Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Redressening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Résumé

Worm-align/Worm_CP est un flux de travail simple FIJI/CellProfiler qui peut être utilisé pour redresser et aligner les échantillons de Caenorhabditis elegans et pour marquer des analyses basées sur l’image de vers entiers sans avoir besoin d’étapes de formation préalables. Nous avons appliqué worm-align/Worm_CP à la quantification de l’expression induite par le choc thermique chez les animaux vivants ou les gouttelettes lipidiques dans des échantillons fixes.

Résumé

Un problème souvent rencontré lors de l’acquisition de données d’image à partir fixe ou anesthésiée C. elegans est que les vers se croisent et se regroupent avec leurs voisins. Ce problème est aggravé par l’augmentation de la densité des vers et crée des défis pour l’imagerie et la quantification. Nous avons développé un workflow basé sur fidji, Worm-align, qui peut être utilisé pour générer des montages monocanaux ou multicanaux de vers sélectionnés par l’utilisateur, redressés et alignés à partir de données d’image brutes de C. elegans. Worm-align est un flux de travail simple et convivial qui ne nécessite aucune formation préalable de l’utilisateur ou de l’algorithme d’analyse. Les montages générés avec Worm-align peuvent faciliter l’inspection visuelle des vers, leur classification et leur représentation. En outre, la sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure de l’intensité de fluorescence chez les vers simples, soit en FIDJI directement, ou dans d’autres plates-formes logicielles d’analyse d’image. Nous le démontrons en important la sortie Worm-align en Worm_CP, un pipeline qui utilise le logiciel open-source CellProfiler. La flexibilité de CellProfiler permet l’incorporation de modules supplémentaires pour le criblage à haute teneur. À titre d’exemple pratique, nous avons utilisé le pipeline sur deux ensembles de données : le premier ensemble de données sont des images de vers reporter de choc thermique qui expriment des protéines fluorescentes vertes (GFP) sous le contrôle du promoteur d’un gène inductible de choc thermique hsp-70, et le deuxième ensemble de données sont des images obtenues à partir de vers fixes, tachés pour les réserves de graisse avec un colorant fluorescent.

Introduction

Un organisme relativement simple, le nématode C. elegans, est un système modèle extrêmement utile pour étudier les maladies humaines. Environ 38% des gènes du génome de C. elegans ont des homologues fonctionnels chez l’homme^1,2. Une des caractéristiques uniques de C. elegans est qu’il est optiquement transparent, permettant un accès facile à l’information in vivo concernant (sous) l’expression cellulaire des reporters fluorescents à travers les tissus. Cela fait de C. elegans un organisme modèle de premier choix pour les écrans à haute teneur utilisant des plates-formes basées sur l’image³. Cependant, une question qui complique souvent ces études est que lorsque l’imagerie des populations denses de vers, ils ont tendance à se croiser et à se regrouper, ce qui rend les comparaisons entre les vers individuels difficiles, obscurcissant l’analyse de l’image en aval et la quantitation.

Les solutions existantes qui surmontent ce problème reposent généralement sur l’optimisation du protocole de culture et d’imagerie, par exemple par l’utilisation de configurations micro-fluidiques^4,permettant de capturer des vers uniques dans des images^{distinctes 5,6}. D’autres ont appliqué des algorithmes d’apprentissage automatique permettant la reconnaissance de vers simples, même dans une population agglutiné. Un excellent exemple de ce dernier est le WormToolbox, qui est une extension modulaire de la plate-forme d’analyse d’image open-source, CellProfiler⁷. WormToolbox offre une solution à haut débit et à haute teneur pour l’analyse de C. elegans, et bénéficie clairement de son inclusion dans CellProfiler, car des modules d’analyse supplémentaires peuvent facilement être inclus. Bien que WormToolbox soit livré avec un modèle pré-formé (DefaultWormModel.xml), le recyclage de l’algorithme d’apprentissage automatique est généralement nécessaire pour chaque nouvelle application. Des tutoriels en ligne sur la façon de le faire sont disponibles sur Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Malgré cela, l’installation et l’utilisation de WormToolbox nécessite un investissement de temps important pour les utilisateurs novices.

Ici, nous décrivons un protocole simple et rentable et rentable à la culture, et les populations d’image de C. elegans. Pour permettre l’évaluation des vers individuels dans les images acquises, nous avons développé un flux de travail simple basé sur les FIDJI open-source, nommé Worm-align. L’alignement des vers peut être utilisé pour générer des montages monocanaux ou multicanaux de vers redressés et alignés. Tout d’abord, l’utilisateur doit sélectionner manuellement les vers individuels pour analyse en dessinant une ligne de la tête à la queue. Worm-align utilisera cette sélection pour recadrer les vers sélectionnés à partir de l’image d’aperçu, et générer un montage dans lequel les vers sélectionnés sont redressés et alignés pour faciliter la comparaison visuelle et la présentation.

En outre, la sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure de l’intensité de fluorescence chez les vers simples, soit en FIDJI directement, ou dans d’autres plates-formes logicielles d’analyse d’image. Nous le démontrons en important la sortie Worm-align en Worm_CP, un pipeline qui utilise le logiciel open-source CellProfiler. La flexibilité de CellProfiler permet l’incorporation de modules supplémentaires pour le criblage à haute teneur. Nous avons utilisé le pipeline Worm_CP pour quantifier la réponse aux chocs thermiques, un mécanisme de protection bien conservé qui refolds protéines qui sont mal dépliées en raison de facteurs de stress tels que la température élevée⁸. Plus précisément, nous avons appliqué le pipeline aux vers transportant un transgène intégré à copies multiples, où le promoteur d’un gène inductible de choc thermique, hsp-70 (C12C8.1), conduit la protéine fluorescente verte (GFP)⁹. Nous avons également utilisé le pipeline Worm_CP sur des animaux fixes qui ont été étiquetés avec un colorant fluorescent qui visualise les gouttelettes lipidiques (LD), l’organelle principale de stockage des graisses dans C. elegans¹⁰. Bien que ce flux de travail n’a pas le débit offert par WormToolBox, il est une alternative conviviale et simple pour la présentation visuelle et l’analyse d’expériences C. elegans basées sur l’image.

