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Article de méthode

Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

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DOI :

10.3791/61255

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19 septembre 2020

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1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

Dans cet article

Résumé

La pureté et l’intégrité de l’ARN isolé est une étape essentielle dans les tests dépendants de l’ARN. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et peu coûteuse pour extraire l’ARN d’une petite quantité de tissu pancréatique intact.

Résumé

Indépendamment de la méthode d’extraction, l’extraction optimisée de l’ARN des tissus et des lignées cellulaires se fait en quatre étapes : 1) homogénéisation, 2) dénaturation efficace des protéines de l’ARN, 3) l’inactivation de la ribonucléase, et 4) l’élimination de la contamination de l’ADN, des protéines et des glucides. Cependant, il est très laborieux de maintenir l’intégrité de l’ARN quand il ya des niveaux élevés de RNase dans le tissu. L’autolyse spontanée rend très difficile d’extraire l’ARN du tissu pancréatique sans l’endommager. Ainsi, une méthode pratique d’extraction d’ARN est nécessaire pour maintenir l’intégrité des tissus pancréatiques pendant le processus d’extraction. Une étude expérimentale et comparative des protocoles existants a été réalisée en obtenant 20-30 mg de tissus pancréatiques de rat en moins de 2 minutes et en extrayant l’ARN. Les résultats ont été évalués par électrophorèse. Les expériences ont été réalisées trois fois pour la généralisation des résultats. L’immersion du tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h a donné un ARN à haute intégrité, lorsque le réactif d’extraction de l’ARN a été utilisé comme réactif. Les résultats obtenus étaient comparables aux résultats obtenus à partir de kits commerciaux avec fixations de colonne de spin.

Introduction

Les données génétiques structurelles peuvent être transcrites à un produit fonctionnel par l’expression des gènes. L’analyse de l’ARN est utilisée pour découvrir des différences dans l’expression des gènes dans différentes conditions. Il existe un certain nombre de méthodes pour extraire les acides nucléiques comme suit : guanidinium thiocyanate, extraction par phénol-chloroforme, chromatographie à base de cellulose, extraction par matrices de silice, et anion-échange1,2.

Une détection adéquate de l’expression génique est influencée par l’intégrité de l’ARN isolé des tissus; par conséquent, il est essentiel d’évaluer l’intégrité de l’ARN isolé des tissus avant que d’autres tests ne soient effectués parce que des tests moléculaires complémentaires sur un ARN de mauvaise qualité peuvent compromettre les résultats des applications diagnostiques. Ainsi, l’ARN à haute intégrité est nécessaire pour les tests biologiques moléculaires avec différentes applications diagnostiques : RT-PCR quantitatif, micro-réseaux, test de protection ribonucléase, analyse de tache nordique, cartographie de l’ARN et construction de bibliothèque cDNA3,4.

L’ARN devient plutôt instable après avoir été longtemps conservé. Les longs fragments d’ARNm de plus de 10 ko sont particulièrement sensibles à la dégradation5,6. Ainsi, les chercheurs doivent tenir compte de divers facteurs qui influencent l’intégrité de l’ARN purifié. La pureté de l’ARN doit être protégée contre les RNases, les protéines, l’ADN génomique et la contamination par les inhibiteurs enzymatiques. En outre, le meilleur et acceptable rapport d’absorption de l’ARN aux UV (260/280) doit être dans la gamme de 1,8-2.0 avec une fragmentation minimale sur l’électrophorèse. Des techniques de laboratoire récemment développées ont permis aux scientifiques d’évaluer l’intégrité de l’échantillon d’analyse moléculaire plus pratiquement7,8.

Il est beaucoup plus difficile d’extraire l’ARN intact du tissu pancréatique que d’autres types de tissus en raison de la grande quantité de ribonucléases (RNases). Cependant, les méthodes d’extraction existantes, à savoir l’éjection rapide du tissu pancréatique de la cavité abdominale et l’homogénéisation à basse température pour entraver RNases, se sont avérées inefficaces7,8,9,10,11,12,13,14.

Le but de la présente étude expérimentale comparative est de modifier et de comparer les méthodes existantes pour déterminer les méthodes les plus efficaces. À cette fin, divers protocoles d’extraction de l’ARN ont été modifiés et comparés. Il visait spécifiquement à déterminer la méthode la moins coûteuse nécessitant une quantité minimale de tissu pancréatique.

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Protocole

L’approbation éthique de cette étude a été obtenue auprès de l’Université des sciences médicales de Shiraz (numéro d’approbation : 93-01-01-7178\03-07-2014).

