Article de méthode

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

DOI :

10.3791/61246

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9 juin 2020

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1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

Dans cet article

Résumé

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Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Résumé

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Le protocole actuel décrit les méthodes de production de tissus cardiaques évolutifs et en forme de maille (ECT) composés de cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs), qui sont développées vers l’objectif de l’utilisation clinique. Les cardiomyocytes dérivés de HiPSC, les cellules endothéliales et les cellules murales vasculaires sont mélangés à une matrice de gel, puis versés dans un moule tissual polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des poteaux rectangulaires décalés internes. Par jour de culture, 14 ECT mûrissent en une structure en maille de 1,5 cm x 1,5 cm avec des faisceaux de myofiber de 0,5 mm de diamètre. Les cardiomyocytes s’alignent sur le long axe de chaque faisceau et battent spontanément de façon synchrone. Cette approche peut être étendue jusqu’à un plus grand (3,0 cm x 3,0 cm) maillage ECT tout en préservant la maturation de la construction et la fonction. Ainsi, les ECT en forme de maille générées par les cellules cardiaques hiPSC-dérivées peuvent être réalisables pour les paradigmes de régénération cardiaque.

Introduction

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De nombreuses études précliniques et essais cliniques ont confirmé l’efficacité des thérapies régénératrices cardiaques à base de cellules pour les cœurs défaillants1,2,3. Parmi divers types de cellules, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) sont des sources de cellules prometteuses en raison de leur capacité proliférative, le potentiel de générer diverses lignées cardio-vasculaires4,5, et l’allogénicité. En outre, les technologies d’ingénierie tissulaire ont permis de transférer des million....

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Protocole

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1. Entretien des hiPSC et différenciation cardiovasculaire

  1. Étendre et maintenir les hiPSC sur la matrice membranaire du sous-sol à couche mince (facteur de croissance réduit, dilution de 1:60) dans un milieu conditionné extrait des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF-CM) avec le facteur de croissance du fibroblaste de base humain (hbFGF)4.
    NOTE: Nous avons utilisé une ligne hiPSCs (4 facteurs (Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc) : 201B6). Ajouter hbFGF à la concentration appropriée pour chaque lignée cellulaire. Le fragment de laminine-511 peut également être utilisé pour le revêtement du plat de culture au lieu de la matrice de mem....

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Résultats

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La figure 1A,B montre les schémas du protocole CM+EC et MC. Après avoir induit les MC et les EC du protocole CM+EC et des MC à partir du protocole MC, les cellules sont mélangées en ajustant les concentrations finales de MC pour représenter 10 à 20 % du total des cellules. Le moule tissulaire de 2 cm de large est fabriqué selon le dessin de conception à partir de 0,5 mm d’épaisseur de la feuille PDMS (Figure 2A,B). Six millions .......

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Discussion

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Après l’achèvement de notre étude d’un format linéaire, hiPSC dérivé ECT5, nous avons adapté le protocole pour mélanger hiPSC-dérivés CM, EC, et MC pour faciliter l’expansion in vitro des cellules vasculaires dans les ECT et le couplage vasculaire in vivo ultérieur entre ects et myocardium receveur.

Pour faciliter la génération de géométries ECT de mailles plus grandes et implantables, nous avons utilisé de fines feuilles DEDM pour concevoir les moules 3D avec des potea.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont pas de conflits financiers ou scientifiques à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu financièrement par le Kosair Charities Pediatric Heart Research Program de l’Université de Louisville et le projet Organoïde du RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Les HiPSC utilisés dans nos protocoles publiés ont été fournis par le Center for iPS Cell Research and Application, Université de Kyoto, Kyoto, Japon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm styleFalcon/ Thomas scientific9380C51
Plaques multipuits pour la culture cellulaire 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Kit d’élastomère de siliconeDow Corning761036
s forts
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, recombinant (10µ ; g)R& DRSD-314-BP-010
Collagène, solution de type I de queue de ratSigmaC3867
Matrigel Corning356231
humain VEGF (165) IS, qualité supérieureMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0,2 & micro ; m filtré (solution à 10 % dans l’eau)Sondes moléculairesP-6866
Humain recombinant bFGFWAKO060-04543
Recombinant Humain/Souris/Rat ActivinA (50µ ; g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10µ ; g)R& D5036-WN
Versene solutionGibco15040066
Milieu de culture et suppléments
10x MEMInvitrogen11430
2 Mercaptro EthanolSIGMAM6250
B27 supplément moins insulineGibco
DMEM, Gibco11965084
Sérum fœtal bovin élevé (500ml)Tout
sérum fœtal bovin (500ml)N’importe quel
L-glutamineGibco25030081
NaHCO3N’importe quel
PBS 1xGibco10010-031
Pénicilline-Streptomycine (5000 U/mL)Gibco15070-063
RPMI1640 moyenGibco21870092
&alpha ; MEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone : TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
anti-troponine T, Isoforme cardiaque Ab-1, Clone : 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean SolutionBD340345
BD FACSFlow Sheath FluidBD342003
BD FACSRinse SolutionBD340346
EDTAN’importe quel
tube Falcon avec capuchon de crépine cellulaire (caisse de 500)Corning352235
Sérum de veau fœtal (500ml)N’importe lequel
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes Aqua fixable, pour excitation 405 nmSondes moléculairesL34957
PDGFRb ; anti-CD140b, R-PE, Clone : 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC ; anti-CD144, FITC, Clone : 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 souris IgG1 Kit d’étiquetageSondes moléculairesZ25002
A1895601

Références

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  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E.

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Mots-clés

Construits en forme de maillemoule tissulaire en PDMSalignement des cardiomyocytesfraction vasculaire stromalematrice de collag nerev tement au Poloxamer 407faisceaux de myofibresr g n ration cardiaque

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