Article de méthode

Production de poulets de chair à croissance rapide sans germes à partir d’une ligne commerciale pour les études sur le microbiote

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DOI :

10.3791/61148

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18 juin 2020

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1INRAE, PFIE, UE-1277, 2INRAE, ISP, Université de Tours

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour la génération de poussins exempts de germes à partir d’œufs d’une lignée de poulets de chair commerciale, le Ross PM3. Cette méthode peut être adaptée pour la génération d’animaux exempts de germes d’autres espèces de volailles.

Résumé

Les études de la contribution du microbiote intestinal à la physiologie et à l’immunocompétence de l’hôte sont facilitées par la disponibilité de modèles animaux exempts de germes, qui sont considérés comme l’étalon-or. Les oiseaux nicheurs sont des modèles idéaux pour la production d’animaux exempts de germes, car il n’est pas nécessaire d’élever leurs parents dans des conditions stériles. Les poulets exempts de germes sont principalement générés à partir de lignées expérimentales sans agents pathogènes spécifiques (FPS), qui sont peu représentatives des lignées de poulets commerciales. La méthode proposée ici a permis la production de poulets exempts de germes à partir de la lignée de poulets de chair à croissance rapide Ross PM3, couramment utilisée par l’industrie avicole. Les œufs ont été rapidement récoltés après la ponte dans une ferme d’élevage de poulets de chair. Ils ont subi un processus de décontamination strict de la collecte à l’introduction dans un isolateur stérile d’éclosion d’œufs. Les poussins ont été éclos et gardés dans ces isolateurs stériles pendant la période nécessaire pour contrôler leur stérilité. Développé à l’origine pour une ligne expérimentale de livournes blanches SPF, le présent protocole a été adapté non seulement à la lignée de poulets de chair Ross PM3, mais aussi aux cailles. Il s’agit donc d’une procédure robuste et facilement adaptable à d’autres espèces de volailles et d’oiseaux nicheurs présentant un intérêt économique, biologique ou écologique.

Introduction

Il y a eu une augmentation spectaculaire de l’intérêt scientifique et populaire concernant la contribution du microbiote intestinal à la santé animale. Le microbiote, composé de bactéries, de virus, de champignons et d’archées qui habitent différentes niches dans l’intestin de l’animal, est impliqué directement ou indirectement dans la régulation des maladies inflammatoires, infectieuses et métaboliques affectant non seulement les espèces de mammifères, mais aussi le bétail, comme la volaille1. Plusieurs modèles animaux ont été développés pour mieux étudier la contribution du microbiote intestinal à la santé et à la maladie. Par exemple, les animaux exempts de germes et gnotobiotiques permettent l’étude de l’absence totale de microbes ou d’un microbiote connu, respectivement, sur la physiopathologie des infections 2,3. Cependant, la production et l’entretien de ces animaux nécessitent des techniques et des installations spécialisées, et les coûts, la main-d’œuvre et les compétences nécessaires pour les entretenir limitent leur accès à de nombreux chercheurs. En effet, les animaux exempts de germes doivent être surveillés régulièrement pour détecter toute contamination possible à l’aide d’une combinaison de méthodes de culture de bactéries, de microscopie, de sérologie, de morphologie brute et de techniques de détection basées sur le séquençage. Des procédures similaires s’appliquent également à d’autres espèces, telles que le bétail, où les animaux sont généralement plus gros et nécessitent des installations plus grandes pour leur reproduction et leur entretien, ce qui peut entraver, dans une certaine mesure, la recherche sur le microbiote.

La volaille, plus précisément les poulets, est la pierre angulaire de la production animale dans le monde entier, avec un cheptel qui peut dépasser 40 milliards d’oiseaux par an. C’est la source de protéines animales la plus importante au monde (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). De plus, il n’y a pas de tabous culturels ou religieux associés à l’élevage ou à la consommation de poulets. Le microbiote intestinal de la volaille est impliqué de manière importante dans la croissance de l’animal, le taux de conversion alimentaire, l’immunité, la résistance aux agents pathogènes, parmi de nombreux autres processus nutritionnels, physiologiques ou pathologiques4. La génération de poulets exempts de germes est donc indispensable pour souligner le dialogue entre le microbiote et son hôte4. Même si les communautés microbiennes habitent l’oviductede poulet 5, le contenu d’un œuf fraîchement pondu par une poule en bonne santé est pour la plupart exempt de micro-organismes, la coquille d’œuf et les membranes possédant des barrières mécaniques pour éviter l’invasion de micro-organismes4. De plus, les poussins sont facilement élevés en l’absence de leurs parents, ce qui, contrairement aux mammifères, permet la production d’animaux exempts de germes sans élevage parental dans des conditions stériles.

