Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.
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Article de méthode
Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le maintien d’un protéome sain est essentiel pour l’homéostasie cellulaire et organisationnelle. La perturbation de l’équilibre entre le contrôle translationnel des protéines et la dégradation provoque une multitude de maladies liées à l’âge. Le déclin des mécanismes de contrôle de la qualité de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Les méthodes biochimiques de détection de la synthèse des protéines de novo sont encore limitées, présentent plusieurs inconvénients et ne peuvent pas être effectuées dans des cellules vivantes ou des animaux. Caenorhabditis elegans, transparent et facilement génétiquement modifié, est un excellent modèle pour surveiller les taux de synthèse des protéines en utilisant des techniques d’imagerie. Ici, nous introduisons et décrivons une méthode pour mesurer la synthèse de la protéine de novo in vivo en utilisant la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Les animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules ou des tissus spécifiques sont irradiés par une source lumineuse puissante ayant pour résultat le photobleachage de fluorescence. À son tour, l’évaluation de la récupération de fluorescence signifie une nouvelle synthèse des protéines dans les cellules et/ou les tissus d’intérêt. Par conséquent, la combinaison de nématodes transgéniques, d’interventions génétiques et/ou pharmacologiques ainsi que d’imagerie vivante des taux de synthèse des protéines peut faire la lumière sur les mécanismes de médiation de l’effondrement de la protéostase dépendante de l’âge.
Introduction
La synthèse et la dégradation des protéines sont essentielles à l’homéostasie organisationnelle. Une multitude de maladies liées à l’âge sont provoquées par la production de protéinesdéfectueuses 1,2. Afin de mesurer les taux mondiaux de traduction des protéines, il existe des techniques biochimiques telles que le profilage ribosomal, qui implique le séquençage profond des fragments d’ARNm protégés par le ribosome pour surveiller l’expression ainsi que la synthèse des protéinesnouvelles 3. Cette méthode, en plus d’être une lecture indirecte des taux de traduction, comme l’association accrue de l’ARN aux ribosomes ne signifie pas nécessairement une traduction accrue, a des inconvénients techniques, tels que le coût élevé et une exigence d’une grande quantité de matériel de départ. D’autre part, les méthodes à base de protéomique permettent une quantification directe des protéines par le profilage métabolique des impulsions suivie d’une analyse de spectrométrie de masse4,5. Cependant, il s’agit d’une approche semi-quantitative avec une résolution temporelle limitée qui ne peut pas être facilement utilisée in vivo. En outre, l’étiquetage de la protéine peut être inégalement réparti dans l’animal/tissu d’intérêt. Fait important, ces deux méthodes peuvent dissimuler des variations spécifiques aux tissus ou des cellules dans les taux de traduction des protéines chez des animaux entiers ou des tissus, respectivement.
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle facile à utiliser qui peut être cultivé en grand nombre6. En outre, son agrément génétique et sa transparence permettent l’imagerie vivante in vivo. Ce protocole décrit la méthodologie pour détecter les taux de synthèse des protéines à l’aide de la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Nous profitons de l’expression transgénique des protéines fluorescentes, soit dans l’organisme entier, soit dans des tissus/cellules spécifiques. Les animaux transgéniques peuvent soit exprimer le GFP en utilisant le promoteur d’un gène, qui est largement/globalement exprimé ou un promoteur spécifique aux tissus pour cibler des types de cellules spécifiques. Cette technique peut être étendue à un promoteur spécifique pour examiner les taux de synthèse des protéines d’une protéine spécifique.
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Protocole
REMARQUE : Les fusions transcriptionnelles et translationnelles aux fluorophores peuvent être utilisées pour évaluer la traduction de protéines de novo dans plusieurs tissus. Les taux de synthèse des protéines peuvent être évalués pour plusieurs familles de protéines qui ont été localisées dans différents compartiments cellulaires, y compris le cytoplasme, les mitochondries et le noyau7. Les souches suivantes sont utilisées pour surveiller les taux globaux et de synthèse des protéines neuronales, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour la surveillance de la synthèse des protéines novo
- Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour évaluer les stades de développement et la croissance du type sauvage (wt) et des nématodes transgéniques mutants.