Protocole

1. Fixation des vers pour l’imagerie à teneur en matières grasses à l’aide d’un colorant fluorescent pour les gouttelettes lipidiques (BODIPY)¹⁰

1. Préparer une population synchronisée de C. elegans en blanchissant selon les procédures standard². Plaquez environ 1 000 vers l1 sur une plaque de 9 cm de nématode par condition.
   REMARQUE : Plus de vers sont préparés qu’en fait quantifiés à la fin, en raison de la perte de vers lors de la manipulation.
2. Pour imager les animaux au stade des jeunes adultes (environ 50 h après le placage L1 à 20 °C), lavez chaque assiette de 9 cm avec 15 mL de M9 dans un tube conique, centrifugeuse à 252 x g pendant 1 min, et retirez le surnatant.
3. Répétez le lavage et laissez 1 mL de M9 sur la pastille de vers.
4. Transférer 1 mL de M9 contenant les vers dans un tube de microcentrifugeuse liant à faible teneur en protéines de 2 mL, à l’aide de bas conseils de rétention.
5. Tournez vers le bas à 252 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min et retirez le supernatant, en prenant soin de ne pas toucher la pastille de ver au fond du tube.
6. Pour surveiller la teneur en matières grasses en utilisant 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) tacher¹⁰ (Tableau des matériaux), fixer les vers soit en ajoutant 0,5 mL de 60% d’isopropanol à la pastille de ver pendant 3 min¹¹, ou en ajoutant 2 mL de méthanol glacé pendant 10 min. Pour les deux procédures, inverser le tube tous les 30 s.
   ATTENTION : Si le méthanol est le réaccente de fixation choisi, cette étape doit être entreprise dans un capot de fumée en raison de sa toxicité.
7. Retirer autant de fixatif que possible sans toucher la pastille de ver et ajouter 1 mL de M9. Laisser les vers s’installer au fond du tube pendant 3−5 min.
8. Laver à nouveau avec 1 mL de M9, laisser les vers se déposer et enlever le surnatant, en laissant environ 50 μL dans le tube. Fixer le tube à l’aide d’une pince.
9. Casser les vers en plongeant le tube solidement fermé dans de l’azote liquide, puis dans un bain d’eau chaude à ~40 °C.
10. Répétez l’étape 1.9 une fois de plus.
11. Ajouter 0,5 mL de BODIPY dilué dans M9 à une concentration finale de 1 μg/μL et placer sur un rotateur à température ambiante pendant 1 h.
12. Après 1 h, laisser les vers s’installer au fond du tube pendant 3−5 min.
13. Retirer le supernatant et ajouter 1 mL de M9.
14. Laissez les vers s’installer au fond et enlever le surnatant.
    REMARQUE: Alternativement, il est possible de tourner vers le bas à 252 x g pendant 1 min, car cela ne semble pas affecter la morphologie.
15. Ajouter 0,5 mL de M9.
    REMARQUE : Si le fixatif est isopropanol à 60 %, les vers ne peuvent être utilisés que dans les 48 h. Si le fixatif est le méthanol, les vers doivent être utilisés dans les 24h.

2. Préparation de coussinets d’agarose pour monter les vers

REMARQUE : L’étape critique lors de la préparation d’un coussin agarose consiste à obtenir un tampon d’épaisseur régulière. Sinon, les vers à travers le pad seront dans différents plans focaux, ce qui rend difficile d’obtenir une image ciblée d’un champ de vision plus large.

1. Préparer 2 % de coussinets d’agarose en ajoutant 0,2 g d’agarose à 10 mL de H₂O stérilisé dans un bécher ou un flacon conique. Chauffer au micro-ondes pendant 30 s jusqu’à ce que l’agarose commence à bouillir.
   REMARQUE : Ne surchauffez pas et ne vous arrêtez pas dès que des bulles apparaissent; sinon, il augmente la viscosité de l’agarose, ce qui rend plus difficile d’atteindre l’épaisseur de la garniture désirée.
2. Une fois l’agarose fondue, distribuez une goutte d’agarose fondue au centre d’une lame de verre au microscope à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL avec sa coupe très fin. Immédiatement, mais délicatement, tenir une autre glissière de verre très près de la goutte d’agarose et le libérer sur l’agarose pour former un tampon d’épaisseur régulière pour de meilleurs résultats de microscopie.
   REMARQUE : Libérer la glissière supérieure d’une hauteur formera non seulement des bulles, mais entraînera également un pad inégal. Alternativement, il est également possible d’utiliser deux glissières en verre flanquant la glissière avec le tampon, avec une fine couche de ruban adhésif sur chaque diapositive.
3. Après un minimum de 2−3 min, retirer délicatement la lame supérieure. À l’aide du côté de la glissière supérieure, coupez la garniture pour la rendre carrée. Montez les vers dans les 5 minutes, pour empêcher le tampon de sécher avant utilisation.

3. Montage de vers fixes pour l’imagerie

1. Créez une micropipette buccale en étendant un mince capillaire en verre dans la flamme d’un brûleur Bunsen (Figure 1A). Après l’extension de la flamme, briser le capillaire en deux morceaux (Figure 1B). Choisissez le plus adéquat, généralement le plus long, et testez si l’extrémité du capillaire est ouverte en essayant d’aspirer l’eau.
   REMARQUE : Si le liquide n’entre pas dans le capillaire, il est trop mince ou bloqué. Couper délicatement l’extrémité du capillaire avec une paire de ciseaux, en évitant de couper trop que les vers seront aspirés si le trou est trop grand.
2. Branchez le capillaire en verre de l’étape 3.1 dans l’adaptateur capillaire (Figure 1C), relié au tube de silicone de 6 mm et branchez l’autre extrémité du tube de silicone de 6 mm dans un filtre de 0,2 μm, attaché à un tube de silicone de 3 mm à son autre extrémité (figure 1C). Branchez une pointe de filtre de 1 mL(figure 1C)dans l’extrémité libre du tube de silicone de 3 mm pour aspirer le liquide.
   REMARQUE : Le filtre de 0,2 μm est ajouté entre la bouche de l’expérimentateur et le capillaire, afin d’assurer une sécurité maximale de l’expérimentateur. Une solution similaire est utilisée pour les micropipettes buccaes utilisées pour manipuler les embryons de souris¹². Changer le filtre (généralement tous les quelques mois) si la micropipette buccae n’aspire plus de liquide.
3. À l’aide de la micropipette buccae au microscope à dissection, retirer le plus de liquide possible autour de la pastille de ver de vers fixes (figure 2).
   REMARQUE: Pipetting supernatant à l’aide d’une micropipette manuelle peut être utilisé comme une alternative aux pipettes buccarienne dans les étapes 3.1 à 3.3 pour enlever autant de supernatant que possible. Ajouter 6 μL de support de montage. Nous constatons, cependant, que cette méthode ne fonctionne pas aussi efficacement parce que le liquide excessif dans les garnitures crée une densité clairsemée de ver, qui rend l’imagerie plus longue. Reprendre l’étape 3.6. Regardez le fond du tube et assurez-vous que la pipette n’aspire pas les vers.
4. Ajouter rapidement 10 μL de support de montage(Table of Materials)au fond du tube.
5. Rincer une pointe de 10 μL dans pbs avec des traces de détergent (0,01% Triton), pour empêcher les vers de coller sur les côtés de la pointe de pipette en plastique. Couper l’extrémité de la pointe avec une paire de ciseaux.
6. Transférer 8 μL de milieu de montage contenant les vers sur la garniture d’agarose préparée à l’étape 2.3. Sous le microscope, secouez doucement la lame, pour éviter le chevauchement des vers.
7. Couvrez la goutte de milieu de montage sur la garniture d’agarose avec un coverslip de 18 mm x 18 mm (figure 3).
   REMARQUE : Les couvertures plus petites sont préférées car elles exercent moins de pression sur les vers. Tenez le coverslip avec une paire de pinces à épiler et appliquez un bord du coverslip contre la garniture d’agarose, avant de déposer doucement le coverslip avec les pinces.

