet article détaille la surveillance du flux d’autophagie afin d’identifier de nouvelles molécules par criblage par imagerie cellulaire.

Résumé

L’autophagie est un mécanisme central de régulation de l’homéostasie. Les altérations de l’autophagie contribuent aux maladies liées au vieillissement. Des méthodes phénotypiques pour identifier les régulateurs de l’autophagie pourraient être utilisées pour l’identification de nouvelles thérapies. Cet article décrit un flux de criblage par imagerie cellulaire développé pour surveiller le flux autophagique en utilisant LC3 comme rapporteur du flux autophagique (mCherry-EGFP-LC3B) dans les chondrocytes humains. L’acquisition des données est effectuée à l’aide d’un microscope automatisé à haut contenu du système de criblage. Un protocole d’analyse d’images automatisé basé sur un algorithme a été développé et validé pour identifier les molécules activant le flux autophagique. Des étapes critiques, des notes explicatives et des améliorations par rapport aux protocoles actuels de surveillance de l’autophagie sont signalées. Des approches de dépistage phénotypique physiologiquement pertinentes pour cibler les caractéristiques du vieillissement peuvent faciliter des stratégies de découverte de médicaments plus efficaces pour les maladies musculo-squelettiques liées à l’âge.

Introduction

De nombreuses maladies chroniques sont associées aux caractéristiques du vieillissement, notamment l’autophagie défectueuse¹. L’arthrose est la maladie articulaire la plus répandue et a un impact majeur sur la restriction des activités quotidiennes de la population vieillissante, mais ni les mesures préventives ni les traitements modificateurs de la maladie ne sont encore disponibles².

Le vieillissement articulaire et l’arthrose sont associés à des caractéristiques qui définissent la progression de la dégénérescence du cartilage, notamment une autophagie défectueuse et une sénescence ^3,4. Cibler l’autophagie dans les tissus musculo-squelettiques peut aider à trouver des innovations thérapeutiques pour les maladies rhumatologiques ^5,6. La modulation pharmacologique de l’autophagie est un mécanisme prometteur et pertinent pour l’intervention dans les modèles de maladies précliniques⁷. Dans l’arthrose, l’activation de l’autophagie a été utilisée pour prévenir le dysfonctionnement articulaire⁸. Des méthodes de surveillance de l’autophagie basées sur des protocoles robustes et reproductibles qui permettent une analyse quantitative peuvent être utilisées pour identifier de nouveaux agents et faciliter le ciblage pharmacologique des caractéristiques du vieillissement pertinentes pour la maladie.

Le flux d’autophagie reflète l’activité de dégradation et constitue une mesure pertinente pour identifier de nouvelles molécules activant l’autophagie⁹. Cette étude décrit une méthode développée pour déterminer le flux autophagique en mesurant l’activité de dégradation autophagique à l’aide d’une lignée cellulaire rapporteuse d’autophagie dans des chondrocytes humains (TC28a2). L’expression transitoire de mCherry-EGFP-LC3- permet de surveiller simultanément la formation et la dégradation des autolysosomes en quantifiant les différences de sensibilité au pH entre les signaux GFP et mCherry LC3 dans les lysosomes des cellules vivantes¹⁰.

L’adaptation de cette méthode de cytométrie en flux à un système de surveillance d’imagerie d’expression stable dans des chondrocytes vivants pourrait permettre l’identification de molécules activant le flux autophagique dans le contexte de la biologie du cartilage.

Protocole

1. Génération d’une lignée cellulaire rapporteuse d’autophagie de chondrocytes humains immortalisés

REMARQUE : La génération d’une lignée cellulaire rapporteure d’autophagie par transfection stable de pBABE-mCherry-GFP-LC3 par établissement d’une lecture quantitative de cytométrie en flux a été décrite précédemment¹¹. Deux lignées cellulaires ont été utilisées dans la transfection rétrovirale : HEK 293-T17 pendant le processus de cotransfection et T/C28a2 dans l’étape d’infection.

