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Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

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DOI :

10.3791/61178

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14 mai 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour bloquer le flux lymphatique par suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents est présenté.

Résumé

Les vaisseaux lymphatiques sont essentiels au maintien de l’équilibre des fluides tissulaires et à l’optimisation de la protection immunitaire en transportant des antigènes, des cytokines et des cellules vers les ganglions lymphatiques drainants (LN). L’interruption du flux lymphatique est une méthode importante lors de l’étude de la fonction des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques afferents du pied murin aux ganglions lymphatiques popliteal (pLNs) sont bien définis comme les seules voies pour le drainage lymphatique dans les pLN. Le suturing ces vaisseaux lymphatiques afferents peut sélectivement empêcher le flux lymphatique aux pLNs. Cette méthode permet d’interférer dans le flux lymphatique avec des dommages minimes aux cellules endothéliales lymphatiques dans le pLN drainant, les vaisseaux lymphatiques afferents, ainsi que d’autres vaisseaux lymphatiques autour de la région. Cette méthode a été utilisée pour étudier comment la lymphe affecte les venules endothéliales élevées (HEV) et l’expression de chimiokine dans le LN, et comment la lymphe coule par le tissu adipeux entourant le LN en l’absence des vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Avec la reconnaissance croissante de l’importance de la fonction lymphatique, cette méthode aura des applications plus larges pour démêler davantage la fonction des vaisseaux lymphatiques dans la régulation du microenvironnement LN et des réponses immunitaires.

Introduction

L’organisation spatiale du système lymphatique fournit un soutien structurel et fonctionnel pour éliminer efficacement le liquide extracellulaire et transporter les antigènes et les cellules présentant des antigènes (APC) vers les LN drainants. Les vaisseaux lymphatiques initiaux (également appelés capillaires lymphatiques) sont hautement perméables en raison de leurs jonctions intercellulaires discontinues, qui facilitent la collecte efficace des fluides, des cellules et d’autres matériaux des espaces extracellulairesenvironnants 1. Les vaisseaux lymphatiques initiaux fusionnent dans la collecte des vaisseaux lymphatiques, qui ont des jonctions intercellulaires serrées, une membrane continue de sous-sol, et la couverture lymphatique de muscle. La collecte des vaisseaux lymphatiques sont responsables du transport de la lymphe recueillie vers les LN drainants et, éventuellement, le retour de la lymphe à la circulation2,3. Les vaisseaux lymphatiques de collecte qui propulsent la lymphe dans le LN drainant sont les vaisseaux lymphatiques afferents4,5,6,7. L’obstruction des vaisseaux lymphatiques afferents peut bloquer le flux lymphatique dans les LNs, qui est une technique utile lors de l’étude de la fonction du flux lymphatique.

Des études antérieures ont montré que le flux lymphatique joue un rôle important dans le transport des antigènes et des APC, ainsi que dans le maintien de l’homéostasie du LN. Il est bien entendu que les APC dérivés des tissus, généralement activés cellules dendritiques migration (CD), voyagent à travers les vaisseaux lymphatiques afferents vers le LN pour activer les lymphocytes T8. L’idée que les antigènes de forme libre, tels que les microbes ou les antigènes solubles, s’écoulent passivement avec la lymphe vers le LN pour activer les APC résidents de LN a gagné l’acceptation au cours dela dernière décennie 9,10,11,12. Les antigènes de forme libre voyageant avec la lymphe prennent quelques minutes après l’infection pour se rendre au LN, et l’activation cellulaire ln-résidente peut se produire dans les 20 minutes après la stimulation. C’est beaucoup plus rapide que l’activation des CD migrateurs, qui prend plus de 8 h pour entrer dans le LN9 drainant. En plus de transporter des antigènes pour initier la protection immunitaire, la lymphe transporte également des cytokines et des DCs au LN pour maintenir son microenvironnement, et pour soutenir l’homéostasie de cellulesimmunitaires 13,14. Auparavant, le blocage du flux lymphatique en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents a démontré que la lymphe est nécessaire pour maintenir le phénotype HEV nécessaire pour soutenir la cellule T homéostatique et la cellule B homing à la LN15,16,17. CCL21 est une chimiokine critique qui dirige le positionnement des cellules DC et T dans le LN8,18. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression du CCL21 dans le LN et interrompt potentiellement le positionnement et/ou l’interaction des cellules DC et T dans le LN19. Ainsi, le blocage du flux lymphatique peut abroger directement ou indirectement l’accès à l’antigène/DC au LN drainant en perturbant le microenvironnement LN qui régule les réponses immunitaires dans le LN. Pour mieux étudier la fonction du flux lymphatique, un protocole expérimental est présenté (figure 1) pour bloquer le flux lymphatique chez la souris en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode peut être une technique importante pour de futures études sur la fonction lymphatique dans des conditions saines et maladies.

