Article de méthode

Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

DOI :

10.3791/61190

⸱

2 juin 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) est un outil potentiel pour élucider les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse et potentiellement aider à la médecine régénérative. Ici, nous avons mis en place une méthode efficace et peu coûteux pour la différenciation neuronale des MESCs in vitro, en utilisant la stratégie de dépistage combinatoire. Dans les conditions définies ici, la formation du corps embryoïde de 2 jours + protocole d’induction de l’acide rétinoïque de 6 jours permet une différenciation rapide et efficace des MESC en cellules précurseurs neuronales (PNJ), comme en est la formation d’A2lox bien empilés et neurites et de 129 dérivés positifs à Nestin. L’état sain des corps embryoïdes et le moment où l’acide rétinoïque (PR) est appliqué, ainsi que les concentrations de PR, sont essentiels dans le processus. Dans la différenciation subséquente des PNJ en neurones, N2B27 medium II (complété par le milieu neurobasal) pourrait mieux soutenir le maintien et la maturation à long terme des cellules neuronales. La méthode présentée est très efficace, peu coûteux et facile à utiliser, et peut être un outil puissant pour la neurobiologie et la recherche en biologie du développement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches embryonnaires (ESC) sont pluripotentes et peuvent se différencier en cellules précurseurs neuronales (PNJ) puis en neurones dans certaines conditions1. La neurogenèse basée sur l’ESC fournit la meilleure plate-forme pour imiter la neurogenèse, servant ainsi d’outil utile pour des études de biologie développementale et potentiellement aider à la médecinerégénérative 2,3. Au cours des dernières décennies, de nombreuses stratégies ont été rapportées pour induire la neurogenèse embryonnaire, comme la méthode transgénique4, en utilisant de petites molécules5, en utilisant un microenvironnement matricielle 3D6, et la technique de co-culture7. Cependant, la plupart de ces protocoles sont soit condition limitée ou difficile à utiliser, de sorte qu’ils ne sont pas adaptés à une utilisation dans la plupart des laboratoires.

Pour trouver une méthode facile à utiliser et peu coûteux pour parvenir à une différenciation neuronale efficace des MESC, une stratégie de dépistage combinatoire a été utilisée ici. Tel que décrit dans la figure 1, tout le processus de neurogenèse embryonnaire a été divisé en 2 phases. La phase I se réfère au processus de différenciation des MESC en PNJ, et la phase II se rapporte à la différenciation subséquente des PNJ en neurones. Sur la base des principes du fonctionnement facile, du faible coût, des matériaux facilement disponibles et de l’efficacité de différenciation élevée, sept protocoles de phase I et trois protocoles de phase II ont été choisis en fonction du système traditionnel de culture monocouche adhérente ou du système de formation du corpsembryoïde 8,9. L’efficacité de différenciation des protocoles dans les deux phases a été évaluée utilisant l’observation de morphologie cellulaire et l’essai d’immunofluorescence. En combinant le protocole le plus efficace de chaque phase, nous avons établi la méthode optimisée pour la différenciation neuronale des MESCs.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culture embryonnaire de cellules souches de souris