1. Procédé de cotransfection
   1. Préparez le milieu de croissance pour les cellules HEK 293-T17 : 500 ml de milieu essentiel minimum d’Eagle (EMEM), 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Conserver le milieu de culture à 4 °C et le réchauffer à 37 °C avant chaque utilisation.
   2. Semez 1 x 10⁶ cellules HEK 293-T17 par puits dans des plaques de culture cellulaire de 100 mm, incubez à 37 °C et 5 % de CO₂, et assurez-vous qu’elles sont à ~75 % de confluence avant de commencer le processus de cotransfection.
   3. Retirer le milieu de culture, rincer avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et ajouter 8 mL d’EMEM avec 2 % de FBS et 1 % de P/S.
   4. Dans un tube conique, ajouter 10 μg, 3 μg et 7 μg de pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. G et pCL-Eco, respectivement. Ajoutez ensuite 200 μL de milieu sérique 1x réduit (Tableau des matériaux). Ajouter le réactif de transfection (table des matériaux) sous forme de mélange non liposomal de lipides pour avoir un rapport de 1:3 (1 μg d’ADN : 3 μg de réactif de transfection ; volume final = 60 μL).
      REMARQUE : Un total de 20 μg de mélange est préparé pour chaque plaque cellulaire de 10 cm à transfecter.
   5. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante. Transférez délicatement le mélange de transfection goutte à goutte dans les cellules d’emballage HEK 293-T17. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 48 h avant de vérifier l’expression des protéines vertes et rouges par microscopie fluorescente.
      REMARQUE : Dans ces conditions, plus de 75 % des cellules doivent être positives pour la fluorescence. Assurez-vous que l’efficacité de la transfection est élevée (par exemple, plus de 75 % des cellules sont positives). Utilisez de l’ADN plasmidique de haute qualité (p. ex., principalement superenroulé et exempt d’ADN génomique, d’ARN et de protéines ; hautement concentré ; exempt d’endotoxines et de sels) ainsi que des cultures cellulaires de haute qualité (p. ex., homogènes, à faible passage, monocouches, transfectées en phase de croissance exponentielle, exemptes de mycoplasmes).
2. Le jour même de la cotransfection, préparez les chondrocytes T/C28a2.
   1. Préparez le milieu de croissance cellulaire T/C28a2 : 500 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 1 % de P/S. Conserver le milieu de croissance à 4 °C et le réchauffer à 37 °C avant chaque utilisation.
   2. Ensemencer 2 x 10 chondrocytes⁵ T/C28a2 dans deux multiplaques à 6 puits et incuber pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Processus d’infection rétrovirale
   1. Milieu de culture par aspiration à partir de cellules d’emballage rétroviral HEK 293-T17 obtenues à l’étape 1.1.5. Rincer 1 fois avec 4 ml de HBSS et aspirer HBSS.
   2. Ajouter 2 mL de trypsine et attendre 2 min à 37 °C. Neutraliser la trypsine en ajoutant 6 mL de milieu de culture HEK 293-T17 et transférer les cellules et le milieu dans des tubes coniques de 15 mL.
   3. Cellules de centrifugation à 400 x g pendant 5 min. Transfert du surnageant vers un filtre stérile à travers une membrane de 0,45 μm.
   4. Aspirer le milieu de culture chondrocytaire T/C28a2 à partir des multiplaques à 6 puits. Infectez les cellules T/C28a2 en ajoutant 2 ml de suspension virale (étape 1.3.3) par puits dans des multiplaques à 6 puits. Utiliser un puits pour le contrôle (c.-à-d. des cellules non transfectées), en ajoutant 2 mL de milieu de croissance cellulaire T/C28a2 au lieu d’une suspension virale.
   5. Incuber pendant 48 h à 37 °C et 5 % CO₂.
4. Pour effectuer le processus de sélection, utilisez une sélection d’antibiotiques sur les cellules transfectées afin d’éliminer les cellules non transfectées et d’obtenir une population cellulaire homogène.
   REMARQUE : Le vecteur rétroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B confère aux mammifères une résistance aux antibiotiques à la puromycine, ce qui permet de sélectionner une culture cellulaire stable après la transfection virale. Des courbes de destruction pour une concentration optimale en puromycine des chondrocytes T/C28a2 doivent être établies à l’avance afin d’établir les conditions appropriées pour sélectionner les clones cellulaires porteurs du transgène à haut niveau d’expression.
   1. Préparez le milieu de croissance stable de la lignée cellulaire T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B : 500 mL de DMEM, 10 % de FCS, 1 % de P/S et 2,5 μL/mL de puromycine. Conserver le milieu à 4 °C et le réchauffer à 37 °C avant chaque utilisation.
   2. Changez de support. Pour chaque multiplaque à 6 puits, aspirer le milieu de culture, rincer 1 fois avec 2 mL de HBSS et l’aspirer. Ajouter 2 mL de milieu et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂. C’est le début du processus de sélection.
   3. Remplacez le milieu tous les 2 jours et observez les cellules mortes et les populations de cellules résistantes à la puromycine. Comparez les résultats à ceux des cellules témoins non transfectées, qui ne résistent pas à la puromycine et meurent.
5. Pour commencer la sélection clonale, assurez-vous que les populations monoclonales ont augmenté. Pour chaque multiplaque à 6 puits :
   1. Ajouter 200 μL de fluide par puits dans une multiplaque de 96 puits.
      REMARQUE : Chaque cellule sélectionnée dans le multiplaque à 6 puits sera plaquée dans des puits individuels du multiplaque à 96 puits.
   2. À l’aide d’un microscope, identifiez chaque population monoclonale dans les multiplaques à 6 puits. Des colonies formées à partir de cellules uniques peuvent être observées.
   3. Aspirer le milieu de culture à partir de multiplaques à 6 puits, rincer 1 fois avec 2 mL de HBSS et aspirer le HBSS.