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Protocole

Tous les travaux sur les animaux doivent être approuvés par le comité institutionnel et gouvernemental d’éthique et de manipulation des animaux.  C’est une opéra tion de non-survie.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % en mélangeant 70 mL d’éthanol à 100 % avec 30 mL d’eau stérile. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie et garder les outils dans 70% d’éthanol avant et pendant la chirurgie pour maintenir la stérilisation.
  2. Préparer un appareil d’injection.
    1. Coupez ~30 cm de tube en polyéthylène (0,28 mm de diamètre). Connectez la pointe d’une aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille A) à une extrémité du tube de polyéthylène. Déloger soigneusement une autre aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille B) et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène.
    2. Fixez l’aiguille A à une seringue tuberculine de 1 mL.
      REMARQUE : Pour ce tube en polyéthylène, 1,6 cm de liquide dans le tube correspond à 1 μL20.
  3. Préparer un mélange kétamine/xylazine 10:1 (10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine) dans le chlorure de sodium salin (bactériostatique 0,9 % [w/v]. Préparez la solution fraîchement avant utilisation.

2. Préparation de l’animal pour la chirurgie

REMARQUE : Utilisez des souris âgées de 6 à 10 semaines. Les souris femelles et mâles peuvent être utilisées. Dans cette étude, des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été utilisées. Cette méthode peut être adaptée à d’autres souches de souris.

  1. Anesthésier la souris en injectant 250 μL du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally. Attendez que la souris soit complètement endormie. Assurez-vous que la souris ne réagit pas à une pincement d’un outeil pour détecter l’anesthésie complète.
  2. Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux.
  3. Appliquer la crème depilatory autour de la jambe et attendre 5 min. Essuyez la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide et nettoyez la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. L’éthanol est limité au site d’incision.

3. Suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents

REMARQUE: La jambe droite est sutured, et la jambe gauche est utilisée comme le contrôle factice. Le protocole de suture lymphatique (étapes 3.1−3.8) prend 20−30 min.

  1. Gardez la souris à une position couchée et fixez-la avec du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.
  2. Injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu ou 9 cm du fluide de l’appareil d’injection tube dans le footpad. Masser doucement le pavé pour aider Evans blue à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques.
    REMARQUE : La seringue à insuline n’est pas facile à contrôler pour l’injection en petit volume. Le volume peut être contrôlé avec plus de précision à l’aide de l’appareil d’injection. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par colorant bleu sous la peau. Avec une formation approfondie, les deux vaisseaux lymphatiques afferents peuvent être vus à l’œil nu comme des vaisseaux transparents dans le tissu adipeux, parallèlement à l’artère saphenous. Avec une formation approfondie, il est possible de suturer les vaisseaux sans injecter evans colorant bleu dans les cas où il ya des préoccupations de perturbations potentielles de la teinture.
  3. Sous un microscope disséquant, choisissez un emplacement d’incision de 5 mm à partir du bord inférieur de la fossa popliteal. Faire une petite incision (~5 mm) dans la peau avec des ciseaux. À l’aide de forceps d’opération fine, étirer l’incision, et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte (Figure 1A).
    REMARQUE : Si nécessaire, un petit fragment de peau peut être enlevé pour exposer les vaisseaux lymphatiques.
  4. Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux PLN sous le microscope disséquant (Figure 1B).
    REMARQUE : Il y a deux vaisseaux lymphatiques afferents du footpad au pLN. Les deux doivent être sutured pour bloquer le flux lymphatique complètement.
  5. À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture (0,7 métrique ou plus petite) entre le vaisseau lymphatique afferent et l’artère saphénienne et tirez l’aiguille doucement autour du vaisseau lymphatique afferent. Tirez doucement la corde de suture et laissez environ 2 cm de la corde de suture derrière. Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher la corde étroitement pour suturer un vaisseau lymphatique avec le nœud d’un chirurgien (figure 1C).
    REMARQUE : Le tissu sous l’incision peut se dessécher avec une exposition prolongée à l’air. Faire l’incision aussi petite que possible et effectuer la suture rapidement (c.-à-d., dans les 5 minutes) empêchera le tissu de sécher. Maintenir l’humidité des tissus en appliquant un petit volume de solution saline à l’moyen d’un coton-tige.
  6. Masser doucement le pavé pour s’assurer qu’aucun colorant Evans Blue ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux.
  7. Effectuez les mêmes étapes de suture (c.-à-d. les étapes 3.5 et 3.6) sur l’autre vaisseau lymphatique afferent(figure 1D). Fermez l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisée pour suturer les vaisseaux à l’étape 3.5 (Figure 1E).
  8. Pour le contrôle factice, injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu au pied gauche et masser le footpad pour visualiser les vaisseaux lymphatiques. Ouvrez la peau avec une excision, puis fermez la plaie sans suturer le navire (Figure 1F).
  9. En option, surveillez les souris opérées pendant 2−4 h. Le côté suture de la jambe devrait montrer l’oedème avec Evans Blue écarté à la cuisse, tandis que la jambe de commande montrera le colorant bleu d’Evans limité dans le footpad. Si les souris se réveillent, un mélange supplémentaire de kétamine/xylazine sera injecté pour rester anesthésié jusqu’à l’euthanasie.