4. Montage de vers vivants pour l’imagerie

REMARQUE : Pour imager les vers vivants, ils doivent être immobilisés sur la garniture. Une façon d’y parvenir est de les paralyser avec l’agoniste récepteur nicotinique: levamisole (Tableau des matériaux).

1. Pipette 3−4 μL de levamisole de 3 mM dissoute en M9 sur la garniture d’agarose créée à l’étape 2.3.
   REMARQUE: Il devrait y avoir suffisamment de volume liquide que les vers ne sont pas sur le dessus de l’autre, mais pas trop de liquide que les vers sont trop clairsemés sur la garniture. Les cueilleurs de vers expérimentés peuvent utiliser 3 μL de levamisole. Les cueilleurs moins expérimentés pourraient avoir besoin d’ajouter un plus grand volume de levamisole, de sorte que le levamisole ne s’évapore pas totalement.
2. Choisissez 30−50 vers par condition dans la goutte de levamisole.
3. Couvrir la goutte de levamisole sur la garniture agarose d’un couvre-bloc de 18 mm x 18 mm. Vers d’image dans les 1 h, comme l’agent paralysant finira par conduire à la mort des vers.

5. Diapositives d’imagerie avec un microscope d’épifluorescence

1. Avec une garniture d’agarose d’épaisseur uniforme, imagez tous les vers sur la glissière à la fois à l’aide d’une image de 6 x 6 ou 7 x 7 de grande taille par exemple avec l’objectif 20x d’un microscope fluorescent. Si l’épaisseur de la garniture n’est même pas, acquérir plusieurs images plus petites 3 x 3 ou 4 x 4 de la même diapositive.
2. Utilisez les mêmes paramètres pour l’intensité de fluorescence et le temps d’exposition pour toutes les conditions. Ajustez chaque paramètre pour correspondre à la diapositive qui a la plus forte intensité, en s’assurant qu’il n’y a pas de saturation des pixels. Pour des instructions spécifiques sur l’acquisition d’images, suivez les instructions du fabricant de microscopes.

6. Création d’images de montage de vers simples alignés à l’aide du pipeline FIJI alignant le ver

1. Installez le logiciel d’analyse d’images open-source FIJI¹³/ImageJ¹⁴ à partir de https://imagej.net/Fiji. Si une installation antérieure de FIJI est disponible, assurez-vous qu’elle est mise à jour vers la version 1.52a ou plus tard, car certaines des fonctions utilisées dans la macro (par exemple, les fonctions de table) l’exigent. Téléchargez la macro Worm-align de Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. Ouvrez FIJI et exécutez la macro Worm-align. Exécutez Worm-align en cliquant sur Plugins | Macros | Courez dans la barre de menu principal FIJI (Figure S1). Maintenant, localisez le script Worm-align.ijm sur l’ordinateur.
3. La macro s’initialise en demandant l’emplacement des images. Le pipeline fonctionnera à la fois sur des images de fluorescence monocanal et multicanal (Figure S2). Sélectionnez un dossier d’entrée et la macro génère automatiquement un dossier de sortie où tous les résultats seront enregistrés (Figure S3).
   REMARQUE : Il est important que le dossier sélectionné ne contienne que des fichiers d’image, car la présence d’autres formats de fichiers provoquera un plantage de la macro. Idéalement, ne regroupez que les images capturées avec les mêmes paramètres de microscope. Worm-align acceptera de nombreux formats de fichiers différents, y compris nd2, czi, tif, rgb, jpg et png. Le nom du dossier de sortie sera le même que le dossier d’entrée, avec « _output » ajouté comme postfixe, c’est-à-dire si le dossier d’entrée est « images », la sortie sera trouvée dans « images_output ». Le dossier de sortie contiendra quatre sous-folders, dans lesquels les données seront enregistrées.
4. Permettez à la macro de procéder à l’ouverture de la première image dans le dossier d’entrée et de l’utiliser comme une image représentative pour extraire un paramètre pour générer le montage.
   REMARQUE : Worm-align sélectionnera automatiquement la première image dans le dossier d’entrée pour générer les paramètres qui seront appliqués à toutes les autres images du dossier. Si une autre image est considérée comme plus représentative de l’ensemble de données, assurez-vous que cette image est sélectionnée en sauvant une copie de l’image dans le dossier d’entrée, en changeant le nom de sorte qu’il est maintenant répertorié en haut de la liste (par exemple, « 0_RepresentativeImage »).
5. Avec l’outil de dessin en ligne droite, tracez une ligne sur toute la largeur d’un ver (Figure S4) et utilisez la longueur de cette ligne pour déterminer la hauteur des régions cultivées pour les vers simples. Pour chaque canal, spécifiez le nom, la table de recherche (LUT), les paramètres d’intensité (B&C) et s’il doit être inclus dans le montage (Figure S4).
   REMARQUE : Ces paramètres sont enregistrés et enregistrés dans un fichier de paramètres, Paramètres.csv, situé dans le sous-fichier CellProfiler du dossier de sortie.
6. Une fois que tous les paramètres ont été capturés, l’utilisateur est montré à quoi ressembleront les images après l’application des paramètres appliqués (Figure S5). Cochez la case supérieure si les paramètres sont suffisants. Sélectionnez des options pour la génération de montage (supprimer les tiques, si ce n’est pas nécessaire) : 1. Générer un montage de vers sélectionnés pour chaque image, ou 2. Générer un montage combiné dans lequel tous les vers sélectionnés sur toutes les images du dossier d’entrée seront combinés en un seul montage. Cliquez sur OK pour exécuter le reste de la macro.
   REMARQUE : Si la case supérieure n’est pas cochée avant de cliquer sur « OK », la macro réexécutera la configuration, de sorte que les paramètres d’image peuvent être optimisés.
7. Le pipeline Worm-align ouvre désormais toutes les images du dossier d’entrée. Pour chaque image, tracez des lignes sur l’axe longitudinal de tous les vers à inclure dans le montage et/ou à quantifier (Figure 4 et Figure S6) à l’aide de l’outil « ligne segmentée » (sur la barre de menu principale FIJI). Pour assurer un bon alignement du ver, tracez les lignes uniformément de la tête à l’extrémité arrière (ou vice versa), et le long de toute la longueur du ver (voir des exemples de « bon » et de « mauvais » dessin de ligne dans la figure 4B).
8. Ajouter chaque ligne au gestionnaire de retour sur investissement,en cliquant sur Ctrl+T. Worm-align utilise les lignes ajoutées au gestionnaire roi, en combinaison avec le paramètre de largeur de ver (défini à l’étape 6.4) pour générer des images recadrées de vers sélectionnés simples. La collecte d’IA de ligne est sauvegardée dans le sous-foldeur « données ». Ce dossier contient également une copie de l’image originale montrant les lignes, ainsi que le nombre du ver. Les lignes sont codées en couleur avec Glasbey_on_dark table de recherchez. Les images des vers redressés sont enregistrées dans le single_worms du dossier de sortie. En outre, s’il est sélectionné à l’étape 6.6 de ce protocole, Worm-align produit des montages de tous les vers sélectionnés par image de vue d’ensemble et/ou pour toutes les images d’aperçu dans le dossier d’entrée (voir figure 4C et figure S7). Ces montages se trouvent dans le sous-ensemble « aligné » du dossier de sortie.