L’installation expérimentale « Infectiologie des animaux d’élevage, modèles et sauvages » (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) fait partie du réseau national d’infrastructures emerg’in (https://www.emergin.fr/) Français. PFIE maîtrise la production de poulets sans germes pour effectuer diverses études expérimentales depuis plus de 40 ans 7,8,9,10,11. Ces animaux ont été produits à partir d’œufs spécifiques exempts d’agents pathogènes (FPS) provenant d’une lignée de ponte de livournes blanches élevée en élevage fermé depuis les années 1970. Principalement utilisés pour les études microbiologiques 7,8,9, les oiseaux exempts de germes connaissent un regain d’intérêt avec des questions telles que la contribution du microbiote intestinal au comportement13, l’utilisation des nutriments14, le développement immunitaire15 et l’activité endocrinienne. Même si certaines études ont été publiées sur des lignées de poulets de chair sans germes16, ces études restent sous-représentées par rapport aux études utilisant des lignées de couches expérimentales. L’évolution des questions scientifiques vers la diaphonie entre le microbiote et son hôte dans la santé et le bien-être des volailles nous a amenés à adapter notre protocole historique pour produire des poulets de chair sans germes de la lignée Ross PM3, la lignée de poulets de chair la plus utilisée au monde.

Protocole

Les procédures de soins aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices fixées par la directive du Conseil des Communautés européennes (86/609/CEE) et par les règlements Français sur l’expérimentation animale.

1. Préparation de l’isolateur

  1. Insérez les matériaux nécessaires dans un isolateur rigide sous pression positive: tubes de 50 mL, pipettes en plastique de 5, 10 et 25 mL, alimentation irradiée, eau autoclavée et récipients en plastique scellés stériles.
  2. Remplissez le piège germicide de transfert avec une solution d’ammonium quaternaire à 2%.
  3. Stériliser l’isolateur trois fois avec de la vapeur de formaldéhyde en utilisant 60 mL de formol (24% de formaldéhyde) ajouté à 30 g de permanganate de potassium par mètre cube (m3). Déplacez les matériaux à l’intérieur de l’isolateur entre chaque stérilisation pour assurer la stérilisation de toutes les surfaces de contact.
  4. Réglez la température de l’isolateur à 37 °C pendant au moins 2 jours avant d’introduire les œufs. Réglez l’hygromètre à 65-70% d’humidité relative (HR) le jour de l’introduction.

2. Collecte et incubation des ovules

  1. Prélever les œufs dans les fermes sélectionnées sur la base d’un bon taux d’éclosion des poules pondeuses (au moins 80 % au plus fort de la production d’œufs) et de leur bon état sanitaire (c.-à-d. absence d’agents pathogènes communs de la volaille et absence de maladies au sein du troupeau). Sélectionnez visuellement des œufs propres et impeccables sur le tapis roulant.
  2. Décontaminer immédiatement la surface de l’œuf en les trempant pendant 5 min dans une solution d’acide peracétique à 1,5% à température ambiante.
  3. Transporter les œufs à l’installation expérimentale à l’aide d’une boîte décontaminée avec de la vapeur de formaldéhyde.
  4. Conserver les œufs pendant 24 heures à 4 °C. Répétez le processus de décontamination décrit à l’étape 2.2 et placez-les dans un incubateur à couver (jour 0) pendant 19 jours.

3. Éclosion

  1. Le jour 19, vérifiez la fertilité, la viabilité (motilité) et le développement embryonnaire en les mettant en boîte à l’aide d’un chandelier à œufs léger dans des conditions stériles. N’introduisez que des œufs embryonnés vivants dans les isolateurs d’éclosion stériles.
  2. Décontaminer les œufs sélectionnés en pulvérisant une solution d’acide peracétique à 1,5 % pendant 30 s ou jusqu’à ce que toute la surface de chaque œuf soit recouverte. Les œufs resteront en contact avec le spray pendant 16 min et 30 s pendant le transfert dans des isolateurs.
  3. Transférer les œufs dans les isolateurs d’éclosion stériles et les rincer à l’eau déminéralisée stérile avant de les placer dans l’espace d’éclosion.
    REMARQUE: Les animaux sont éclos et élevés dans des isolateurs stériles. Ils sont nourris ad libitum avec un régime commercial stérilisé par irradiation gamma et arrosés avec de l’eau du robinet autoclavée fournie par des distributeurs d’eau.