   4. Ajoutez 10 μL de trypsine à chaque population monoclonale pour transférer des cellules uniques dans chaque puits des multiplaques à 96 puits. Incuber pendant 48 h à 37 °C et 5 % CO₂.
6. Après 48 h, remplacez le milieu par 100 μL de milieu frais par puits. Répétez cette procédure jusqu’à ce que des colonies se forment en raison de l’expansion de cellules uniques.
7. Une fois qu’une seule cellule s’est bien développée, plaquez chaque population monoclonale dans des puits individuels de 24 puits, 6 puits et 100 mm de plaques de culture cellulaire.
8. Générer une lignée cellulaire monoclonale stable à l’aide d’une méthode de tri unicellulaire.
   1. Aspirer le milieu de culture à partir de plaques de culture cellulaire de 100 mm. Rincez 1x avec 8 mL de HBSS et aspirez-le.
   2. Ajouter 2 mL de trypsine dans chaque assiette et incuber pendant 2 min à 37 °C. Neutraliser la trypsine en ajoutant 8 mL de milieu de culture.
   3. Centrifugez les cellules à 252 x g pendant 5 min et jetez le surnageant. Ajoutez 4 ml de HBSS à chaque pastille cellulaire, remettez-la en suspension avec précaution et transférez-la dans des tubes de cytométrie.
   4. Injectez chaque échantillon de cellule dans un cytomètre en flux (Table des matériaux) avec la technologie de tri cellulaire et séparez les cellules avec une fluorescence verte et rouge élevée.
   5. Transférez les cellules sélectionnées dans des tubes coniques de 15 mL et les cellules de centrifugation à 252 x g pendant 5 min. Ajouter la pastille de cellule dans une fiole T-25 avec 9 mL de milieu de croissance stable de la lignée cellulaire. Incuber à 37 °C et 5 % CO₂.
      REMARQUE : Après le tri cellulaire, trois populations monoclonales (tableau 1) doivent être obtenues.
9. Après 24 h, retirer le milieu et ajouter 8 mL de milieu frais. Répétez cette procédure tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence.
   REMARQUE : Pour étudier le flux autophagique, deux contrôles peuvent être utilisés : la rapamycine comme référence de signal de flux autophagique élevé et la chloroquine comme référence de signal de flux autophagique faible. Préparer une solution mère de rapamycine de 10 mM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et une solution mère de chloroquine de 30 mM dans de l’H₂O et conserver à -20 °C. Pour sélectionner la meilleure population monoclonale en testant l’expression mCherry et GFP, deux méthodes peuvent être utilisées : la cytométrie en flux (étape 1.10) ou l’analyse d’images fluorescentes à haut contenu (étape 1.11).
10. Cytométrie en flux
    1. Ensemencer 2,5 x 10⁵ cellules par puits de chaque population monoclonale dans des plaques de 12 puits au moins 24 h avant le traitement dans 1 mL de milieu de croissance de lignées cellulaires stables et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂.
    2. Le jour du traitement, retirez le milieu, ajoutez 1 mL de milieu de croissance de lignée cellulaire stable complété par 2 % de FCS par puits. Ajouter 10 μM de rapamycine et 30 μM de chloroquine au milieu de croissance stable de la lignée cellulaire avec 2 % de FCS et incuber pendant 16 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
    3. Retirez le support, rincez-le avec 1 mL de HBSS par puits et aspirez-le.
    4. Ajouter 500 μL de trypsine dans chaque puits, incuber 1 min à 37 °C et neutraliser la réaction en ajoutant 500 μL de milieu de culture. Grattez les cellules et transférez-les dans des tubes coniques.
    5. Centrifuger les cellules à 252 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Rincez les granules cellulaires avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger à 252 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
    6. Ajoutez 500 μL de PBS, transférez les cellules dans les tubes de cytométrie et injectez chaque échantillon dans l’équipement de cytométrie. Pour chaque condition, collectez 10 000 événements.
    7. Pour sélectionner la population monoclonale par cytométrie en flux, utilisez un laser de 488 nm pour exciter l’EGFP et un laser de 633 nm pour mCherry. Ensuite, établissez un rapport de fluorescence mCherry et EGFP pour sélectionner la population cellulaire avec un flux autophagique élevé et faible.
11. Analyse d’images fluorescentes à haut contenu
    1. Semez 4 x 10³ cellules de chaque population monoclonale par puits dans des plaques de 384 puits (paroi noire/fond transparent) dans un milieu de croissance complété par 10 % de FCS, 1 % de P/S et 2,5 μL/mL de puromycine. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant le traitement.
    2. Retirer le milieu et ajouter 10 μM de rapamycine et 30 μM de chloroquine dans 50 μL de milieu de croissance de lignées cellulaires stables complété par 2 % de FCS par puits. Incuber pendant 16 h à 37 °C et 5 % CO₂.
    3. Retirez le support, rincez-le avec 50 μL de HBSS par puits et aspirez-le. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à 37 °C. Retirer le PFA et rincer avec 50 μL de HBSS par puits.
    4. Pour identifier les noyaux cellulaires, colorer avec Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) pendant 10 min à 37 °C. Aspirez le colorant Hoechst 33342, rincez avec 50 μL de HBSS par puits et ajoutez 50 μL de PBS par puits.
    5. Effectuer l’acquisition et l’analyse des données du flux autophagique obtenues par la plate-forme HTS comme décrit dans la section 3.
       REMARQUE : Les critères de sélection de la population monoclonale sont basés sur l’augmentation ou la diminution du flux autophagique avec la rapamycine ou la chloroquine, respectivement (tableau 1). Les clones avec des niveaux élevés d’expression de mCherry et de GFP sont plus appropriés pour l’analyse d’images fluorescentes à haut contenu précis, la quantification du flux d’autophagie.