7. Analyser l’intensité de fluorescence d’un seul ver à l’aide de la sortie de Worm-align dans un pipeline cellprofiler automatisé

1. Pour le traitement et l’analyse des données en aval de la sortie Worm-align, téléchargez et installez le logiciel d’analyse d’images open-source 'CellProfiler^15,16 de https://cellprofiler.org/. Téléchargez le pipeline Worm_CP.cpproj à partir de GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   REMARQUE : L’exemple de pipeline décrit ici a été construit à l’aide de CellProfiler2.2.0 et pourrait ne pas s’exécuter dans les versions ultérieures de CellProfiler.
2. Avant de commencer le pipeline Worms_CP.cpproj, s’assurer que toutes les images de sortie attendues sont présentes dans le sous-fichier CellProfiler du dossier de sortie Worm-align : une copie traitée de l’image originale (nommée : Original_), un masque d’image binaire de la population de vers (nommé : Mask_), un masque de ligne des lignes dessinées sur des vers sélectionnés (nommés : Lines_), et une image représentant chacun des canaux présents dans l’image originale (nommée par numéro de canal).
3. Pour quantifier l’intensité de fluorescence dans les vers simples, cliquez sur le module d’entrée Images et faites simplement glisser le dossier de sortie CellProfiler dans la fenêtre qui indique fichiers drop et dossiers ici. Si une liste d’images est présente à partir d’une analyse précédente, supprimez-les d’abord en cliquant à droite dans la fenêtre et en sélectionnant clear file list. Pour exclure le fichier 'Paramètres.csv' de la liste des images, sélectionnez 'Images only' ou 'Custom' avec 'Extension is tif, tiff, ome.tif, ou ome.tiff' pour les paramètres du filtre(Figure S8).
4. Cliquez sur le module d’entrée Métadonnées. Dans la deuxième méthode d’extraction, cliquez sur le dossier jaune et localisez le sous-fichier CellProfiler dans le dossier de sortie WormAlign ( FigureS9). Sélectionnez les paramètres.csv fichier et reliez les paramètres du fichier à la sortie CellProfiler en faisant correspondre les métadonnées dans les fichiers CSV à celles des images (métadonnées canal).
5. Cliquez sur le module d’entrée NamesAndTypes et insérez une nouvelle image pour que chaque canal de l’image originale soit quantifié.
   REMARQUE : Déjà présents dans le pipeline d’exemple sont le masque de ver, deux images de couleur, le masque de ligne et l’image originale, et trois images grises d’échelle (le canal vert et le canal rouge). La liste de ce module doit être ajustée si les images d’origine ont plus ou moins de canaux que les images d’exemple.
6. Vérifiez que le nom des images dans chaque étiquette de colonne/masque/vers est correct.
   REMARQUE : Les noms des images sur une ligne doivent tous correspondre à la même image initiale à analyser. Si une erreur est commise au cours du processus d’analyse d’image, certaines des images de sortie seront manquantes et les noms sous l’étiquette/masque/vers des trois colonnes ne correspondront plus à la même image initiale pour chaque ligne. Si c’est le cas, trouvez où est l’erreur.
7. Appuyez sur Afficher le paramètre de sortie pour sélectionner le dossier pour enregistrer la sortie de Cellprofiler.
8. Cliquez sur Démarrer le mode test. Une fois en mode test, vérifiez les paramètres du pipeline en les appliquant à la première image de l’ensemble de données, en cliquant sur Exécuter (qui s’exécutera à travers tous les modules actifs dans le pipeline), ou Étape (qui traversera le pipeline un module à la fois).
   REMARQUE : Pendant le mode test, les mesures extraites ne seront pas exportées, même si un module ExportToSpreadsheet est présent (et actif) dans le pipeline.
9. Une fois que le pipeline fonctionne comme il se doit, cliquez sur Le mode test de sortie, puis appuyez sur Analyser les images. Tel qu’il est actuellement configuré, le Worms_CP (1) utilisera l’image Mask_ pour segmenter un masque de ver rugueux et l’image Lines_ ( FigureS10A) pour identifier les vers sélectionnés et produire des masques de vers simples (figure S10C), (2) mesurer l’intensité de fluorescence de tous les canaux présents dans les images d’entrée dans ces vers identifiés et masqués. Le pipeline peut également mesurer l’intensité dufond (figure S10B)et corriger toutes les images en conséquence (indiquées par le seuil de mot au nom du paramètre mesuré, p. ex., Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) mesurer la taille des vers sélectionnés et (4) exporter tous les paramètres mesurés (figure S10D).
10. Ouvrez la Worm_CP composée de deux fichiers csv, vers.csv et lignes.csv qui sont enregistrés dans le dossier de sortie sélectionné (voir figure S11). Ces fichiers peuvent être ouverts dans Excel ou R (Studio) pour le post-traitement et la production de rapports. Si une sortie supplémentaire est nécessaire, par exemple par données d’image, cela peut être sélectionné dans le module ExportToSpreadsheet dans le pipeline.