  1. Préparer 0,1 % de plats ou d’assiettes de culture cellulaire enduits de gélatine.
    1. Ajouter 2 mL de gélatine stérilisée à 0,1 % (0,1 % w/v dans l’eau) aux plats de culture cellulaire de 60 mm. Rock doucement pour assurer un enduit même des plats de culture cellulaire.
    2. Mettre les plats dans un incubateur de CO2 à 5% à 37 °C et laisser le revêtement pendant 1 h.
    3. Retirer la solution gélatineuse de 0,1 % avant d’ensemencer les cellules.
      REMARQUE : Après avoir enlevé la gélatine, il n’est pas nécessaire de sécher ou de laver la vaisselle enduite.
  2. Culture des cellules souches embryonnaires de souris (A2lox et 129)
    1. Incuber les cellules mESC (A2lox et 129) dans les plats de culture cellulaire enrobés de gélatine de 0,1 % dans un milieu de croissance mESC à 37 °C dans un incubateur de CO2 à 5 %, respectivement. Le milieu de croissance mESC se compose de 85% knock-out DMEM/F12, 15% knock-out remplacement sérique (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1% de pénicilline/streptomycine (P/S), 1000 U/mL facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibiteur de GSK-3) et 0,33 nM PD0325901 (inhibiteur de MEK).
      MISE EN GARDE : β-mercaptoéthanol est inflammable et a la toxicité d’inhalation. Éloignez-vous des sources d’incendie et portez un masque pour éviter l’inhalation lors de l’utilisation.
    2. Modifiez quotidiennement le milieu de croissance du MESC pour une meilleure croissance de l’A2lox et du 129.
    3. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, retirer le milieu et ajouter 1 mL de trypsine de 0,1% au plat. Bercer doucement pendant 30 s pour assurer une couverture même de trypsine sur toutes les cellules.
    4. Laissez les cellules pendant environ 1 min pour trypsineize, puis retirez la trypsine à l’aide de pipette de 1 mL.
    5. Ajouter 2 mL de milieu de croissance mESC au plat, pipette de haut en bas plusieurs fois pour faire une suspension à cellule unique.
    6. Comptez la densité des cellules dans la suspension aussi précisément que possible à l’aide de l’hémomètre.
    7. Divisez les cellules en 7 groupes et induisez la différenciation à l’aide de différents protocoles indiqués dans le tableau 1.