4. Suivi du flux lymphatique

  1. Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 μL de 2% d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans le pied du contrôle et de la jambe sutured lymphatique.
  2. Euthanasier les souris avec 400 μL de mélange kétamine/xylazine et effectuer la dislocation cervicale lorsque les souris sont entièrement anesthésiés.
  3. Recueillir les pLN de la fossa popliteal et retirer soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN sous le microscope de dissection à 2, 6 et 12 h après l’injection de FITC.
  4. Intégrer les pLN avec la zone des sinus médullaires face au côté du cryomold dans le composé de température de coupe optimale (OCT) composé (Figure 1G,H).
  5. Préparer 20 sections congelées de μm à l’aide d’un cryotome.
  6. Imagez les cryosections sous un microscope confocal pour déterminer la distribution du FITC.

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Résultats

Suture des vaisseaux lymphatiques a été utilisé dans les étudesprécédentes 15,16,17,19, où il a servi d’outil important pour étudier la fonction du flux lymphatique avant la biologie moléculaire des vaisseaux lymphatiques a été mieux compris. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’homéostasie LN, ce qui conduit à hevs perdre l’expression génétique critique nécessaire pour homing lymphocyte...

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Discussion

Le blocage du flux lymphatique aura de larges applications dans la manipulation de l’administration d’antigènes au LN dans des conditions saines et maladies. Il est possible d’utiliser cette méthode pour contrôler le moment de l’administration d’antigènes afin d’étudier comment le flux lymphatique continu régule la réponse immunitaire dans l’évacuation des LN. Cette méthode d’interruption du flux lymphatique peut également être utilisée pour étudier comment la lymphe influe sur la compartimentation cellulaire, l’activati...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Ava Zardynezhad pour la relecture du manuscrit. Ces travaux sont appuyés par l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC, PJT-156035), la Fondation canadienne pour l’innovation pour la SL (32930) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Yujia Lin (81901576).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodium < > 0,9 % solution saline forteBaxterJB1323
< forte>100 % éthanolGreenfield GlobalUniversity of Calgary services de distribution UN1170.
Crème dépilatoireNairNair Sensitive Formula Épilation Crè ; moi avec de l’huile d’amande douce et de l’huile pour bébé, 200 ml. Ou un produit similaire.
fortSigma Life ScienceE2129-10GPour 1 ml de colorant bleu Evans, ajoutez 0,1 g de bleu Evans à 10 ml de PBS. La solution Evens Blue sera filtrée à travers des filtres de 0,22 mm et maintenue stérile dans des aliquotes de 1 ml.
Fluorescein isothiocyanate isomere I (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Forceps Dumont #3WPI500337
Forceps Dumont #5WPI500233
Appareil d’injectionConnectez une extrémité du tube en polyéthylène à 30G & fois ; ½ ; aiguille. Fixez une seringue de tuberculose de 1 ml à l’aiguille. Déloger la tige de l’aiguille d’un autre 30G & fois ; ½ ; aiguille. Insérez l’extrémité émoussée du 30G & times ; ½ ; l’arbre de l’aiguille dans l’autre extrémité du tube. Le diamètre intérieur de ce tube est de 0,28 mm. Ainsi, 1,6 cm de liquide dans le tube est 1 &mu ;l.
Seringue à insulineBecton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Forcep straightWPI15914
IRIS scissorsWPI14218-G
KétamineNarketanDIN 02374994Les fournisseurs de kétamine et de xylazine sont généralement soumis à une réglementation institutionnelle et gouvernementale.
Needles (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Needles (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Paton Needle HolderROBOZRS6403Straight, Without Lock ; Dentelé
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
Tube en polyéthylèneBecton Dickinson and Company (BD)427401
Ruban chirurgical (1.25cmx9.1m )Transpore1527-0
Ruban chirurgical (2.5cmx9.1m )Transpore1527-1
SutureDavis and Geck CYANAMID Canada11/040.7 métrique monofilament polypropylène
seringue (1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS scissorsWorld Precision Instruments (WPI)14122-G
XylazineRompunDIN02169606Les fournisseurs de kétamine et de xylazine sont généralement soumis à une réglementation institutionnelle et gouvernementale.
Équipement
Microscope à dissectionOlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) avec source lumineuse : Olympus Highlight 3100
Microscope confocalLeicaSP8

Références

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