Résultats

La culture et l’imagerie de C. elegans selon la méthode décrite dans ce protocole produisent de grandes images d’aperçu des populations de vers. Pour faciliter l’inspection visuelle et la classification des vers à partir de ces images, nous avons développé Worm-align. Worm-align est un script FIJI simple et convivial qui peut être utilisé pour créer des montages de vers redressés et alignés. Les vers sont sélectionnés à partir d’images de vue d’ensemble en dessinant une ligne le long de l’axe longitudinal des vers. Chaque ver sélectionné se voit attribuer un numéro, recadré et redressé, et ajouté à un montage. Les montages peuvent être générés par image ou en combinant toutes les images du dossier d’entrée d’origine.

Comme prévu, la sortie du pipeline dépend en grande partie de la qualité des lignes tracées au-dessus des images. Pour illustrer ce point, la figure 4 montre plusieurs exemples de lignes et leur sortie de Worm-align. Une ligne complète de la tête à l’extrémité de la queue produit un ver correctement aligné (étiqueté « bon »). La figure 4 montre également comment les inexactitudes de traçage lors de l’exécution de l’alignement des vers affectent la sortie de l’alignement. À partir du montage annoté inclus dans la figure 4C,il faut prendre soin d’éviter les erreurs suivantes, car elles entravent l’alignement approprié des vers :

• Traçage incohérent du ver de la tête à la queue (étiqueté « queue à tête »). Il en résulte que les vers sont orientés dans des directions différentes (c.-à-d. queue à tête par rapport à tête-à-queue) dans l’alignement.
• Traçage incomplet (étiqueté « incomplet »). Il en résulte que la partie du ver qui a été tracée pour être recadrée pour le montage.
• Y compris plusieurs vers en une seule trace (étiqueté « ver à deux têtes »). Il en résulte que les vers plus (sections significatives de) leurs voisins sont insérés dans le même panneau du montage.
• Ajout de lignes aléatoires à l’image (étiquetées « aléatoire »). Il en résulte l’insertion de panneaux aléatoires dans le montage.

Pour la création du montage, il n’est pas question que deux lignes individuelles se croisent (étiquetées « croisement ») ou soient jointes à chaque extrémité du ver (étiquetée « jointe »), tant que chaque ligne trace toute la longueur d’un ver individuel : le script d’alignement de ver sélectionne individuellement et séquentiellement chaque ligne ROM, cultures et redresse, de sorte que chaque panneau du montage final représentera une trace de ligne unique. Dans le cas des vers qui se croisent cependant, bien que des vers redressés de pleine longueur apparaissent pour le ver « se croisant1 » et le ver « se croisant2 » dans le montage (voir la figure 5A-B),il est clairement remarquable que ces vers se croisent dans l’image d’aperçu originale. Par conséquent, on peut conclure que l’identification visuelle des lignes de croisement est possible à partir de l’image de superposition trouvée dans le sous-foldeur« données » ( Figure 5A), ainsi que des panneaux de vers individuels dans le montage (Figure 5B). En outre, tout chevauchement de vers/lignes peut être identifié à partir du tableau de contrôle de la qualité (QC) généré pour chaque image traitée par Worm-align, et enregistré dans le sous-foldeur de données. Ce tableau enregistre trois paramètres pour chacune des IA de ligne dessinés dans l’image (voir la figure 5C): De ce nombre, la longueur indique la longueur du roi de la ligne, qui est un bon indicateur de la taille du ver; et le numéro de ver indique l’ordre dans lequel les lignes ont été dessinées sur l’image de vue d’ensemble. Enfin, la dernière colonne indique s’il y a chevauchement entre le ver/ligne en question et l’un des autres vers/lignes sélectionnés dans l’image. En cas de chevauchement, le nombre dans cette colonne sera différent de celui indiqué dans la colonne numéro de ver. En combinaison avec l’image de superposition, le tableau QC devrait aider le chercheur à prendre des décisions éclairées sur les vers qui devraient être exclus du montage et/ou de la quantification.

La sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure de l’intensité de la fluorescence chez les vers simples. Aux FIDJI, la ligne ROM peut être utilisée pour mesurer l’intensité de fluorescence dans les données d’image originales, par exemple en exécutant le script fidjien simple ' Worm-quant.ijm', qui peut également être trouvé dans le référentiel Worm-align sur Github. Alternativement, la sortie Worm-align peut être importée dans un logiciel tiers d’analyse d’image. Nous le démontrons en important la sortie worm-align de deux ensembles de données dans Worm_CP, un pipeline que nous avons généré dans CellProfiler. Worm_CP utilise les fichiers dans le sous-volet « CellProfiler » du dossier de sortie Worm-align pour affiner les masques de segmentation des vers individuels sélectionnés lors de l’exécution de la macro Worm-align. Plus précisément, il utilise le masque de ligne (nommé: Lines_) pour isoler certains vers de la population de vers vus dans le masque binaire (nommé: Mask_). Il convient de noter que les lignes qui se croisent sur l’image de vue d’ensemble (Figure 5A), bien que n’est pas un problème pour la génération de montages, sont problématiques pour le pipeline Worm_CP. Pourquoi c’est le cas, est illustré dans la figure 5 D-E. Worm_CP utilise le masque de ligne (figure 5D), et non pas les ROM individuels pour faciliter l’identification des vers individuels. La ligne de croisement tracée en second lors de l’exécution de Worm-align est superposée sur la première ligne et donc l’intensité le long de cette ligne sera celle du ROI2, y compris dans le bit où les lignes 1 et 2 se chevauchent. En conséquence, CellProfiler segmente la ligne2 comme un seul objet, mais line1 comme deux objets qui sont séparés où il se croise avec la ligne2. Cela signifie que CellProfiler produira deux (moitié) masques de ver pour le ver « croisement1 » (Figure 5E). La façon la plus simple d’exclure ces événements de l’analyse finale (si nécessaire) est d’identifier le nombre de vers qui se croisent du tableau qc (sous-foldeur de données), et de supprimer les mesures de ces vers des fichiers de sortie CellProfiler. Veuillez noter que les vers ne recevront pas nécessairement le même nombre dans FIJI et CellProfiler : pour identifier le numéro de ver FIJI dans la sortie CellProfiler, regardez les valeurs Intensity_Max_Intensity dans le fichier de.csv sortie « Lignes ». Toute Intensity_Max_Intensity qui apparaît dans le tableau « Lignes.csv plus d’une fois par image est une indication de ce retour sur investissement de ligne résultant en un masque de ver fracturé.

