Article de méthode

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

DOI :

10.3791/61166

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19 mai 2020

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1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Dans cet article

Résumé

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Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système nerveux central (SNC) est composé du cerveau et de la moelle épinière et est enveloppé par les méninges, couches membraneuses servant de barrière entre la périphérie et le SNC. Le SNC est un site immunologiquement spécialisé, et dans des conditions d’état d’équilibre, le privilège immunitaire est le plus évident dans le parenchyme du SNC. En revanche, les méninges abritent un large éventail de cellules résidentes, y compris des cellules immunitaires innées et adaptatives. Au cours d’affections inflammatoires déclenchées par une lésion du SNC, une auto-immunité, une infection ou même une neurodégénérescence, des cellules immunitaires d’origine périphérique peuvent pénétrer dans le parenchyme et s’installer dans les méninges. On pense que ces cellules effectuent des actions à la fois bénéfiques et préjudiciables pendant la pathogenèse de la maladie du SNC. Malgré ces connaissances, les méninges sont souvent négligées lors de l’analyse du compartiment du SNC, car les méthodes conventionnelles d’extraction des tissus du SNC omettent les couches méningées. Ce protocole présente deux méthodes distinctes pour l’isolement rapide des tissus murins du SNC (c’est-à-dire le cerveau, la moelle épinière et les méninges) qui conviennent à l’analyse en aval via des techniques unicellulaires, l’immunohistochimie et les méthodes d’hybridation in situ. Les méthodes décrites fournissent une analyse complète des tissus du SNC, idéale pour évaluer le phénotype, la fonction et la localisation des cellules occupant le compartiment du SNC dans des conditions homéostatiques et pendant la pathogenèse de la maladie.

Introduction

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Le système nerveux central (SNC) est un site immunologiquement spécialisé. Le parenchyme du SNC, à l’exclusion de l’espace du LCR, des méninges et du système vasculaire, est classiquement considéré comme un site privilégié par le système immunitaire 1,2,3,4,5 et est relativement dépourvu de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques 2,6,7. En revanche, les méninges, composées des couches de dure-mère, d’arachnoïde et de pia, sont des composants cruciaux du compartiment du SNC, participant activement à la surveillance immunitaire homéostatique et aux processus inflammatoires au cours de la pathogenèse de la maladie 3,6,7,8. Dans des conditions d’état d’équilibre, les méninges soutiennent de nombreuses cellules sentinelles immunitaires, notamment les cellules lymphoïdes innées (ILC), les macrophages, les cellules dendritiques (DC), les mastocytes, les lymphocytes T et, dans une moindre mesure, les lymphocytes B 9,10,11.

Les méninges sont des structures hautement vascularisées et contiennent des vaisseaux lymphatiques qui assurent une connexion lymphatique entre le SNC et sa périphérie 8,12,13,14. Dans les conditions inflammatoires induites par une lésion du SNC, des infections, une auto-immunité ou même une neurodégénérescence, les cellules immunitaires dérivées périphériques infiltrent le parenchyme et modifient le paysage immunitaire dans les méninges. Après l’infiltration cellulaire, les méninges peuvent représenter une niche fonctionnelle pour les cellules immunitaires dérivées périphériquement, favorisant l’agrégation des cellules immunitaires, l’activation locale des cellules immunitaires et la survie à long terme dans le compartiment du SNC. Une inflammation méningée importante est observée dans de multiples maladies affectant le SNC, y compris la sclérose en plaques (SEP)15,16,17,18,19, les accidents vasculaires cérébraux 20,21, les lésions stériles 22,23 (c.-à-d. lésions de la moelle épinière et les traumatismes crâniens), les migraines 24 et les infections microbiennes 25,26.27,28,29. Ainsi, la caractérisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le compartiment méningé est essentielle pour comprendre le rôle de ces cellules dans des conditions d’équilibre et de pathogenèse de la maladie.