- Jour 1 : Utilisez une pioche de vers pour sélectionner et transférer 10 larves de L4 d’animaux transgéniques wt et mutants portant le journaliste fluorescent souhaité sur les plaques nematode Growth Media (NGM) ensemencées d’Escherichia coli (OP50) (Tableau 1).
- Faites une sélection de vers en attachant un fil de platine dans l’extrémité effilée d’une pipette pasteur en verre en faisant fondre le verre sur le site de contact sur un brûleur Bunsen. Ensuite, aplatir l’extrémité du fil de platine en forme de spatule à l’aide de n’importe quel outil (p. ex., pince ou marteau léger).
- Inoculer une seule colonie de bactéries E. coli (OP50) dans une fiole contenant 50 ml de milieu liquide Luria-Bertani (LB) et se développer pendant 10 heures à 37 °C dans un incubateur de secousses (200 tr/min; Tableau 1). Ensuite, les plaques de NGM de semences avec 200 μL de culture bactérienne. Incuber les plaques ensemencées à température ambiante pendant la nuit pour permettre la croissance de la pelouse bactérienne.
- Incuber et faire pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.
- Jour 5 : Les plaques contiennent une population mixte de vers transgéniques. Sélectionner et transférer 15 larves L4 de chaque souche sur des plaques OP50-NGM fraîchement ensemencées.
- Jour 6 : Effectuer l’analyse FRAP et surveiller le taux de synthèse des protéines le premier jour de l’âge adulte.
- Préparer et utiliser le cycloheximide contenant des plaques NGM comme un contrôle positif :
REMARQUE : Préparez une solution de bouillon de cycloheximide en diluant dans l’eau à une concentration de 10 mg/mL. Conserver la solution de stock à 4 °C.- Tuer les bactéries en exposant les plaques de NGM ensemencées pendant 15 minutes avec la lumière UV (222 μW/cm2 intensité).
- Ajouter le cycloheximide sur les plaques à graines bactériennes à une concentration finale de 500 μg/mL dans le volume d’agar.
- Laisser sécher les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes.
- Transférer des nématodes transgéniques exprimant psod-3GFP sur les plaques contenant des véhicules et des cycloheximide.
- Incuber les animaux pendant 2 h à la température standard de 20 °C.
2. Essai FRAP utilisant des animaux transgéniques exprimant les reporters de tissu somatique pife-2GFP et psod-3GFP
REMARQUE : Surveiller le taux global de synthèse des protéines dans tout le corps animal. Ces reporters transcriptionnels présentent différents niveaux d’expression et sont omniprésents dans les tissus somatiques multiples, y compris l’intestin, le pharynx et les muscles de la paroi du corps.
- Choisissez et transférez des animaux transgéniques d’un jour sur des plaques NGM individuelles ensemencées d’une goutte op50 de 20 μL dans le centre.
- Retirez le couvercle et placez chaque plaque sous une lentille objective 20x d’un microscope à épifluorescence.
- Concentrez-vous et capturez une image de référence avant de photobleaching (pré-blanchiment).
- Photobleach chaque échantillon pendant 10 minutes.
REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement. - Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
- Gardez les animaux dans des plaques NGM individuelles et laissez-les récupérer.
- Image et enregistrer la récupération de chaque journaliste fluorescent toutes les 1 heure pendant au moins 6 heures à un stéréomicroscope de fluorescence.
- Sinon, effectuer une évaluation de récupération fluorescente à l’aide d’un microscope à épifluorescence (p. ex., AxioImager Z2).
- Évaluez soigneusement la santé animale par animal en surveillant leur locomotion, leur sensibilité au toucher, leur capacité de reproduction et leur survie au cours des 3 prochains jours. Les nématodes montrant des signes de dommages après photobleaching ont été exclus de l’analyse plus poussée.
3. Montage des échantillons et effectuer des essais FRAP à l’aide de nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal, punc-119GFP
REMARQUE : Surveillez la synthèse des protéines pan-neuronales par photobleaching ciblé à la région de la tête, où se trouve l’anneau nerveux.
- Préparer 2% de coussinets agarose.
- Ajouter une goutte de tampon M9 de 10 μL au centre du tampon agarose.
- Transférez 5 nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal dans une goutte de tampon M9.
- Utilisez un cil pour répandre le liquide.
