Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.

Résumé

La capacité de maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome (homéostasie des protéines) diminue au cours du vieillissement normal, facilitant l’apparition d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, les protéines avec des expansions de polyglutamine sont sujettes à l’agrégation, comme en témoigne la protéine huntingtine et l’apparition concomitante de la maladie de Huntington. La détérioration du protéome associée à l’âge a été largement étudiée grâce à l’utilisation de Caenorhabditis elegans transgénique exprimant des répétitions polyQ fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce modèle animal transgénique polyQ::YFP facilite la quantification directe du déclin du protéome associé à l’âge en imageant la formation progressive de foyers fluorescents (c.-à-d. les agrégats de protéines) et l’apparition subséquente de défauts de locomotion qui se développent à la suite de l’effondrement du protéome. De plus, l’expression du transgène polyQ::YFP peut être entraînée par des promoteurs spécifiques aux tissus, ce qui permet d’évaluer la protéostase à travers les tissus dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Ce modèle se prête très bien à l’analyse génétique, fournissant ainsi une approche pour quantifier le vieillissement qui est complémentaire aux tests de durée de vie. Nous décrivons comment mesurer avec précision la formation de foyers polyQ::YFP dans les neurones ou les muscles de la paroi corporelle pendant le vieillissement, et l’apparition ultérieure de défauts de comportement. Ensuite, nous soulignons comment ces approches peuvent être adaptées pour un débit plus élevé et des applications futures potentielles en utilisant d’autres stratégies émergentes pour l’analyse génétique de C. elegans.

Introduction

L’homéostasie protéique (protéostasie) est définie comme la capacité cellulaire à maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome. Le défi inhérent à la protéostasie est de s’assurer que toutes les protéines sont correctement repliées et maintenues dans une conformation native, qui est encore amplifiée par la nature variée de la taille des protéines, de la composition en acides aminés, de la conformation structurelle, de la stabilité, du renouvellement, de l’expression, du compartimentation subcellulaire et des modifications¹. La protéostasie est maintenue grâce à l’action coordonnée d’un grand réseau protéostatique, composé d’envi....

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Sélectionner les gènes d’intérêt à inactiver via l’ARNi basé sur l’alimentation. Acheter des stocks de HT115 E. coli contenant le clone d’ARNi d’intérêt²⁰. Alternativement, sous-clonez l’ADNc du gène d’intérêt dans le site de multicloning du plasmide L4440.
   REMARQUE: Pour éviter la dégradation de l’ARNds dans les bactéries, utilisez la souche HT115. Il s’agit d’une souche d’E. coli déficiente en RNase III avec une activité polymérase T7 inductible IPTG. Pour les études de protéostasie qui n’utilisent pas d’ARNi à base d’alimentation, HT115 ou OP50 E. coli sur des plaques NGM st....

Résultats

Chez C. elegans, le modèle de répétition de la polyglutamine a joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes qui régulent le réseau protéostatique. Par exemple, nous avons précédemment montré que la protéine kinase interagissant avec l’homéodomaine(hpk-1),un cofacteur transcriptionnel, influence la protéostase au cours du vieillissement en régulant l’expression de l’autophagie et des chaperons moléculaires^31. Nous avons constaté que la perte de hpk-1,soit par .......

Discussion

Le vieillissement se caractérise par un déclin progressif de la protéostasie. La protéostasie est maintenue par un système complexe, le réseau protéostatique, pour le contrôle coordonné, dynamique et sensible au stress du repliement, de la dégradation et de la traduction des protéines. La raison pour laquelle la protéostase échoue au cours du vieillissement est mal comprise, mais un épigénome en décomposition, une diminution de l’inductibilité des réponses au stress et une perte de diaphonie compensatoire coïncident tous.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture 24 puits	Greiner Bio-One	#662102
2 mL Plaques 96 puits	Greiner Bio-One	#780286
600 µ ; L Plaques 96 puits	Greiner Bio-One	#786261
Réplicateur de plaques 96 broches	Nunc	250520
Joint de plaque perméable à l’air	VWR	60941-086
gélose bactériologique	Affymetrix/USB	10906
bacto-peptone	VWR	90000-368
Bibliothèque de clones ARNi de C. elegans dans la bactérie HT115 - Ahringer	Source : Bioscience	C. elegans, RNAi Collection (Ahringer)	Voir aussi Kamath et al, Nature, 2003.
Bibliothèque de clones ARNi de C. elegans dans la bactérie HT115- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	Voir aussi Rual et. al, Genome Research 2004. Cette bibliothèque est également disponible auprès de Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-désoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
Lames de microscope en verre	VWR	48404-455
Lames de microscope en verre	VWR	160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)	Gold Bio	12481C100
Plaque monopuits retangulaire non traitée, 128x86mm	Thermo-Fisher
Azoture de sodium, CAS #26628-22-8	Sigma-Aldrich	S2002
Microscope Zeiss Axio Imager M2m avec logiciel AxioVision v4.8.2.0	Zeiss	inconnu
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Microscope Quad	Zeiss	inconnu