L’extraction du cerveau, de la moelle épinière et des méninges du crâne et des corps vertébraux est techniquement difficile et prend du temps. Il n’existe actuellement aucune technique d’extraction rapide du cerveau avec les trois couches méningées intactes. Bien que la laminectomie donne une excellente morphologie du tissu de la moelle épinière et préserve les couches méningées, elle est à la fois extrêmement longue et compliquée30,31. À l’inverse, des méthodes d’extraction plus conventionnelles telles que l’ablation du cerveau du crâne et l’extrusion hydraulique de la moelle épinière facilitent l’extraction rapide du tissu du SNC, mais les méninges arachnoïdiennes et durales sont perdues avec ces techniques30,31. L’omission des couches de la dure-mère et de l’arachnoïde lors de l’isolement conventionnel des tissus du cerveau et de la moelle épinière entraîne une analyse incomplète des cellules du compartiment du SNC. Ainsi, l’identification de nouvelles techniques axées sur l’extraction rapide de tissus du SNC avec des méninges intactes est cruciale pour l’analyse optimale du compartiment du SNC.

Ce manuscrit présente deux méthodes d’extraction rapide du cerveau, de la moelle épinière et des méninges chez la souris, facilitant l’analyse en aval des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le parenchyme et les méninges du SNC. Ces protocoles optimisés se concentrent sur 1) l’isolement de suspensions unicellulaires pour l’analyse en aval et 2) la préparation des tissus pour le traitement histologique. L’obtention de suspensions unicellulaires du cerveau, du tissu de la moelle épinière et des méninges durales et arachnoïdiennes32 permet l’analyse simultanée des cellules résidant à la fois dans les compartiments parenchymateux et méningé. Les suspensions unicellulaires peuvent être utilisées dans différentes applications, y compris les tests de culture cellulaire pour effectuer une stimulation in vitro 33, l’immunospot enzymatique (ELISpot)28,34,35, la cytométrie en flux36,33 et la transcriptomique unicellulaire 37 ou en vrac. De plus, le protocole optimisé pour la décalcification de cerveaux entiers et de moelles épinières avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts, respectivement, permet une décalcification douce de l’os environnant, laissant les méninges intactes et préservant la morphologie des tissus. Cette méthode permet l’identification sélective de protéines ou d’ARN à l’aide de techniques d’immunohistochimie (IHC) ou d’hybridation in situ (ISH) dans les espaces parenchymateux et méningés. La caractérisation du phénotype, de l’état d’activation et de la localisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le SNC peut fournir des informations essentielles pour comprendre comment les types de cellules individuelles dans le compartiment du SNC contribuent à l’homéostasie et à la pathogenèse de la maladie.

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Protocole

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Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.