Une fois que les masques de ver individuels sont segmentés, Worm_CP peut mesurer l’intensité de fluorescence dans les vers sélectionnés pour tous les canaux enregistrés. Toutes les mesures sont prises à partir des données d’image originales (brutes), bien qu’il convient de noter que CellProfiler recale automatiquement l’intensité du pixel sur une échelle de 0-1. Ceci est réalisé en divisant la valeur d’intensité des pixels bruts par l’intensité maximale possible des pixels pour l’image. Dans le cas d’images 8 bits, cette valeur est de 255, et en cas d’images 16 bits, il est de 65535. Les valeurs d’intensité cellprofiler doivent donc être multipliées par la valeur d’intensité maximale possible pour retrouver des valeurs équivalentes aux données d’image brutes. La Worm_CP se compose de deux fichiers csv, 'vers.csv' et 'Lines.csv' qui sont enregistrés dans le dossier de sortie sélectionné. Lors de l’inspection de ces fichiers, il est clair que CellProfiler enregistre un grand nombre de paramètres liés à l’intensité de fluorescence. De ce nombre, le Intensity_IntegratedIntensity correspond à la fluorescence totale par ver (c.-à-d. la somme de l’intensité de fluorescence dans tous les pixels qui interprètent le masque d’un ver individuel). Le paramètre Intensity_MeanIntensity se réfère à l’intensité moyenne de fluorescence dans un ver individuel (c.-à-d. l’intensité moyenne de fluorescence par pixel pour tous les pixels contenus dans un ver individuel). En raison de l’apparition occasionnelle de (petites) erreurs dans la segmentation des masques de ver, il est recommandé d’utiliser des mesures de densité moyenne lorsqu’on compare les mesures de fluorescence des vers individuels entre deux conditions. Si vous voulez soustraire la fluorescence de fond des measurments quantifiés, utilisez les mesures nommées MeanIntensity_Threshold.

Nous avons utilisé le pipeline Worm_CP pour quantifier l’intensité de fluorescence des animaux fixes qui ont été étiquetés avec un colorant fluorescent qui s’incorpore dans les gouttelettes lipidiques (LD) (Figure 6). Afin de valider la quantification par fluorescence du pipeline Worm-align/Worm_CP, nous avons quantifié l’intensité de fluorescence dans le même ensemble de vers à partir de l’ensemble de données BODIPY par le pipeline Worm-align/Worm_CP ou la quantification manuelle dans FIJI/ImageJ. La quantification manuelle a été effectuée dans FIJI/ImageJ en encerclant chaque ver ainsi qu’une zone de fond sombre dans chaque image. L’intensité de fluorescence a été mesurée dans le gestionnaire de retour sur investissement et la valeur mesurée pour le fond d’image a été soustraite de la mesure de fluorescence de ver de chaque ver,^{comme décrit 17.} Nous avons comparé les vers N2 de type sauvage (WT) aux mutants dbl-1(nk3), qui présentent une diminution de la teneur en gouttelettes lipidiques¹⁸. Comme prévu, l’intensité de fluorescence verte est considérablement diminuée entre les vers WT et dbl-1(nk3) avec les deux méthodes (figure 6A,B). Des exemples de vers alignés peuvent être observés dans la figure 6C,D. La teneur en gouttelettes lipidiques est diminuée de 17 % (p-value<0,0001, t-test non apprifié) entre WT et dbl-1(nk3) à l’aide de la quantification manuelle, et de 14 % (p-value=0,0051 t-test non appriré) à l’aide du pipeline Worm_CP. La diminution de la teneur en gouttelettes lipidiques observée ici dans dbl-1(nk3) avec les deux méthodes de quantification est conforme à la littérature¹⁸. Cela montre que la quantification des images de fluorescence acquises avec Worm_CP pipeline CellProfiler est comparable à la quantification manuelle.

Nous avons également utilisé Worm_CP pour quantifier la réponse aux chocs thermiques chez les vers vivants exprimant gfp sous contrôle du gène inductible de choc thermique hsp-70 (C12C8.1)⁹. La figure 7 montre des images représentatives de C. elegans en direct portant le hsp-70 (C12C8.1)p::reporter GFP. En l’absence de stress thermique, les vers n’induisent pas l’expression GFP( Figure 7A,B). Toutefois, lorsque les vers sont exposés à un court choc thermique de 30 min à 34 °C, ils induisent l’expression GFP (figure 7C,D). Les niveaux d’expression gfp avec et sans choc thermique sont quantifiés dans la figure 7E.

Dans l’état actuel des choses, Worm_CP est un pipeline très basique. Toutefois, cette approche permet une segmentation plus précise des masques de vers individuels, ce qui permet une quantification plus précise de l’intensité de fluorescence dans les vers sélectionnés à partir de l’image. Pour cette raison, nous préférons cette approche à une quantification approximative aux FIDJI, en utilisant uniquement les masques de ligne. En outre, CellProfiler offre l’avantage que des modules d’analyse supplémentaires peuvent facilement être inclus dans le pipeline. Par exemple, pour l’ensemble de données qui examine la teneur en gouttelettes lipidiques, l’insertion de modules supplémentaires dans le pipeline Worm_CP pourrait étudier le nombre de gouttelettes lipidiques et l’intensité de fluorescence des gouttelettes individuelles dans les vers sélectionnés dans les images d’aperçu.