4. Analyse de l’état bactériologique

  1. Un jour après l’éclosion, prélever un échantillon fécal directement dans le rectum de différents poussins et les regrouper dans un tube de verre stérilisé afin de rendre cet échantillon représentatif de tous les animaux dans un isolateur donné.
  2. Les échantillons fécaux étant plus ou moins liquides, ajouter l’équivalent de 1 mL de selles à 9 mL de bouillon de thioglycolate avec de la résazurine. Ajouter l’échantillon fécal restant à 9 mL de bouillon de perfusion cardiaque cérébrale (BHI) et incuber les tubes à 37 °C sans agiter pendant 18 à 48 h. Cela permettra la croissance d’un large éventail d’espèces aérobies, aérobies facultatives et anaérobies non fastidieuses.
    REMARQUE: Le bouillon de thioglycolate avec de la résazurine est destiné à la détection de bactéries anaérobies non fastidieuses, mais il permet également la détection de bactéries aérobies. Ce milieu est conforme aux pharmacopées européenne, américaine et japonaise pour les tests de stérilité 18,19,20.
  3. Observez visuellement si une modification du milieu de croissance se produit après 18 heures d’incubation. Après 48 h, prenez une goutte du bouillon fécal BHI, placez-la sur une lame de verre et observez au microscope (grossissement 40X) l’absence ou la présence de bactéries.
  4. En cas de suspicion de présence de bactéries, prélevez un échantillon de la culture BHI et ensemencez-le sur des plaques de gélose BHI. Incuber à 37 °C pendant 18 à 48 h.
  5. Si des colonies sont présentes, effectuez des techniques à haut débit telles que la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour une identification microbienne précise.
    NOTE: Après 72 h, si les analyses bactériologiques sont négatives, les animaux sont déclarés exempts de germes.

Résultats

Six cycles de génération de poussins exempts de germes ont été effectués avec des œufs Ross PM3 provenant de deux fermes Français différentes (tableau 1). Au total, 853 œufs ont été prélevés et après deux étapes de décontamination et 19 jours d’incubation, 86,40 % étaient viables. 490 de ces œufs viables ont subi une troisième étape de décontamination et ont été introduits dans divers isolateurs d’éclosion, pour un taux d’éclosion moyen de 79,80 %. Cela représente un taux d’éclosion de 68,94 % par rapport au nombre initial d’œufs récoltés.

Cependant, les résultats d’éclosion varient considérablement selon les séries réalisées : de 41,67 % à 88,16 % des poussins viables par rapport au nombre d’œufs collectés. Ces variations ont également été observées entre les différentes trappes au cours d’une même expérience. Étant donné que tous les isolateurs n’ont pas été utilisés pour toutes les séries, il est difficile d’exclure un effet dépendant de l’isolateur. Cependant, cet effet de lot était directement corrélé à l’âge des poules pondeuses (figure 1), où les œufs provenant de poules plus âgées étaient moins viables.

Les six essais ont été effectués à l’aide de quatre isolateurs d’éclosion différents. Après contrôle bactériologique, il a été confirmé que les animaux de 14 des 16 isolateurs étaient exempts de germes. Cela correspond à un taux de réussite de 87,5%. Les deux isolateurs restants ont été contaminés par une seule bactérie environnementale et non pathogène.