1. Traitement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière pour la décalcification

  1. Isolement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière
    1. Euthanasier la souris par inhalation de CO2 . Assurez-vous que le débit deCO2 déplace 10 à 30 % du volume de la cage par minute.
    2. À l’aide d’une pince, soulevez le processus xiphoïde et coupez la paroi abdominale latéralement juste en dessous de la cage thoracique avec des ciseaux, en tirant vers le haut pour éviter de couper les vaisseaux sanguins ou les organes sous-jacents. Coupez le diaphragme latéralement.
    3. Coupez la cage thoracique le long des bords latéraux parallèles aux poumons jusqu’à la clavicule. À l’aide d’une pince, soulevez le sternum et serrez-le avec un hémostatique. Placez l’hémostatique sur la tête pour soulever la cage thoracique et exposer le cœur.
    4. À l’aide d’une pince, saisissez le cœur près de son sommet et faites une incision dans l’oreillette droite du cœur pour fournir une sortie. Insérez une aiguille de 25 g avec une seringue de 10 ml attachée pour administrer lentement 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée 1x dans le ventricule gauche pour perfuser la souris par voie transcardique.
      REMARQUE : La perfusion doit se produire sur 4 à 5 minutes jusqu’à ce que le foie soit débarrassé du sang. Un total de 10 mL de 1x PBS est généralement suffisant pour la perfusion, mais plus peut être utilisé si nécessaire. Un foie clair indique généralement une perfusion adéquate.
    5. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 1 ; 1). Faites une incision médiane dans la peau (Figure 1 ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    6. Couper l’os nasal pour libérer la mandibule du crâne (Figure 1 ; 3). Retirez la mandibule, la langue et les yeux. Coupez le long des faces latérales du crâne pour libérer le tissu le long du méat auditif externe (Figure 1 ; 4). Taillez pour enlever tout excès de peau, de muscle et de tissu recouvrant le crâne.
    7. Séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale avec des ciseaux bien aiguisés (Figure 1 ; 5 et 6). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (Figure 1 ; 7). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (Figure 1 ; 8).
      REMARQUE : L’ablation de l’excès de tissu de la colonne vertébrale et du crâne est nécessaire pour obtenir une pénétration adéquate du tampon fixateur de paraformaldéhyde (PFA) et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
  2. Post-fixation, décalcification et cryoconservation
    1. À l’aide d’une pince, placer le cerveau avec le crâne ou la colonne vertébrale intact dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de PFA à 4 %. Placez les tubes à 4 °C pendant au moins 48 h pour une fixation adéquate.
      REMARQUE : Pour éviter une surfixation du tissu, ne pas dépasser 72 h de fixation. Les temps de fixation sont prolongés pour les échantillons osseux avant décalcification. Une fixation adéquate protégera les tissus des effets de la décalcification et assurera une meilleure morphologie des tissus.
    2. Rincez le cerveau ou la moelle épinière en retirant le tissu de l’APF à 4 % à l’aide d’une pince et en plaçant le tissu dans un tube jetable de 14 ml avec 10 ml de PBS 1x pendant 5 minutes. Transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube conique de 50 mL avec 10 mL d’EDTA à 10 % (pH = 7,2 à 7,4).
      REMARQUE : L’utilisation d’un tube plus grand avec 10 mL d’EDTA donne à l’EDTA une plus grande surface de contact avec le tissu et accélère le processus de décalcification.
    3. Vérifiez quotidiennement si l’os est mou et souple : retirez le tissu de la solution d’EDTA avec une pince, placez-le sur une boîte de Pétri et testez doucement la mollesse de l’os avec une aiguille de 25 G. Si l’aiguille pénètre facilement dans l’os, le processus de décalcification est terminé.
    4. Retirez le tissu de la solution d’EDTA et transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube jetable de 14 ml contenant 10 ml de 1x PBS et lavez pendant 10 minutes. Répétez le lavage.
      REMARQUE : La décalcification prend généralement 2 à 3 jours. La solution doit être changée tous les 2 à 3 jours si l’os n’est pas encore correctement décalcifié. Cependant, une incubation prolongée dans l’EDTA après la décalcification de l’os peut endommager la morphologie des tissus.
    5. Préparez des solutions de saccharose à 10 %, 20 % et 30 % en ajoutant du saccharose à 1x PBS. Par exemple, pour 10 % de saccharose, ajoutez 10 g de saccharose et portez le volume à 100 mL en utilisant du PBS stérile 1x. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à 1 mois.
      REMARQUE : Les solutions de saccharose sont sujettes à la croissance de micro-organismes, de sorte que les échantillons ne doivent pas être stockés pendant des périodes prolongées dans ces solutions.
    6. Retirez le tissu du PBS 1x, placez-le dans 10 mL de solution de saccharose à 10 % et conservez-le à 4 °C. Laissez reposer le mouchoir pendant 24 h ou jusqu’à ce qu’il coule au fond du tube.
    7. Répétez ce processus, en déplaçant d’abord le tissu vers une solution de saccharose à 20 %, puis vers une solution de saccharose à 30 %. Laisser le tissu pénétrer dans 30 % de saccharose (au moins 24 h) et procéder à l’enrobage des tissus.
  3. Enrobage et congélation des tissus
    1. À l’aide d’une pince, retirez le tissu du saccharose à 30 %, placez-le sur une boîte de Pétri et inclinez la boîte pour éliminer tout excès de solution de saccharose sur le tissu. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu en segments souhaités.
    2. Créez une fine couche de composé à température de coupe optimale (OCT) au fond du cryomoule et placez le(s) morceau(s) de tissu dans le moule. Recouvrez complètement le tissu avec le composé OCT, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles.
    3. Congelez les blocs en les survolant de l’azote liquide38 ou en les plaçant sur une boue 100 % isopropanol/glace carbonique39 jusqu’à ce que le bloc soit opaque. Enveloppez les cryomoules dans du papier d’aluminium et stockez les blocs à -80 °C pour un stockage à long terme. Déplacez les blocs à -20 °C avant de les sectionner.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la section et de l’exécution des protocoles d’histologie sur les cerveaux décalcifiés, car les couches du crâne et du méninge peuvent être perdues si les coupes sont manipulées brutalement.