Figure 1 : Génération d’une micropipette buccae. Un capillaire en verre est étendu dans la flamme d’un brûleur Bunsen ( A ),jusqu’àce qu’il fournit de fines extrémités allongées (B). Le capillaire en verre étendu est ensuite branché sur le morceau d’adaptateur de la micropipette buccae. (C) Schéma d’une micropipette de bouche. La micropipette buccae a été assemblée avec un capillaire en verre branché sur un adaptateur. Un tube en silicone de 6 mm relie l’adaptateur à un filtre à seringues de 0,2 μm, utilisé pour la sécurité. L’autre extrémité du filtre est fixée à un tube de silicone de 3 mm se terminant par une pointe de filtre de 1 mL. L’expérimentateur peut aspirer via la pointe du filtre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Aspiration du liquide entourant la pastille de ver, à l’aide de la micropipette buccae. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Ajouter le coverslip sur les vers posés sur le pad agarose S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Exemples de redressement des vers à l’aide d’images de fluorescence acquises auprès d’animaux vivants portant le reporter transcriptionnel fat-7p ::GFP dans l’intestin et marqueur de co-injection rouge dans le pharynx (myo-2p::tdtomato). (A) Capture d’écran d’une image composite acquise au microscope fluorescent de vers vivants au jour 3 de l’âge adulte. L’image a été ouverte avec Worm_align et des lignes ont été dessinées le long de l’axe longitudinal des vers à l’aide de ver-aligner. (B) Capture d’écran de la même image que dans (A), avec des exemples commentés de bon et mauvais dessin des lignes le long de l’axe des vers, en utilisant Worm-align. (C) Exemples de lignes dessinées sur le dessus des vers qui peuvent s’élever vers mal alignés. La sortie d’alignement des vers sélectionnés dans B. Les images ont été prises avec un objectif de 20 x sur un microscope à champ large inversé (voir tableau matériaux) avec intensité de fluorescence verte=1, exposition=60 ms et intensité de fluorescence rouge = 8, exposition=60 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Exemples de redressement des vers à l’aide de l’alignement des vers sur les vers qui se croisent. (A) Capture d’écran d’une image composite acquise sur le microscope fluorescent de vers vivants au jour 3 des animaux adultes portant le journaliste transcriptionnel fat-7p::GFP dans l’intestin et un marqueur de co-injection rouge dans le pharynx (myo-2p::tdtomato). Les vers qui se croisent sont étiquetés « croisement1 » et « croisement2 », tandis que les vers qui ne se chevauchent pas sont étiquetés « bon3 » et « bon4 ». (B) Montage créé par Worm-align représentant les vers redressés sélectionnés dans (A). On remarque dans le montage que les vers 1 et 2 se croisaient sur l’image originale (vers étiquetés comme « croisement1 » et « croisement2 »). (C) Capture d’écran de la table QC de Worm-align qui permet de repérer les cas où les vers se croisent. Longueur : longueur de la ligne roi; numéro de ver: ordre dans lequel les lignes ont été tracées; la dernière colonne indique s’il y a chevauchement entre le ver/ligne d’intérêt et tout autre ver. Dans cet exemple, le ver dans la première crue (numéro de ver1) chevauche le ver numéro 2, comme l’indique le nombre « 2 » dans la dernière colonne. (D) Capture d’écran des lignes dessinées avec Worm-align sur les quatre vers sélectionnés dans A. ( E )Captured’écran des masques générés par Worm-align sur les quatre vers sélectionnés en A, montrant comment les masques pour les deux vers qui se croisent sont rendus. Dans ce cas, deux masques au lieu d’un correspondent maintenant au ver « recoupant1 ». Des images ont été prises avec un objectif de 20x sur un microscope à champ large inversé (voir tableau matériaux) avec intensité de fluorescence verte=1, exposition=60ms et intensité de fluorescence rouge = 8, exposition = 60 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Le pipeline Worm_CP quantifie la fluorescence avec autant de précision que la quantification manuelle. Comparaison de la quantification par fluorescence des jeunes vers adultes fixés et tachés pour la teneur en gouttelettes lipidiques avec le colorant fluorescent vert BODIPY, en utilisant soit un pipeline Worm_CP (A) ou une quantification manuelle (B). La teneur en gouttelettes lipidiques de WT et dbl-1 (nk3) a été surveillée en fixant et en soudant les animaux avec BODIPY, qui s’intercale en acides gras de gouttelettes lipidiques (voir protocole A). Les jeunes animaux adultes ont été fixés avec 60% d’isopropanol et tachés avec BODIPY pendant 1h. Le même ensemble d’animaux a été quantifié soit à l’aide du pipeline Worm_CP (voir l’étape 7) soit par quantification manuelle selon les procédures^{normalisées 17}. (A) Quantification de la fluorescence à l’aide Worm_CP pipeline. WT : n=22 animaux, fluorescence moyenne = 1.016 (A.U) ± 0.206 SD ; dbl-1(nk3):n=25 animaux, fluorescence moyenne = 0,8714 (U.A.U) ± 0,126 SD. T-test non appétiré. (B) Quantification manuelle de la fluorescence. WT : n=22 animaux, fluorescence moyenne = 1.048 ± 0.153 SD ; dbl-1(nk3): n=25 animaux, fluorescence moyenne = 0,8632 ± 0,109 SD. T-test non appétiré. (C, D) Exemple représentatif ou sortie Worm-Align pour les animaux WT (C) et dbl-1 (nk3) (D) redressés avec le pipeline Worm-align. Des images ont été prises avec un objectif de 20x sur un microscope à champ large inversé (voir tableau matériaux) avec intensité de fluorescence verte=2, exposition=60ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Exemple de quantification par fluorescence et alignement de vers vivants à partir d’images de fluorescence de vers vivants portant le reporter transcriptionnel hsp-70 (C12C8.1)p::GFP suite à un choc thermique. (A) Lors d’un court choc thermique (30 min à 34 °C), les jeunes vers adultes ont été récupérés à leur température de culture (25 °C) et montés puis photographiés 3,5 h après le choc thermique. Une trentaine de vers ont été quantifiés à la suite d’un choc thermique à l’aide du pipeline d’alignement des vers. (A-B) Exemples de vers alignés qui n’ont pas été exposés à un choc thermique. (C-D) Exemples de vers choqués par la chaleur portant hsp-70 (C12C8.1)p::GFP utilisant Worm-align. (E) montre l’intensité moyenne GFP (paramètre Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) des jeunes vers adultes WT cultivés, sans choc thermique ou lors de l’exposition à un choc thermique (34 °C pendant 30 min). Des images ont été prises avec un objectif de 20x sur un microscope à champ large inversé (voir tableau matériaux) avec intensité de fluorescence verte=1, exposition=60ms ; pas de HS: n=12, HS: n=32. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Emplacement aux FIDJI où l’on peut trouver la macro d’alignement des vers, une fois installée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Sélection du dossier contenant toutes les images prises avec les mêmes paramètres. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Génération de 4 sous-groupes dans le dossier de sortie aux FIDJI. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Dessin d’une ligne sur toute la largeur du ver et réglages du canal pour le montage. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Aperçu de l’image avec les paramètres appliqués. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Dessin d’une ligne le long de l’axe longitudinal des vers d’intérêt pour l’inclusion dans le montage et/ou la quantification. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Montage des vers sélectionnés dans le dossier de sortie, sous dossier « aligné ». S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 8 : Effacer les images précédentes de l’analyse précédente dans Cell Profiler. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 9 : Importation de métadonnées dans CellProfiler à partir du dossier de sortie Worm-align en sélectionnant les paramètres.csv subfolder. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 10 : Le pipeline CellProfiler Worm_CP.cpproj utilise les images de Lines_ pour singler les vers sélectionnés (A), et produit des masques de vers simples des vers d’intérêt (C). Le pipeline mesure également l’intensité de fond (B). Perspectives de tous les paramètres mesurés par le pipeline Worm_CP.ccproj qui sont exportés dans un fichier csv (D). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 11 : Sélection des fichiers de sortie dans la feuille ExportToSpread dans le pipeline Worm_CP.cpproj. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Worm-align est un pipeline de traitement d’images basé aux FIDJI qui génère facilement des montages de vers sélectionnés par l’utilisateur, dans lesquels les vers sont redressés et alignés pour faciliter la comparaison visuelle, la classification et la représentation. Bien que cette fonctionnalité soit également offerte par certains outils existants, notamment le module WormToolbox dans CellProfiler⁷, Worm-align nécessite relativement peu d’expérience préalable à l’analyse d’image : les utilisateurs n’ont qu’à retracer les vers qu’ils aimeraient sélectionner pour le montage (et l’analyse). Bien que le traçage des vers sur les données brutes de l’image soit un processus facile - en particulier lorsqu’un ordinateur ou une tablette à écran tactile est disponible -, il est primordial que les lignes soient correctement tracées le long de l’axe longitudinal des vers. Les lignes incomplètes, qui ne suivent qu’une partie du ver, entraîneront des vers partiels dans le montage (c.-à-d. des vers manquant des têtes de extrémités de queue) et des masques de segmentation partielle pendant l’analyse de CellProfiler. En outre, si les lignées de deux vers individuels se croisent, les vers ne seront pas correctement traités dans le montage d’alignement des vers ainsi que pour la quantification de la fluorescence. Pour le contrôle de la qualité, une image superposition des sélections de lignes sur l’image d’origine est enregistrée dans le dossier de données, ainsi qu’une table QC. À partir de ces lignes problématiques qui mèneront à des vers mal segmentés peuvent facilement être identifiées et exclues du montage et/ou de l’analyse subséquente.