Tous les animaux utilisés pour les expériences scientifiques sont restés exempts de germes jusqu’à la fin des études, pendant au moins trois semaines après l’éclosion.

figure-results-1
Figure 1 : Effet de l’âge de la poule sur le taux d’éclosion La présente figure met en évidence les taux d’éclosion observés en fonction de l’âge du troupeau de poules pondeuses, exprimé en semaines de ponte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Œufs collectésD19 œufs viablesD19 œufs viables/œufs collectésOeufs transférés dans l’isolateur 1Oeufs transférés dans un isolateur 2Oeufs transférés dans un isolateur 3Oeufs transférés dans un isolateur 4total des œufs transféréspoussins viables éclos dans l’isolateur 1poussins viables éclos dans l’isolateur 2poussins viables éclos dans l’isolateur 3poussins viables éclos dans l’isolateur 4total des poussins éclos viablesisolateur viable d’œufs éclos/transférés1isolateur viable d’œufs éclos/transférés2isolateur viable d’œufs éclos/transférés3isolateur viable d’œufs éclos/transférés4œufs éclos ou transférés viables à l’échelle mondiale
Exécution 11019392.08%2324--472223--4595.65%95.83%95.74%
Exécution 213011790.00%25252575202418-6280.00%96.00%72.00%82.67%
Exécution 31329773.48%26-26459714-1328*2753.85%50.00%62.22%56.70%
Exécuter 413011689.23%3635--713334--6791.67%97.14%94.37%
Exécuter 518014882.22%3030303012026*2517246686.67%83.33%56.67%80.00%76.67%
Exécuter 618016692.22%-4040-80-3535-7086.67%87.50%87.50%87.50%
Total85373786.40%1401541217549089141832433782.14%91.56%68.60%69.33%79.80%

Tableau 1 : Résultats techniques des différentes expériences d’éclosion. Le présent tableau met en évidence les résultats des 6 séries d’éclosions sans germes réalisées : nombre d’œufs collectés, viabilité de l’embryon à 19 jours et poussins éclos viables dans les différents isolateurs.

Discussion

Plusieurs méthodes pour générer des poulets sans germes ont déjà été décrites 7,21,22. Des méthodes simples, telles que celle présentée ici, utilisent différents désinfectants pour réduire la charge bactérienne à la surface des œufs et dans les isolateurs. Les désinfectants les plus couramment utilisés sont le chlorure mercurique, l’ammonium quaternaire, l’iodoforme, l’hypochlorite de sodium et les solutions de dioxyde de chlore. Les résultats sont souvent satisfaisants. Cependant, malgré l’accessibilité de ces méthodes, peu de structures peuvent appliquer la méthode et élever les animaux à grande échelle, faisant ainsi de l’utilisation de poulets exempts de germes une approche relativement rare, utilisée uniquement pour répondre à des questions scientifiques très spécifiques. Les méthodes, matériaux et équipements décrits ici permettent une proportion d’éclosion très efficace de poulets de chair exempts de germes, qui restent en bonne santé et stériles pendant au moins 3 semaines (la durée des expériences scientifiques pour lesquelles ils ont été produits).

Les résultats montrent que l’adaptation du protocole à la production de poussins exempts de germes à partir d’œufs collectés dans des élevages avicoles commerciaux est couronnée de succès. L’expérience de la production d’œufs SPF révèle que l’efficacité de l’éclosion dépend principalement de l’âge des poules pondeuses et de la qualité des œufs collectés. Les deux paramètres ont été pris en considération lors du choix des fermes et de la collecte des œufs. En utilisant la même méthode, le taux moyen d’éclosion des poulets de chair exempts de germes est bien meilleur que celui obtenu lors de la dernière production de poules pondeuses SPF dans notre établissement (79% vs 35%), sans affecter la stérilité animale (87% vs 83%). Ces différences peuvent être associées au bagage génétique des oiseaux (poulets de chair versus pondeuses) ainsi qu’à la qualité de la coquille d’œuf, qui est susceptible d’être plus fragile dans les œufs des animaux SPF, gardés en élevage fermé pendant plus de 40 ans. De plus, nous montrons également que le transport de plus de 2 h (des fermes à l’installation expérimentale) n’affecte pas l’efficacité et la qualité de l’éclosion.

Bien que le processus de stérilisation utilisé pour les isolateurs d’éclosion et le protocole de décontamination des œufs aient été optimisés, environ 10% des isolateurs n’étaient pas exempts de germes. Afin de comprendre l’origine de la contamination, il est très important d’effectuer un contrôle de stérilité de routine des isolateurs éclos avant l’introduction des œufs.