2. Préparation des méninges et des tissus du SNC pour la coloration par cytométrie en flux

  1. Extraction de la calotte crânienne et du cerveau
    1. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 2A ; 1). À l’aide de ciseaux, faites une incision médiane dans la peau (Figure 2A ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    2. Placez les ciseaux à l’intérieur du foramen magna et commencez à couper le crâne latéralement le long des cortex vers le bulbe olfactif, en gardant les incisions au-dessus du méat auditif externe et de la mandibule (Figure 2A ; 3). Effectuez les mêmes incisions du côté opposé, les incisions se rejoignant au niveau du bulbe olfactif pour libérer la calotte crânienne du cerveau (Figure 2A ; 3).
    3. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne et placez-la dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu RPMI froid complété par 25 mM de HEPES. Gardez le tube sur de la glace.
    4. À l’aide d’une pince incurvée, placez la pince sous la base du cerveau et soulevez-la pour libérer le cerveau de la calotte. Placez le cerveau dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid complété par 25 mM HEPES. Gardez le tube sur de la glace jusqu’au traitement.
  2. Extraction du tissu de la colonne vertébrale et de la moelle épinière
    1. À l’aide d’une pince et de ciseaux bien aiguisés, séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale (figures 2A ; 4 et 5). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (figure 2A ; 6). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (figure 2A ; 7).
    2. Placez les ciseaux chirurgicaux extra-fins à l’intérieur de la colonne vertébrale et coupez le long du bord latéral de la colonne (Figure 2C). Coupez complètement le bord latéral opposé pour diviser la colonne vertébrale en une partie antérieure et une partie postérieure.
      REMARQUE : La moelle épinière restera attachée à la colonne vertébrale.
    3. À l’aide d’une pince, retirez lentement et soigneusement la moelle épinière de la colonne vertébrale et placez le tissu dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES. Transférez les parties antérieure et postérieure de la colonne vertébrale dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES.
  3. Enlever les méninges pour préparer des suspensions unicellulaires
    1. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne du support RPMI. À l’aide d’une pince tranchante (pince #7 ; Table des matériaux), entaillez le pourtour du bord extérieur de la calotte crânienne (figure 2B) et retirez les méninges du bord de la calotte crânienne, en grattant pour enlever les méninges durales et arachnoïdiennes. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
      REMARQUE : L’ablation des méninges du cerveau et de la moelle épinière nécessite de la pratique. Si l’utilisateur éprouve des difficultés à extraire les méninges, utilisez un microscope à dissection pour faciliter le retrait.
    2. Retirez la colonne vertébrale du tube. À l’aide d’une pince tranchante, entaillez les bords de la colonne vertébrale pour libérer les méninges et décollez les méninges du bord de la vertèbre à l’aide d’une pince courbée. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
    3. Placer une crépine en maille de nylon dans un tube conique de 50 ml. Déplacez les méninges dans la passoire et ajoutez 3 mL de RPMI complété par 25 mM HEPES. À l’aide du piston d’une seringue de 5 ml, broyer le tissu et le milieu à travers la passoire.
    4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, laver la crépine avec 2 à 3 mL supplémentaires de milieu RPMI/HEPES jusqu’à ce que tous les tissus visibles aient traversé la crépine.
      REMARQUE : Pour obtenir un nombre de cellules adéquat pour l’analyse par cytométrie en flux, il peut être nécessaire de regrouper les méninges de plusieurs animaux. Dans cette expérience (Figure 3 et Figure 4), les méninges du cerveau et de la moelle épinière de 4 à 5 souris ont été regroupées. Si les échantillons sont regroupés, des milieux supplémentaires seront nécessaires pour broyer le tissu à travers la crépine en nylon afin d’éviter la surchauffe du tissu.
    5. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, transférer les cellules et le milieu dans un tube conique neuf de 15 ml. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver le tube conique de 50 mL avec 5 mL de milieu pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    6. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans un volume et un tampon appropriés.
    7. Pour compter la suspension unicellulaire, diluer un petit volume de cellules (c.-à-d. 5 à 10 μL) à l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan (dilution 1 :10) et d’un RPMI. Ajouter 10 μL de dilution dans l’hémocytomètre.
    8. Comptez les cellules comme décrit précédemment40,41, en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour plus de précision.