2. Test de flux autophagique basé sur l’image dans des chondrocytes vivants

REMARQUE : Après avoir sélectionné un clone, commencez le test pour quantifier le flux autophagique.

1. À l’aide d’une pipette électronique portative à 384 canaux, ensemencer 4 x 10³ cellules du clone sélectionné (étape 1.11) par puits dans des plaques de 384 puits (paroi noire/fond transparent) dans 50 μL de milieu de croissance de lignées cellulaires stable complété par 10 % de FCS, 1 % P/S et 2,5 μL/mL de puromycine par puits. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant le traitement.
2. Le jour de l’expérience, préparez une plaque d’intervalle pour l’ajout de composé.
   1. Ajoutez un volume de chaque composé/témoin et un milieu de croissance cellulaire stable à la plaque d’intervalle à l’aide de la technologie de manipulation acoustique des liquides et d’une pipette électronique à 384 canaux, respectivement, pour obtenir une concentration d’intervalle.
      REMARQUE : Les témoins de cet essai comprenaient un milieu de croissance de lignées cellulaires stables complété par 2 % de FCS, 30 μM de chloroquine et 10 μM de rapamycine. Les concentrations d’intervalle dépendront de la concentration finale souhaitée. Par exemple, dans cet essai, de la chloroquine et de la rapamycine ont été ajoutées dans 50 μL de milieu de croissance de lignées cellulaires stables par puits pour obtenir une concentration d’intervalle de 300 μM et 100 μM, respectivement.
   2. À l’aide d’un robot laveur de microplaques, aspirer le milieu de la plaque cellulaire de manière automatisée et ajouter 45 μL de milieu de croissance stable de la lignée cellulaire complété par 2 % de FCS par puits.
   3. Transférez ensuite 5 μL par puits de la plaque d’intervalle à la plaque d’essai pour obtenir une concentration finale à l’aide d’un autre poste de travail automatisé de traitement des liquides.
3. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 16 h. À l’aide d’un robot laveur de microplaques, aspirez le fluide.
4. Fixer les cellules avec 50 μL de PFA à 4 % par puits pendant 10 min à 37 °C. Laver avec 50 μL de HBSS par puits.
5. Teindre les noyaux avec du Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) pendant 10 min à 37 °C. Aspirez Hoechst 33342 et rincez avec 50 μL de HBSS par puits.
6. Ajouter 50 μL de PBS par puits. La plaque est maintenant prête pour la lecture, la collecte de données et l’analyse ultérieure.
   REMARQUE : Ce protocole est décrit pour le criblage à haut débit (HTS). Cependant, si peu de composés sont utilisés, ils peuvent être ajoutés manuellement, sans instruments automatiques. La manipulation minimale des cellules et du surnageant à l’aide d’instruments de manipulation de liquides calibrés et/ou de pipettes électroniques facilite la préparation réussie des monocouches de culture cellulaire pour la quantification du flux d’autophagie par analyse d’images fluorescentes à haut contenu.