2. Différenciation des MESC aux PNJ (phase I)

  1. Préparer 0,1% de plaques de culture cellulaire enduite de gélatine ou de coverslips.
    1. Avant utilisation, préparer 0,1% de gélatine enduite de plaques ou de coverslips à 6 puits comme à l’étape 1.1.
  2. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 1( Tableau 1)
    1. Ensemencer environ 2 x10 4 mESCs dans 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits dans les plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Vérifiez la densité cellulaire au microscope.
    2. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de CO2 à 5 % pendant 6 h pour permettre l’attachement.
    3. Après l’attachement, sortir des cellules de l’incubateur, et laver les cellules deux fois avec 2 mL de PBS.
    4. Ajouter 2 mL de milieu de différenciation basale I(tableau 1)à chaque puits et remettre les cellules dans l’incubateur.
    5. Laissez les cellules pour la différenciation pendant 8 jours. Remplacez le milieu de différenciation basale I tous les 2 jours.
  3. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 2( Tableau 1)
    1. Ajouter 1,5 x 106 mESCs dans un plat bactérien non adhésif dans 10 mL de milieu de différenciation basale I pour permettre la formation du corps embryoïde à 37 °C dans un incubateur de CO2 à 5 %.
    2. Après 2 jours, transférer les agrégats cellulaires dans des tubes de centrifugeuse de 15 mL et les laisser s’installer par gravité.
    3. Retirer le supernatant et ajouter 10 mL de milieu de différenciation basale frais I pour résuspendre les corps embryoïdes. Replantez-les dans un nouveau plat bactérien non adhésif et laissez la différenciation pendant encore 2 jours.
    4. Vérifiez la formation de corps embryoïdes au microscope (Figure 2A).
    5. Recueillir les corps embryoïdes tels que décrits dans les étapes 2.3.2-2.3.3. Ensemencer environ 50 corps embryoïdes dans 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur des plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %.
    6. Préparer 1 mM de bouillon de RA tout trans (en DMSO) et les conserver loin de la lumière dans un congélateur à -80 °C après le sous-emballage.
      REMARQUE : La PR est instable et il faut faire attention à l’éloigner de la lumière et à réduire le contact avec l’air pendant la préparation du stock de PR.
    7. Pour l’induction de RA, ajouter 2 μL de ra dans chaque puits pour faire une concentration finale de 1 μM.
    8. Placer la plaque dans l’incubateur de CO2 à 5 % à 37 °C et différencier pendant encore 4 jours.
    9. Changez l’ensemble de 2 mL de différenciation basale moyenne I (avec 1 μM RA) tous les 2 jours.
  4. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 3( Tableau 1)
    1. Plantez 1,5 x 106 mESCs dans un plat bactérien non adhésif dans 10 mL de milieu de différenciation basale I. Laisser pendant 2 jours pour la formation du corps embryoïde à 37 °C dans un incubateur de CO2 à 5 %.
    2. Vérifiez la formation de corps embryoïdes au microscope (Figure 2B).
    3. Transférer les agrégats cellulaires dans des tubes de centrifugeuse de 15 mL et les laisser s’installer par gravité.
    4. Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 10 mL de milieu de différenciation basale frais I pour les résuser.
    5. Ensemencer environ 50 corps embryoïdes en 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur des plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %.
    6. Pour l’induction de RA, ajouter 2 μL de ra dans chaque puits pour faire une concentration finale de 1 μM.
    7. Placer la plaque dans l’incubateur 5% CO2 à 37 °C et différencier encore 6 jours. Modifiez l’ensemble du milieu de différenciation basale I (avec 1 μM RA) tous les 2 jours.
  5. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 4( Tableau 1)
    1. Ensemencer environ 2 x10 4 mESCs dans un rayon de 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur les plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Placez la plaque dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pour permettre une fixation de 6 h.
    2. Après l’attachement, laver les cellules deux fois avec 2 mL de PBS. Ajouter 2 mL de milieu de différenciation basale I à chaque puits et permettre la différenciation pendant 4 jours dans l’incubateur 5% CO2 à 37 °C.
    3. Pour l’induction de RA, ajouter 2 μL de ra tout-trans dans chaque puits (la concentration de travail est de 1 μM) pour induire une différenciation pendant encore 4 jours.
    4. Dans l’ensemble du processus, remplacer l’ensemble du milieu tous les 2 jours.
  6. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 5( Tableau 1)
    1. Ensemencer environ 2 x10 4 mESCs dans un rayon de 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur les plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Placez la plaque dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pour permettre une fixation de 6 h.
    2. Lavez les cellules deux fois avec 2 mL de PBS. Ajouter 2 mL de milieu de différenciation basale I à chaque puits et permettre la différenciation pendant 2 jours dans l’incubateur 5% CO2 à 37 °C.
    3. Pour l’induction subséquente de RA, ajouter 2 μL de ra dans chaque puits pour faire une concentration finale de 1 μM. Placez la plaque dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pour induire une différenciation pendant encore 6 jours.
    4. Dans l’ensemble du processus, remplacer l’ensemble du milieu tous les 2 jours.
  7. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 6( Tableau 1)
    1. Plantez 1,5 x 106 mESCs dans un plat bactérien non adhésif dans 10 mL de N2B27 medium II (Tableau 1) pour permettre la formation de corps embryoïdes.
    2. Le jour 2nd, recueillir les agrégats cellulaires tels que décrits dans les étapes 2.3.2-2.3.3 et resuspendre les corps embryoïdes en utilisant 10 mL de N2B27 moyen frais II.
    3. Replantez-les dans un nouveau plat bactérien non adhésif et laissez la différenciation pendant encore 2 jours dans l’incubateur de CO2 à 5% à 37 °C. Vérifiez la formation de corps embryoïdes au microscope.
    4. Le 4èmejour, recueillir des corps embryoïdes. Ensemencer environ 50 corps embryoïdes par puits sur 0,1 % d’assiettes de 6 puits recouvertes de gélatine avec 2 mL de N2B27 moyen II.
    5. Ajouter 2 μL de bouillon de RA tout trans dans chaque puits et induire une différenciation pendant encore 4 jours. Remplacer l’ensemble du milieu (N2B27 medium II par 1 μM RA) tous les deux jours.
  8. Différenciation de phase I à l’aide du protocole 7( Tableau 1)
    1. Ensemencer environ 2 x10 4 mESCs dans un rayon de 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur les plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Placez la plaque dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pour permettre une fixation de 6 h.
    2. Lavez les cellules deux fois avec PBS. Ensuite, ajoutez 2 mL de N2B27 medium II à chaque puits et prévoyez une différenciation pendant 8 jours à 37 °C dans un incubateur de CO2 à 5 %.
    3. Changez l’ensemble du N2B27 medium II tous les 2 jours.

3. Observation de la morphologie cellulaire

  1. Vérifiez l’état de différenciation des 7 groupes mentionnés ci-dessus chaque jour sous un microscope à contraste de phase inversée.
  2. Sélectionnez au hasard au moins 12 champs et prenez des photos pour enregistrer les changements morphologiques de chaque groupe sur D8.