      NOTA : Dans la figure 3, par exemple, des cellules groupées et granulées des méninges ont été remises en suspension dans 250 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (1 x PBS avec 1 % de FBS) pour la coloration de surface en aval. Les cellules ont été diluées à l’échelle 1 :10 pour le comptage (5 μL de cellules, 5 μL de bleu de trypan, 40 μL de RPMI). Cette dilution a permis d’obtenir entre 50 et 100 cellules par 16 grilles carrées, ce qui garantit un comptage plus précis des cellules, car les cellules ne sont ni trop denses, ni trop superposées, ni trop clairsemées. Le nombre de cellules nucléées provenant de méninges cérébrales et méninges de la moelle épinière regroupées par souris était le suivant : pour les méninges de souris traitées par simulacre = 100 000 à 150 000 cellules et pour les méninges de souris atteintes de la maladie démyélinisante induite par le virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV-IDD) = 300 000 à 350 000 cellules. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence d’une inflammation méningée.
    9. Passez à la technique unicellulaire souhaitée telle qu’une surface FACS (Figure 3)14,36,42,43,44, des protocoles de coloration intracellulaire 33,45, de la stimulation in vitro, des essais de culture cellulaire 33,46,47, du test ELISPOT 28,34,35 et des tests en vrac ou unicellulaires transcriptomique 37,48.
      REMARQUE : Gardez tous les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
  4. Préparation de suspensions unicellulaires de tissus cérébraux et de moelle épinière
    1. Transférez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le milieu vers le haut de la boîte de Pétri de 100 mm en versant le tissu et le milieu à partir du tube. À l’aide d’une pince, déplacez le tissu au fond de la boîte de Pétri. Hacher finement le cerveau ou la moelle épinière à l’aide d’une lame de rasoir stérile. À l’aide de la lame de rasoir, déplacez le tissu haché vers le fond de l’assiette en grattant pour rassembler le tissu.
      REMARQUE : Pour le protocole de digestion enzymatique ci-dessous, jusqu’à deux moelles épinières peuvent être regroupées pour le traitement. Les cerveaux doivent être traités individuellement.
    2. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de RPMI additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, pipeter de haut en bas pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférer dans un tube conique de 15 mL.
      REMARQUE : Si l’application en aval est l’analyse de séquençage de l’ARN ou la culture cellulaire d’une seule cellule ou en vrac, les lots de FCS doivent être testés pour s’assurer que les cellules ne sont pas activées avant l’analyse. Alternativement, les cellules peuvent être traitées en utilisant 1x PBS avec 0,04% BSA au lieu de RPMI avec 10% FCS.
    3. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver la boîte de Pétri avec 2 mL supplémentaires de milieu pour recueillir tout tissu résiduel et transférer dans un tube conique pour obtenir un volume total de 5 mL. Gardez les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
    4. À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la poudre de collagénase I dans le milieu Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) pour obtenir la concentration désirée (c.-à-d. 100 mg/mL). Ajouter la collagénase de type I dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir la concentration finale désirée (c.-à-d. 50 μL pour 1 mg/mL).
      REMARQUE : Des concentrations plus élevées de collagénase augmenteront les rendements cellulaires, mais peuvent cliver les marqueurs de surface cellulaire. Par conséquent, les lots de collagénase I doivent être titrés pour déterminer la concentration optimale nécessaire pour obtenir le plus grand nombre de cellules viables avec tous les marqueurs de surface cellulaire requis intacts. Par exemple, la collagénase I a été testée à des concentrations finales de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL et 2 mg/mL sur des échantillons de cerveau ou de moelle épinière. La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan et les marqueurs de surface cellulaire CD45, CD19 et CD4 ont été évalués par cytométrie en flux. Une concentration de 1 mg/mL de collagénase I a permis d’obtenir le nombre de cellules vivantes le plus élevé tout en conservant tous les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt. Ainsi, cette concentration a été utilisée pour d’autres expériences examinant ces types de cellules.
    5. Remettre délicatement en suspension la poudre de DNase I en utilisant du chlorure de sodium de 0,15 M jusqu’à la concentration de base souhaitée. Ajouter la DNase I remise en suspension dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir une concentration finale de 20 U/mL.
      REMARQUE : Les lots de DNase I varient selon les unités d’activité par mL. La concentration à ajouter à l’échantillon de tissu changera en fonction des unités d’activité par millilitre du flacon de stock. La concentration finale souhaitée par échantillon est de 20 U/mL.
