Évaluation de l’oxydation cellulaire à l’aide d’une protéine fluorescente verte rougeox-sensible spécifique à compartiment subcellulaire

Résumé

Ce protocole décrit l’évaluation de l’état redox subcellulaire spécifique au compartiment dans la cellule. Une sonde fluorescente sensible au redox permet une analyse ratiométrique pratique dans les cellules intactes.

Résumé

La mesure de l’équilibre oxydation/réduction intracellulaire donne une vue d’ensemble du statut physiologique et/ou pathophysiologique redox d’un organisme. Les thiols sont particulièrement importants pour éclairer le statut redox des cellules par l’intermédiaire de leurs rapports réduits de dithiol et de disulfure oxydé. Les protéines fluorescentes contenant de la cystéine d’ingénierie ouvrent une nouvelle ère pour les biocapteurs sensibles au redox. L’une d’entre elles, la protéine fluorescente verte sensible au redox (roGFP), peut facilement être introduite dans les cellules avec transduction adénovirale, permettant d’évaluer le statut redox des compartiments subcellulaires sans perturber les processus cellulaires. Les cysteines réduites et les cystines oxydées de roGFP ont des maxima d’excitation à 488 nm et 405 nm, respectivement, avec l’émission à 525 nm. L’évaluation des ratios de ces formes réduites et oxydées permet le calcul pratique de l’équilibre redox dans la cellule. Dans cet article de méthode, les cellules humaines immortalisées de cancer du sein triple-négative (MDA-MB-231) ont été employées pour évaluer le statut de redox dans la cellule vivante. Les étapes de protocole incluent la transduction de ligne cellulaire MDA-MB-231 avec l’adénovirus pour exprimer le roGFP cytosolique, le traitement avec H₂O_2,et l’évaluation du rapport de cystéine et de cystine avec la cytométrie de flux et la microscopie de fluorescence.

Introduction

Le stress oxydatif a été défini en 1985 par Helmut Sies comme « une perturbation de l’équilibre prooxydant-antioxydant en faveur de l’ancien »¹, et une pléthore de recherches ont été menées pour obtenir le statut de redox spécifique à la maladie, à la nutrition et au vieillissement des organismes^1,2,3. Depuis lors, la compréhension du stress oxydatif est devenue plus large. Tester les hypothèses d’utilisation d’antioxydants contre les maladies et / ou le vieillissement a montré que le stress oxydatif non seulement provoque des dommages, mais a égalemen....

Protocole

REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour les cellules MDA-MB-231 confluentes à 70 %à 80 %. Pour les autres lignées cellulaires, le nombre de cellules et la multiplicité de l’infection (MOI) doivent être réoptisés.

1. Préparation des cellules (jour 1)

1. Maintenir la ligne cellulaire MDA-MB-231 dans des flacons de 75 cm² avec 10 ml de milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO_2.
   REMARQUE : DMEM complété par 10 % de FBS, 37 °C et une atmosphère humidifiée de CO₂ de 5 % sont utilisés pour toutes les incuba....

Résultats

L’état redox de CyS/CySS est facilement analysé avec des ropFPP transduct. La sonde fluorescente quantifie le rapport entre les formes réduites et oxydées (longueurs d’onde d’excitation 488 nm et 405 nm, respectivement). Les données de fluorescence peuvent être obtenues par cytométrie de flux et microscopie.

Un grand nombre de cellules peuvent être acquises de façon cohérente et pratique à l’aide de la cytométrie du flux. L’analyse se compose de 3 étapes principales : 1) sélectionner la popula.......

Discussion

L’équilibre thiol/disulfide dans un organisme reflète le statut redox des cellules. Les organismes vivants ont le glutathion, la cystéine, les thiols protéiques et les thiols à faible poids moléculaire, qui sont tous affectés par le niveau d’oxydation et l’écho du statut redox des cellules⁴. Les ropFPs conçus permettent la quantification non perturbatrice de l’équilibre thiol/disulfure via leurs résidus de CyS⁷. La propriété ratiométrique du roGFP fournit des mesures redox .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco par Life Sciences	25200-056	Culture cellulaire
Lame de chambre à 4 puits	Thermo Scientific	154526	Matériau d’ensemencement cellulaire pour l’imagerie fluorescente
Tubes de 5 ml avec capuchon de crépine	cellulaire Falcon	352235	Tube de suspension unicellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux
Plaque Corning		353046	Matériel d’ensemencement cellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux
15 ml Tubes coniques	MidSci	C15B	Culture cellulaire
75 cm2 capsules ventilées flacons de culture tissulaire	Corning	4306414	Culture cellulaire
Cytosol adénoviral spécifique roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP roGFP	construct aimablement fourni par Dr. Schumaker
Classe II, type A2 Armoire	de capot de sécuritéThermo Scientific	1300 Series A2	Culture cellulaire
Compteur de cellules automatisé Countess	Invitrogen	C10227	Comptage
de cellules Lames de chambre de compteur de cellules Countess	Invitrogen	C10283	Comptage de cellules
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Culture cellulaire
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Culture cellulaire
Pointes de pipette filtrées, stériles, 20 & micro ; l	Fisherbrand	02-717-161	Culture cellulaire
Pointes de pipette filtrées, stériles, 1000 & micro ; l	Fisherbrand	02-717-166	Culture cellulaire
Cytomètre en flux	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument équipé de filtres passe-bande FITC et BV510 pour les analyses de cytométrie en flux
Microscope	fluorescent Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Imagerie fluorescente
Peroxyde d’hydrogène 30 %	Fisher Scientific	H325-100	Contrôle positif
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Imagerie fluorescente de cellules exprimant la roGFP (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Imagerie fluorescente de cellules exprimant la roGFP (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Lignée cellulaire du cancer du sein épithéliale humaine
Tubes à microcentrifuger, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Culture cellulaire
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Culture cellulaire
Contrôleur de pipette	Drummond	Hood Mate Model 360	Culture cellulaire
Pipette sérologique, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Culture cellulaire
Pipette sérologique, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Culture cellulaire
Pipette sérologique, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Culture cellulaire
Incubateur de culture tissulaire	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubateur pour culture cellulaire
Trypan blue stain 0.4 %	Invitrogen	T10282	Comptage cellulaire