L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.
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Article de méthode
Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cette étude vise à comprendre comment la croissance des CSPi sur différents substrats de revêtement ECM peut affecter la confluence cellulaire. Un protocole permettant d’évaluer la confluence des CSPi en temps réel a été établi sans qu’il soit nécessaire de compter les cellules en suspension unicellulaire pour éviter toute perturbation de la croissance. Un système d’analyse d’images à haut contenu a été utilisé pour évaluer de manière automatisée la confluence iPCS sur 4 ECM différents au fil du temps. Différents paramètres d’analyse ont été utilisés pour évaluer la confluence cellulaire des CSPi adhérentes et seule une légère différence (à 24 et 48 heures avec la laminine) a été observée si un masque à 60, 80 ou 100% a été appliqué. Nous montrons également que la laminine conduit à la meilleure confluence par rapport à Matrigel, la vitronectine et la fibronectine.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont obtenues à partir de cellules somatiques et peuvent être différenciées en différents types de cellules. Ils sont souvent utilisés comme système pour modéliser la pathogenèse des maladies ou effectuer le dépistage de médicaments, et offrent également le potentiel d’être utilisés dans le contexte de la médecine personnalisée. Étant donné que les CSPi ont un grand potentiel, il est important de les caractériser pleinement pour les utiliser en tant que système modèle fiable. Nous avons déjà montré l’importance de cultiver des CSPi dans un environnement hypoxique, car ces cellules dépendent de la glycolyse et un envir....
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Protocole
1. Revêtement de 96 plaques de puits
REMARQUE : Différents revêtements ont été testés dans la même plaque, mais dans des puits distincts (voir le dossier supplémentaire).
- Diluer le Matrigel 1:100 dans DMEM. Ajouter 100 μL par puits aux plaques de 96 puits et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez la solution et lavez les puits avec 100 μL de DMEM deux fois.
- Laminine diluée (20 μg/mL, LN-521) dans du PBS (avec calcium et magnésium). Ajouter 100 μL au puits et incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, effectuez deux lavages avec DMEM avant d’ensemencer les cellules.
- Dilu....
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Résultats
Dans cette étude, nous avons étudié la confluence des CSPi lorsqu’elles sont cultivées dans différentes conditions de revêtement. À l’aide d’un cytomètre, nous avons pu obtenir des résultats facilement informatifs en trois exemplaires en 5 jours. Étant donné que les CSPi se fixent à peine aux récipients en plastique et qu’un revêtement est nécessaire pour favoriser leur prolifération, nous avons décidé de surveiller la confluence des CSPi humaines car elle indique la santé de la culture cellulaire et peut refléter leur p.......
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Discussion
L’utilisation des CSPi pour la modélisation des maladies et le dépistage futur des médicaments, ainsi que leur application possible en médecine de précision, en font une technologie d’une grande pertinence et, pour cette raison, nous pensons qu’il est nécessaire de comprendre clairement les conditions de culture in vitro qui ressemblent mieux à la situation physiologique des cellules souches embryonnaires. Dans ce contexte, nous avons testé différents revêtements ECM utilisant des CSPi de type sauvage afin de comprendre .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
L’étude a été financée par des subventions de la Fondazione Bambino Gesù et de Ricerca Corrente (ministère italien de la Santé) à C.C. Nous tenons à remercier le Dr Enrico Bertini (Département de neurosciences, Unité des maladies neuromusculaires et neurodégénératives, Laboratoire de médecine moléculaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), le Dr Stefania Petrini (Centre central de microscopie confocale, Laboratoires de recherche, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Département d’onco-hématologie, thérapie génique et cellulaire, Hôpital de recherche pour enfants Bambino Gesù) e....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pipettes sérologiques à bandes de 10 ml, polystyrène, emballées individuellement dans du papier/plastique, | Corning | 4488 | Outil |
| 15 mL de tubes à centrifuger coniques en polypropylène (PP) haute clarté | Falcon | 352097 | |
| outil 1x PBS (avec Ca2+ ; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (sans Ca2+ ; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Pipettes sérologiques, polystyrène, emballées individuellement dans du papier/plastique, | Corning | 4487 | |
| Outil Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Plaque de culture cellulaire, 6 puits | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Réactif |
| Epi Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Outil |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectine | Merck | FC010 | Revêtement |
| Glycérol | Sigma | G5516 | Réactif |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Réactif |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Revêtement |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco LS25030081 Réactif | ||
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 | Medium Stem Cell Technologies | 85851 | |
| Medium MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Gibco | 15140122 Réactif | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Réactif |
| Vitronectine | Stem Cell Technologies | 7180 | Revêtement |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Réactif |
Références
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
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Réimpressions et autorisations