    6. Placez les tubes dans un portoir à tubes au bain-marie à 37 °C et incubez-les pendant 40 min. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes. Après incubation, ajouter 500 μL d’EDTA 0,1 M (pH = 7,2) dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 M EDTA et incuber pendant 5 min supplémentaires pour inactiver la collagénase.
    7. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 9 mL de RPMI complété par 10 % de FCS dans chaque tube pour porter le volume de chaque tube à ~14,5 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille de cellule.
    8. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % dans le tube contenant la pastille cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter un milieu RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 mL et remettre en suspension la pastille cellulaire pour créer une couche de solution de gradient de densité isotonique à 30 %.
      REMARQUE : Préparer le milieu à gradient de densité isotonique 100 % à l’avance, aliquote, et conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour préparer la solution de gradient de densité isotonique à 100 %, diluer le milieu de gradient de densité (tableau des matériaux) avec un tampon de dilution du milieu de gradient de densité. Préparer le tampon de dilution du milieu à gradient de densité (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl ; 0,73 g/L de Na 2 HP0 4, 0,20 g/L de KH2HP04 ; 20,0 g/L de glucose) et stériliser le filtre à l’aide d’un système de filtration sous vide. Préparez la solution de gradient de densité isotonique à 100 % en mélangeant 1 partie de tampon de dilution de gradient de densité et 9 parties de milieu de gradient de densité. Bien mélanger.
    9. Retournez et mélangez bien chaque tube avant d’ajouter la sous-couche de solution de gradient de densité isotonique à 70 %. Insérez une pipette sérologique de 1 mL contenant 1 mL de solution de gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube. Déposer lentement 1 mL de la solution, en prenant soin de ne pas faire de bulles. Retirez lentement la pipette sérologique du tube, en prenant soin de ne pas perturber le gradient.
      REMARQUE : Pour la sous-couche à 70 %, la solution de gradient de densité isotonique à 100 % doit être diluée à 70 % à l’aide d’un média RPMI (c.-à-d. 7 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % et 3 mL de substrat RPMI bien mélangés). De plus, la création d’une sous-couche propre et non perturbée à 70 % est essentielle pour l’élimination des débris de myéline et pour l’obtention de suspensions unicellulaires pures à l’interface du gradient après centrifugation.
    10. Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à 4 °C sans frein. Aspirer le surnageant, y compris la couche de débris de myéline, jusqu’à ce qu’il reste 2 à 3 ml dans le tube, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Prélever la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30 et 70 % à l’aide d’une pipette de 1 mL et la transférer dans un nouveau tube conique de 15 mL.
    11. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter le milieu FPS à 10 % RPMI pour porter le volume final à 15 mL. Centrifuger 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
      REMARQUE : Au cours de cette étape, les couches cellulaires de deux tubes peuvent être regroupées si nécessaire. Ne mettez pas en commun plus de deux tubes, sinon les cellules ne granuleront pas en raison d’une concentration de milieu à gradient haute densité.
    12. Aspirez le surnageant avec précaution pour ne pas perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans un volume/tampon approprié pour les compter à l’aide d’un hémocytomètre (p. ex., remettre en suspension une seule moelle épinière dans 250 μL de tampon FACS pour la coloration de la surface en aval) (figure 3).
    13. À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférez les suspensions cellulaires dans le haut d’un tube supérieur filtrant (tableau des matériaux) et laissez les cellules filtrer vers le fond du tube pour éliminer les débris de myéline restants.
    14. À l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan, diluez et comptez les cellules sur un hémocytomètre en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour une précisionde 40,41.
    15. Procédez à la technique d’analyse unicellulaire souhaitée.
      REMARQUE : À l’aide de diverses formes de collagénase (c.-à-d. D, type I, type II, type IV), les cellules immunitaires, la microglie (Figure 3), les astrocytes, les péricytes, les cellules endothéliales49 et les neurones50 peuvent tous être isolés efficacement. Le nombre de cellules nucléées obtenues pour les résultats était le suivant à l’aide de l’enzyme collagénase I titrée : cerveau entier traité par simulacre = 500 000 à 600 000 cellules ; Cerveau entier TMEV-IDD = 800 000 à 1 000 000 de cellules ; Moelle épinière entière traitée par simulacre = 150 000 à 200 000 cellules ; Moelle épinière TMEV-IDD entière = 300 000 à 400 000. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence ou non d’une inflammation du SNC.