3. Acquisition de données et analyse des flux autophagiques

1. Pour l’acquisition de données, utilisez un système de criblage à haut contenu (HCS) et un microscope automatisé, qui permet l’acquisition et l’analyse automatisées d’images par algorithme de traitement d’images.
2. Pour élaborer un protocole d’acquisition, il faut sélectionner plusieurs canaux et temps d’exposition (Tableau 2) pour identifier les noyaux et la formation des autophagosomes et des autolysosomes lors d’événements de flux autophagiques.
3. Pour chaque puits, collectez des images à partir de quatre champs couvrant la surface du puits et dans quatre piles à partir de 8 μm séparées par une distance de travail de 0,2 μm. Capturez les images à l’aide d’un objectif 60x pour une imagerie cellulaire détaillée.
4. Analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse d’images fourni par le microscope HCS. Pour développer un algorithme de protocole d’analyse robuste pour la surveillance des flux d’autophagie, sélectionnez la méthode la plus appropriée pour la segmentation automatisée de l’image cellulaire et pour la détection spécifique des taches correspondant à l’activation de LC3. Effectuez la séquence d’analyse finale en ajoutant des méthodes, des étapes de segmentation cellulaire et des instructions de quantification comme décrit ci-dessous :
   1. Cliquez sur le bloc de construction Trouver des noyaux et choisissez le canal de colorant nucléaire Hoechst 33342. Sélectionnez Méthode et choisissez les noyaux de remplissage de sortie.
   2. Cliquez sur le bloc de construction Trouver le cytoplasme et choisissez le canal de colorant cytoplasmique Fluorescéine. Sélectionner une méthode | Seuil individuel.
   3. Cliquez sur le bloc de construction Trouver le cytoplasme (2) et choisissez l’appel d’offres du canal de colorant cytoplasmique. Sélectionner une méthode | Seuil individuel.
   4. Cliquez sur le bloc de construction Population et sélectionnez les noyaux de population à l’étude. Sélectionnez la méthode Filtres communs (Supprimer les objets de bordure) et choisissez la population de sortie Nuclei Inside Borders.
   5. Cliquez sur le bloc de construction Rechercher des points et choisissez le canal de marqueur spécifique Fluorescéine. Sélectionnez la population d’étude Noyaux à l’intérieur des frontières et sélectionnez la région d’étude Cytoplasme. Sélectionnez Méthode et choisissez la population de sortie Spots Inside Borders.
   6. Cliquez sur le bloc de construction Rechercher des points (2) et choisissez l’appel d’offres de canal de marqueur spécifique. Sélectionnez la population d’étude Noyaux à l’intérieur des frontières et sélectionnez la région d’étude Cytoplasme (2). Sélectionnez Méthode et choisissez la population de sortie Spots (2) Inside Borders.
   7. Cliquez sur le bloc de construction Calculer les propriétés d’intensité et choisissez le canal de marqueur spécifique Fluorescéine. Sélectionnez la population d’étude Nuclei Inside Borders et sélectionnez la région d’étude Spot. Sélectionnez Méthode et choisissez les propriétés de sortie Intensité Spot Fluorescéine Inside Borders.
   8. Cliquez sur le bloc de construction Calculer les propriétés d’intensité et choisissez l’appel d’offres de canal de marqueur spécifique. Sélectionnez la population d’étude Nuclei Inside Borders et sélectionnez la région d’étude Spot (2). Sélectionnez Méthode et choisissez les propriétés de sortie Intensité Spot (2) RFP Inside Borders.
   9. Cliquez sur le bloc de construction Définir les résultats , sélectionnez Noyaux de population à l’intérieur des frontières, sélectionnez Nombre d’objets des noyaux (moyenne), sélectionnez Taches d’intensité relative Fluorescéine – moyenne par puits, et sélectionnez Taches d’intensité relative (2) – RFP – moyenne par puits.
5. Pour quantifier le flux autophagique, utilisez la même méthode que celle décrite précédemment pour l’analyse par cytométrie en flux¹¹. Établissez le rapport mCherry/EGFP des taches d’intensité relative.
   REMARQUE : Les cellules avec un flux plus élevé sont moins vertes, ce qui augmente le rapport mCherry/EGFP dans la cellule. Il est très important d’identifier et de quantifier avec précision un nombre significatif de signaux pertinents provenant des événements de flux d’autophagie dans les cellules pour établir des différences statistiquement significatives.