En ce qui concerne l’état de stérilité des oiseaux, nous avons essayé d’appliquer des méthodes qui permettent la croissance de bactéries anaérobies aérobies et non fastidieuses à partir d’échantillons fécaux, assurant ainsi que nous détectons des bactéries vivantes et viables. Ces méthodes sont conformes aux pharmacopées internationales pour les tests de stérilité et représentent des techniques rapides, faciles et coûteuses à utiliser régulièrement. Cependant, des techniques de biologie moléculaire telles que le séquençage du gène de l’ARNr 16S, bien qu’elles ne donnent pas d’informations sur la viabilité des bactéries, peuvent être appliquées pour confirmer la présence de bactéries non cultivables. En effet, une étude récente a suggéré que certaines bactéries du microbiote de l’ovducte maternel semblent être transférées à l’embryon par le biais du blanc d’œuf, constituant plus tard la majeure partie de la population bactérienne de l’intestin embryonnaire5. De plus, une autre étude a suggéré qu’une partie des colonisateurs microbiens hébergés dans les embryons précoces étaient hérités de poules maternelles, et que l’abondance et la diversité microbiennes intestinales ont ensuite été influencées par des facteurs environnementaux et la génétique de l’hôte au cours du développement23. Cependant, les résultats de ces études sont basés sur l’analyse de la séquence d’ADN, où un grand nombre de ces bactéries pourraient être mortes ou non reproductibles dans le blanc d’œuf (fortement chargé de molécules antimicrobiennes). Thomas et ses collaborateurs16 ont effectué des tests de stérilité par l’évaluation de bactéries aérobies cultivables et aérobies facultatives par chute fécale sur des plaques de BHI, soulignant ainsi l’efficacité des méthodes bactériologiques standard pour le contrôle de la stérilité sans germes. De plus, dans le protocole proposé, nous avons utilisé la surveillance de la croissance dans le bouillon thioglycolate avec de la résazurine pour pouvoir détecter la croissance de bactéries anaérobies non fastidieuses.

Déjà utilisé pour la production de cailles et de poulets exempts de germes, le protocole est adaptable à la production d’animaux exempts de germes de la plupart des oiseaux nicheurs et offre des perspectives pour l’étude de la contribution du microbiote à la physiologie de ces animaux. Outre l’utilisation de ce modèle pour étudier les interactions mutuelles hôte-microbiote dans l’intestin de la volaille, il pourrait également être utile pour la recherche appliquée. Par exemple, il pourrait être utilisé pour évaluer l’innocuité et l’efficacité des probiotiques dérivés de micro-organismes commensaux de l’intestin du poulet afin d’améliorer la santé et la robustesse des animaux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient les éleveurs et la société Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, France) pour la fourniture d’œufs fécondés. Cette étude a été menée sous l’égide du consortium de recherche APR-IA « INTEGRITY » (2017-2019), financé par la Région Centre Val de Loire, France.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pipettes en plastique stériles de 2 mLStarsted86.1252.001
Tubes de 50 mLPlaques
BHIThermo fisher diagnosticPO1198A
Brain Heart Bouillon de perfusionThermo fisher diagnosticCM1135
Tubes en verre avec 9 mL de bouillonfaits maison et stérilisés par autoclave
Tubes en verre avec 9 mL de bouillon de thioglycolate avec résazurinefait maison et stérilisé par autoclave
Incubateur d’éclosionFiemeMG 576
IncubateurMemmertpour la culture bactériologique, 37 ° ; C
Alimentation irradiéeSûrU8983G10R40 kG irradié
Isolateursfaits maison. 1 m3 isolateur rigide sous pression positive
Armoire de sécurité microbiologiquethermon electron corporationmodèle : Hera
Safe Microscope Visiscope série 300VWR
Aide à la pipetteDrummond
Pipettes
Boîtes scellées stérilesDiamètredu tuperware
Tube« sovirel"
Thioglycolate Bouillon avec ResazurinMerck90404-500G
Bain d’eauFisher scientificModèle : Polystat 36, utilisé pour incuber 10 min à 100 ° ; C les tubes de verre avec 9 mL de bouillon de thioglycolate avec de la résazurine afin de régénérer le milieu
de gélose Falcon BHI en plastique en verre stérilisé

Références

  1. Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5(2018).
  2. Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
  3. Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
  4. Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374(2019).
  5. Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838(2019).
  6. Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
  7. Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
  8. Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
  9. Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
  10. Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
  11. Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
  12. Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475(2012).
  13. Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
  14. Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
  15. Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017(2017).
  16. Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
  17. Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
  18. European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
  19. Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
  20. United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
  21. Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
  22. Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
  23. Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967(2017).

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Mots-clés

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