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Résultats

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Cette expérience représentative visait à quantifier les lymphocytes B et T et à décrire la localisation des lymphocytes B et T dans les compartiments méningés et parenchymateux du SNC dans des conditions homéostatiques ainsi que dans un modèle murin de SEP progressive (c’est-à-dire TMEV-IDD). Le TMEV-IDD a été induit chez des souris SJL femelles âgées de 5 semaines par une infection intracrânienne avec 5 x 106 unités formant la plaque (PFU) de TMEV BeAn, comme décrit précédemment29.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes d’évaluation de la composition cellulaire dans le compartiment du SNC au cours de l’homéostasie et de la maladie sont essentielles pour comprendre les états physiologiques et pathologiques du SNC. Cependant, bien qu’elles constituent une barrière importante dans le SNC et qu’elles abritent un large éventail de cellules immunitaires, les méninges sont souvent omises de l’analyse car de nombreuses méthodes conventionnelles d’extraction de tissus pour le cerveau et la moelle épinière ne permettent pas la collec...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins spécialisés qu’ils ont prodigués aux souris utilisées pour ces études. Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche de Bornstein.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuilled’aluminium n’importe quelN/A
Sérum bovin AlbumineThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeuseBeckman CoulterAllegra X-12R Centrifugeuse
Collagénase IWorthingtonLS004196
Tube conique, 15 mLVWR525-1069
Tube conique, 50 mLVWR89039-658
Verre de couvertureHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Pince incurvéeFine Science Tools11003-14
Tube jetable en polystyrène, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Scalpel jetableFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Glace carboniqueAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA sel disodique dihydratéAmresco0105-500g
Éthanol, 100 %anyN/A
Sérum fœtal bovin (FBS)HycloneSH30910.03
Tube supérieur filtrant, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Cytomètre en fluxBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
IgG anti-souris de chèvre (conjugué 488)Jackson immunoresearch115-546-146
IgG anti-souris de chèvre (594 conjugué)Jackson immunoresearch115-586-146
Chèvre anti-lapin 488Jackson immunorecherche111-545-144
Chèvre anti-rat 594Jackson immunorecherche112-585-167
Chèvre anti-rat 650Jackson immunorecherche112-605-167
Hank’s Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HémacytomètreAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chimiqueBP366-500
KH2PO4 (anhydre)Sigma AldrichP5655-100G
Azote liquideAirgasN/A
Souris Bloc FC (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydre)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Aiguille, calibre 25Becton Dickinson305122
Sérum de souris normalThermoFisher Scientific31881
Passoire à maille de nylonVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldéhyde, 20 %Microscopie électronique Sciences15713-SDilué à 4 % à l’aide de 1 x
pipette PBS Pasteur, 9 pouces, débranchéeFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Souris CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Souris CD19Becton Dickinson562329
Percoll Density Gradient MediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Boîte de Pétri, 100 mmVWR353003
pH-mètreFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 & micro ; lGilsonFA10005M
Pointes de pipette, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pointes de pipette, 200 µ ; lUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond avec DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-souris CD3 (clone SP7)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-souris ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Pipette sérologique, 1 mLVWR357521
Pipette sérologique, 10 mLVWR357551
Pipette sérologique, 5 mLVWR357543
Hydroxyde desodiumFisher ScientificS318-100
SaccharoseFisher chemicalS5-500
Ciseaux chirurgicauxFine Science Tools14001-16
Ciseaux chirurgicaux, extra fineSeringue RobozRS-5882
, 10 mLSeringue 302995
, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Système de filtration sous videMillipore20207749
Bouteille à videThomas Scientific5340-2L
Filtre sous vide en lignePall Corporation4402
Conduite à videCole PalmerEW-06414-20
Bain-marieThermoFisher ScientificVersa bain
Becton Dickinson

Références

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  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1(2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714(2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226(2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44(2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229(2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198(2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752(2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752(2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45(2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092(2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952(2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

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