Résultats

Le flux autophagique peut être surveillé dans les cellules par modulation pharmacologique ou par réponse au stress cellulaire. Des chondrocytes humains inmortalisés (T/C28a2) ont été utilisés pour développer une lignée cellulaire rapporteure d’autophagie en utilisant LC3 comme rapporteur fluorescent (mCherry-EGFP-LC3B) pour l’autophagie. La figure 1 montre le déroulement schématique de l’essai de dépistage depuis le développement de la lignée cellulaire rapporteuse d’autophagie dans les chon...

Discussion

L’autophagie défectueuse est une caractéristique importante de la dégénérescence articulaire liée au vieillissement, mais il n’existe pas encore de traitements préventifs ou modificateurs de la maladie ciblant l’autophagie pour la dégénérescence du cartilage². Compte tenu de sa pertinence et de ses implications cliniques, l’autophagie est devenue une cible d’intérêt pour la découverte et le développement de médicaments, bien que les méthodes permettant de surveill...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture cellulaire 100 mm	Corning	430167	Plaque de culture cellulaire
Multiplaque 12 puits	Corning	353043	Plaque de culture cellulaire
15 mL Centrifugeuse tube conique	Falcon-Corning	352095	Centrifugeuse Tube conique
24 puits	Corning	351147	Plaque de culture cellulaire
25 cm2 Flacon	de culture cellulaireFalcon-Corning	353014	Flacon de culture cellulaire
multiplaque 384 puits Porte-cellules	Perkin Elmer	6007550	Plaque de culture cellulaire
Multiplaque 6 puits	Corning	351146	Plaque de culture cellulaire
Multiplaque 96 puits	Corning	353077	Plaque de culture cellulaire
Technologie acoustique de manipulation des liquides	Labcyte	&minus ;	https://www.labcyte.com
Chloroquine	Sigma-Aldrich	C6628	inhibiteur de flux autophagique
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D2650	Disolvant
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Lonza, Basel, Switzerland	BE-604F	T/C28a2 Milieu
de croissance Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC	30&ndash ; 2003	HEK 293-T17 milieu de croissance
FACScalibur cytomètre	Becton Dickinson, CA	&minus ;	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F9665	HEK 293-T17 sérum
fœtal de veau (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010&ndash ; 074	Sérum
FuGene	Promega	E2691	Un mélange non liposomal de lipides comme méthode d’administration de plasmides pour créer une lignée cellulaire autophagie signalée
Pipette électronique portable à 384 canaux	Integra	&minus ;	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Tampon Sigma-Aldrich	H6648
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	Lignée cellulaire rénale. Des cellules ont été utilisées pour faciliter l’emballage rétroviral
Système de dépistage à haut contenu	Perkin Elmer	&minus ;	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	Coloration de l’ADN
Logiciel d’analyse d’images	Perkin Elmer	&minus ;	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Poste de travail pour le traitement des liquides	Perkin Elmer	&minus ;	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Robot laveur de microplaques	Biotek	&minus ;	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® ; (1 fois)	Thermo Fisher Scientific	11058	Milieu de transfection
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Cambridge, MA	22418	Plasmide
pCL-Eco	Addgene, Cambridge, MA	12371	Plasmide
Pénicilline-Streptomycine (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Antibiotique
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	MP Biomedicals	2810305	tampon
Puromycine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P8833	Antibiotique
Rapamycine	Calbiochem, Allemagne	5053210	activateur de flux autophagique
Logiciel CellQuestPro	Becton Dickinson	&minus ;	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Filtres pour seringue 0,45 &mu ; m	Corning	CLS431220	Filtre stérile
T/C28a2	&minus ;	&minus ;	Lignée cellulaire de chondrocytes humains
Trypsine	Gibco par Life Technologies, CA	15400054	Trypsine utilisée avec les cellules T/C28a2
Trypsine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	Trypsine utilisée avec les cellules HEK 293-T17
VSV. G	Addgene, Cambridge, MA	14888	Plasmide