Bien que l’apport direct de l’expérimentateur dans la sélection des vers semble peut-être un peu long, il présente un avantage évident du flux de travail sur d’autres dans les expériences où les vers de différents stades de développement sont présents dans la même image: Les vers peuvent être sélectionnés au cours de la « étape de traçage », en décrivant uniquement les vers qui sont dans le bon stade de développement. Alternativement, les vers peuvent être filtrés à l’aide de la sortie de Worm_CP en fonction soit de la longueur de la ligne de traçage, soit de la zone du masque de segmentation, deux indicateurs fiables de la longueur/taille des vers. On peut soutenir que les algorithmes d’apprentissage automatique peuvent avoir du mal à reconnaître les vers à différents stades de développement, car leur taille et leur apparence dans les images du DIC sont si différentes.

La sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure de l’intensité de fluorescence chez les vers simples, soit en FIDJI directement, ou dans d’autres plates-formes logicielles d’analyse d’image. Nous l’avons démontré en important la sortie d’alignement des vers dans un simple pipeline CellProfiler (Worm_CP), ce qui permet la quantification de l’intensité de fluorescence multicanal dans les vers individuels qui ont été sélectionnés lors de l’exécution du pipeline Worm-align. Nous avons choisi cette approche en raison de la flexibilité du logiciel CellProfiler : il est simple d’intégrer des modules supplémentaires dans le pipeline pour analyser des fonctionnalités supplémentaires chez les vers individuels (p. ex. mesurer la taille des gouttelettes lipidiques, ou les granules de stress, les noyaux, les mitochondries). En outre, les masques de ver unique pourrait potentiellement être utilisé pour former un nouveau modèle pour WormToolbox⁷.

Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est rapide et nécessite une simple mise en place de montage de vers. Cette méthode est plus rapide car elle ne nécessite pas de passer du temps à apprendre le fonctionnement du logiciel ni à exécuter des ensembles de formation à travers un algorithme de machine⁷. En outre, cette méthode fonctionne avec des vers vivants ou fixes simplement montés sur des coussinets d’agarose réguliers. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des chambres microfluidiques complexes, telles que développées dans^{d’autres méthodes 5,6}.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Tube aspirateur	Sigma-Aldrich	A5177	pour créer une micro-pipette buccale (voir étape du protocole)
Bécher
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	solution mère préparée dans du DMSO à 1mg/mL
Centrifugeuse	MSE MISTRAL 1000
Flacon
Cover Slip	VWR	631-0120
Filtre 0.2 µ ; m pour Seringue	Sartrius	16534-K	Filtre, pour créer une micro-pipette buccale (voir étape du protocole)
Isopropanol
Chlorhydrate de lévamisole	Sigma-Aldrich	BP212	3mM solution préparée par dissolution de lévamisole dans M9
Azote			liquide Installation d’azote liquide
Faible rétention Pointe 1000µ ; L	Starlab	S1182-1830
Méthanol	VWR chemicals	20847.307
Lames de microscope, MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011/2
Microscope	Nikon		Eclipse Ti
Four à micro-ondes	Delongi
M9			préparé en laboratoire selon 15
		NGM de >9cm	préparées en laboratoire selon 15
PBS préparées			en laboratoire
Protein LoBind Tube 2ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Ring Caps	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	Tubes micro-capillaires en verre pour créer la bouche micro-pipette (voir étape du protocole)
Rotator	Stuart Scientific
Tube en silicone translucide	Laboratoire scientifique Fournisseurs	TSR0600200P	paroi de 6,0 mm x 2,0 mm - pour créer une micro-pipette buccale (voir étape du protocole)
Eau H2O			MilliQ stérilisée autoclavée en laboratoire
10µ ; L Embouts	Starlab	S1120-3810
200µ ; L Embouts	Starlab	S1120-8810
1000µ ; L Tips	Starlab	S1122-1830
15mL TUBE DE CENTRIFUGATION	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	support de montage anti-effacement (H-1000) sans DAPI