4. Coloration d’immunofluorescence

  1. Préparation de l’échantillon : Les mESCs de semence sur des couvertures recouvertes de gélatine à 0,1 % et permettent une différenciation pendant 8 jours en utilisant les protocoles mentionnés à l’étape 2.
  2. Rinçage : Le8ème jour, sortez les échantillons de l’incubateur et retirez le milieu de différenciation par aspiration. Rincer délicatement les cellules une fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min.
  3. Fixation: Ajouter 1 mL de 4% de paraformaldéhyde à chaque échantillon et fixer les cellules pendant 20 min à température ambiante (RT).
  4. Rincer : Après fixation, rincer délicatement les cellules avec 1 mL de PBS 3 fois, pendant 5 min chacune.
  5. Perméabilisation: Ajouter 1 mL de 0,2% TritonX-100 dans PBS à chaque échantillon et laisser pendant 8 min à RT.
  6. Rinçage : Après perméabilisation, rincer délicatement les cellules avec 1 mL de PBS 3 fois, pendant 5 min chacune.
  7. Blocage : Ajouter 1 mL de sérum de chèvre à 10 % dans pbs à chaque échantillon et incuber à RT pendant 1 h pour bloquer toute interaction non spécifique.
  8. Incubation avec anticorps primaire
    1. Diluer l’anticorps anti-Nestin à un rapport de 1:100 en utilisant 5% sérum de chèvre dans PBS.
    2. Appliquer 500 μL d’anticorps dilués sur différents échantillons et incuber pendant la nuit à 4 °C.
  9. Rincer : Retirer l’anticorps et rincer délicatement les échantillons avec 1 mL de PBS 3 fois pendant 8 min chacun.
  10. Incubation avec anticorps secondaire
    1. Diluer l’IgG anti-souris de chèvre étiqueté Alexa Fluor 488 à un rapport de 1:500 en utilisant 5% de sérum de chèvre dans PBS.
    2. Appliquer 500 μL d’anticorps dilués sur différents échantillons et incuber dans l’obscurité pendant 2 h à RT.
      REMARQUE : Après l’application d’anticorps secondaires fluorescents, effectuez toutes les étapes subséquentes dans l’obscurité pour empêcher l’assaisons de fluorescence.
  11. Rincer : Retirer l’anticorps secondaire et rincer délicatement les échantillons avec 1 mL de PBS 3 fois pendant 8 min chacun.
  12. Coloration et montage nucléaires
    1. Placez une goutte de milieu de montage DAPI sur le microslide propre.
    2. Retirer soigneusement les échantillons des plaques et placer l’échantillon sur le dessus du milieu de montage DAPI avec la cellule face vers le bas. Laisser dans l’obscurité pendant 5 min à RT.
    3. Retirez l’excès de support DAPI avec du papier absorbant.
  13. Observation de la microscopie par fluorescence
    1. Placez les spécimens sous la microscopie de fluorescence et détectez le signal pour DAPI et Alexa Fluor 488 à l’aide de filtres appropriés.
    2. Choisissez uniformément et aléatoirement 10 à 15 champs visuels différents pour chaque échantillon et enregistrez les images à l’aide d’une caméra CCD.