REMARQUE : Les animaux affichent des mouvements réduits dans les 2 minutes en raison de l’absorption de M9 dans l’agar. - Changez la position du nématode pour éviter de vous chevaucher à l’aide d’un pic à cils.
- Placez l’échantillon sous une lentille objective 40x d’un microscope à épifluorescence.
REMARQUE : N’utilisez pas de couvercle. - Concentrez et capturez une image de référence (pré-blanchiment).
- Photobleach la zone d’intérêt ciblée pendant 90 secondes.
REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement. - Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
- Ajoutez une goutte de tampon M9 de 10 μL sur les nématodes photobleached.
- Laisser les animaux récupérer pendant 5 minutes.
- Utilisez le pic à cils ou une pipette pour transférer les nématodes sur des plaques NGM individuelles ensemencées de 20 μL OP50 au centre.
- Capturez une image de chaque échantillon toutes les 1 heure sous un stéréomicroscope d’épifluorescence.
REMARQUE : Comptez t=0 pour le temps de récupération après le photobleaching.
4. Analyse des données des images capturées pendant l’essai du FRAP
- Analyser les images acquises à l’aide d’un logiciel (p. ex., Fidji).
- Ouvrez des images avec le logiciel.
- Sélectionnez la commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur.
REMARQUE : Conservez l’image du canal vert. - Utilisez l’outil Sélection à main levée pour régler manuellement la région fluorescente d’intérêt (p. ex., corps entier, tête, intestin).
- Sélectionnez la commande Mesure via le menu déroulant Analyser pour mesurer l’intensité moyenne des pixels de la zone d’intérêt pour chaque point de temps.
REMARQUE : Le pourcentage de récupération de fluorescence est calculé à l’aide des images de référence capturées après le photobleaching.
5. Analyse statistique du rapport
- Utilisez au moins 20 à 25 nématodes de chaque souche et/ou condition.
REMARQUE : Trois répliques biologiques doivent être effectuées. - Effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec P < 0,05 comme significatif à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.
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Résultats
À l’aide de la procédure présentée ici, des nématodes transgéniques sauvages et mutants exprimant les reporters somatiques suivants, pife-2GFP, psod-3GFP et punc-119GFP, ont été utilisés pour évaluer les taux de synthèse des protéines selon les protocoles respectifs. En particulier, les vers mutants de type sauvage et d’ife-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans leurs tissus somatiques en utilisant le promoteur
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Discussion
La modulation de synthèse protéique est essentielle à l’homéostasie organisationnelle. Pendant le vieillissement, la synthèse globale ainsi que spécifique des protéines est perturbée. Des études récentes révèlent que l’équilibre de traduction de protéine contrôle directement la sénescence et le vieillissement n’est pas simplement un sous-produit du processus de vieillissement. En particulier, les composants de base des machines de traduction tels que le facteur d’initiation eucaryote 4E (eIF4E), qui facilite le plafonnem...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Tampons d’agarose 2 % | |||
| Chlorure de calcium déshydraté (CaCl2 ?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholestérol | SERVA Électrophorèse | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Stéréomicroscope de dissection | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427) ; Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| Microscope à épifluorescence | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli souche OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Stéréomicroscope à dissection de fluorescence | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Boîtes de Pétri Greiner (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(OK306) ; Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| logiciel d’analyse d’images | Fidji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB Tampon | |||
| M9Sulfate de magnésium (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Lames de microscope (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Progiciel Excel | Microsoft Corporation, Redmond, États-Unis< | ||
| em>N2 ; Ex[pife-2GFP ; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| N2 ; Ex[psod-3GFP ; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| N2 ; Ex[punc-119GFP ; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Milieu de croissance des nématodes (NGM) plaques | |||
| Solution mère de nystatine | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Tampon | |||
| Chlorure de sodium (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Équipement standard pour la préparation de plaques de gélose (autoclave, boîtes de Pétri, etc.) | |||
| Équipement standard pour l’entretien des vers (pic à fil de platine, incubateurs, etc.). | |||
| logiciel d’analyse statistique | GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis | Progiciel GraphPad Prism | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| vis sans fin |
Références
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
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- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
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- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547(2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
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Réimpressions et autorisations