5. Différenciation des PNJ aux neurones (phase II)

  1. Préparer les dérivés du MESC dans le cadre de la différenciation de phase I à l’aide du protocole 3 (8 jours, tableau 1)tel que détaillé à l’étape 2.4, qui a la plus grande efficacité de différenciation (voir la figure 3).
    REMARQUE : Après la différenciation de phase I, le contrôle de la qualité doit être effectué à l’aide de l’observation de la morphologie cellulaire et de l’analyse d’immunofluorescence mentionnées ci-dessus, afin d’assurer un PNJ sain et à haut rendement.
  2. Ensemencer environ 5 x10 dérivés de 5 mESC dans un rayon de 2 mL de milieu de différenciation basale I par puits sur les plaques de 6 puits recouvertes de gélatine de 0,1 %. Divisez aléatoirement les dérivés mESC en 3 groupes, comme protocole de phase II 1, protocole 2 et protocole 3, respectivement.
  3. Placez la plaque dans l’incubateur de CO2 à 37 °C pour permettre une fixation de 6 h. Lavez-les deux fois avec 2 mL de PBS.
  4. Ajouter 2 mL de différenciation basale moyenne I, N2B27 moyen I et N2B27 medium II (Tableau 2), respectivement, à chaque puits des groupes ci-dessus.
  5. Placer les assiettes dans l’incubateur et laisser différencier encore 10 jours. Changez le support correspondant tous les 2 jours.
  6. Vérifiez l’état de différenciation et enregistrez les changements morphologiques mentionnés à l’étape 3.
  7. Le jour 18, évaluer la génération de neurones (β-Tubulin III positif) et déterminer l’efficacité de différenciation des 3 protocoles à l’aide de l’étape 4.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formation de corps embryoïde de 2 jours + l’induction de RA de 6 jours fonctionne mieux sur la direction de la différenciation des MESCs dans les PNJ (phase I). Afin de déterminer le protocole optimal qui favorise le mieux la différenciation des MESC en PNJ (phase I), 7 protocoles ont été testés sur a2lox et 129 mESC(tableau 1)et l’état de différenciation de chaque groupe a été surveillé au microscope léger. Comme le montre la figure 3A, la plupart des dérivés de l’A2lox ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la présente étude, nous avons établi une méthode simple et efficace pour la différenciation neuronale des MESCs, avec des matériaux peu coûteux et facilement obtenus. Dans cette méthode, 2 jours de formation du corps embryoïde suivis de 6 jours d’induction de la PR peuvent effectivement favoriser la différenciation des MESC en PNJ (phase I-protocole 3). Pour la différenciation de phase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induit le plus efficacement la différenciation des PNJ en neurones. Pour assurer le succès...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (n° 31501099) et les personnes d’âge moyen et les jeunes du département de l’éducation de la province du Hubei, en Chine (no. Q20191104). Et, nous remercions le professeur Wensheng Deng de l’Université des sciences et de la technologie de Wuhan pour avoir fourni les lignées de cellules souches embryonnaires de souris A2lox.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-Nestine [Rat-401]AbcamAb11306stocké à -80 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
l’anticorps anti-&bêta ;-tubuline III produit chez le lapinSigma AldrichT2200stocké à -80 ° ; C, évitez la congélation et la décongélation répétées
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
B-27 Supplément (50X), sérum Gibco 17504044 stockéà -20 ° ; C, et protéger de la lumière
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263stocké à -20 ° ; C
LamellesNEST801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bstocké à 4 ° ; C
Sérum fœtal bovinHyCloneSH30084.03stocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
Microscopie à fluorescenceOlympusCKX53
GélatineGibcoCM0635Bconservée à température ambiante
Supplément GlutaMAX Gibco35050061conservée à 4 ° ; C
Immunol Staining Primaire Tampon de dilution des anticorpsBeyotimeP0103stocké à 4 ° ; C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012stocké à 4 ° ; C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028stocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
de la leucémie Facteur inhibiteur humainSigmaL5283stocké à -20 ° ; C
Support de montage avec DAPI - Aqueux, FluoroshieldAbcamAB104139stocké à 4 ° ; C et protéger de la lumière
MEM Solution d’acides aminés non essentielsGibco11140076stockée à 4 ° ; C
N-2 Supplément (100X)Gibco17502048stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
Sérum de chèvre normalJackson005-000-121stocké à -20 ° ; C
Neurobasal MediumGibco21103049stocké à 4 ° ; C
Boîte bactérienne non adhésiveCorning3262
Saline tamponnée au phosphate (1X)HyCloneSH30256.01Bstockée à 4 ° ; C
Pénicilline/Streptomycine SolutionHyCloneSV30010conservé à 4 ° ; C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036stocké à -20 ° ; C
Acide rétinoïqueSigmaR2625stocké à -80 ° ; C et protéger de la lumière
Souche 129 Cellules souches embryonnaires de sourisCyagenMUAES-01001Maintenu dans un système de culture sans feeder
Stem-Cellbanker (sans DMSO)ZENOAQstem cellbanker sans DMSOstocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
de la trypsine à 0,25 % (1X) SolutionHyCloneSH30042,01stockée à 4 ° ; C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023stocké à 4 ° ; C et protéger de la lumière
4 % de paraformaldéhydeBeyotimeP0098stocké à -20 ° ; C
6 - plaque à puitsCorning3516
Plat de culture cellulaire de 60 mmCorning430166
tube à centrifuger de 15 mlNUNC339650
de

Références

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