REMARQUE : Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley pesant 250 g. Placez le flacon contenant un morceau de tissu pancréatique immergé dans le réactif stabilisateur de l’ARN dans un réservoir d’azote liquide à -80 °C et utilisez une solution de réactif d’extraction d’ARN pour maintenir l’intégrité de l’ARN.

1. Ablation du tissu pancréatique du rat

  1. Préparer la salle d’opération et placer tous les matériaux requis sous le capot.
  2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux (pansements, forceps Brown-Adson, ciseaux Iris et ciseaux Littler) dans un four pendant au moins 4 h à 240 °C pour inactiver RNases15. Stériliser la surface de la place de chirurgie avec 70% d’alcool sous le capot.
  3. Injecter de la kétamine/xylazine à l’aide d’une seringue à insuline [80/8 mg/kg]. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils du rat pour un manque de réponse.
  4. Ajouter 1 mL de réactif de stabilisation de l’ARN dans le microtube approprié (2 mL) pour inhiber l’activation des endonuclées dans les tissus excisés.
  5. Placez immédiatement le rat sur le tableau chirurgical (éloignez-vous du chirurgien) pour une incision de milieu de ligne.
  6. Stériliser toute la surface abdominale avec 70% d’alcool et enlever les poils de rat à l’aide d’une tondeuse à cheveux avec des lames #40.
  7. Faites une incision en forme de V pour ouvrir l’abdomen de la zone pubienne aux pattes avant avec des forceps dressing, des forceps Brown-Adson, des ciseaux Iris et des ciseaux Littler.
  8. Retournez les organes abdominaux sur le côté gauche pour exposer le pancréas. Trouvez soigneusement le tissu pancréatique, qui se propage dans la cavité abdominale. Localiser la zone sous la rate pour trouver le pancréas sans être confondu avec le tissu adipeux.
  9. Retirez immédiatement 20-30 mg de pancréas de la cavité abdominale en moins de 2 min. Mettez le tissu enlevé dans le microtube de 2 mL rapidement et coupez-le avec un coupeur stérile pour pénétrer les tissus séparés avec le réactif de stabilisation d’ARN.
  10. Placez le microtube dans un réservoir d’azote pour geler immédiatement. Conservez le microtube dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h16.
  11. Après 24 h, transférer les minuscules morceaux de tissus pancréatiques dans un récipient de glace.
  12. Injecter du chlorure de potassium (KCl) intracrardially pour l’euthanasie des rats après la chirurgie.

2. Extraction de l’ARN

  1. Stériliser la surface sous le capot avec 70% d’alcool.
  2. Mettez 1 mL du réactif d’extraction d’ARN, qui contient du guanidinium thiocyanate pour inhiber le RNase, dans le microtube stérile.
  3. Transférer le tissu pancréatique séparé sur le microtube. Transférer le microtube dans l’azote liquide pour le congeler immédiatement.
  4. Homogénéiser le tissu avec le sonicateur de sonde micro pointe à 4 °C réglé au niveau 20 pour 60 s sur et 5 s off.
  5. Incuber chaque échantillon homogénéisé pendant 5 min à 4 °C à l’aide de glace concassée pour permettre aux complexes de nucléoprotéines d’être complètement dissociés.
  6. Enrichir les échantillons avec 0,2 mL de chloroforme pour chaque 1 mL de réactif d’extraction d’ARN. Capez fermement le tube et secouez-le avec force pendant 15 s.
  7. Incuber le tube pendant 15 min sur la glace concassée (4 °C) pour séparer le réactif en trois phases.
  8. Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Transférez la phase aqueuse incolore sur un nouveau microtube.
  9. Ajouter 0,5 mL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse. Fermer le tube, puis l’inverser au moins 3 fois pour bien mélanger l’ARN.
  10. Incuber l’échantillon de 5 à 10 min sur une boîte froide (4 °C) pour permettre les précipitations d’ARN.
  11. Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Jetez le supernatant.
  12. Enrichissez chacun des tubes de centrifugeuse avec 1 mL d’éthanol à 75%.
  13. Laver la pastille d’ARN en inversant le tube au moins 3 fois.
  14. Faire fonctionner la centrifugeuse à 7 500 x g à +2 à +8 °C pendant 5 min. Jeter le supernatant pour retirer l’excès d’éthanol du granulé d’ARN par séchage à l’air.
  15. Re-suspendre le granulé d’ARN dans l’eau sans RNase traitée par diéthylpyrocarbonate (DEPC).
  16. Passer la solution à travers une pointe de pipette plusieurs fois pour dissoudre le granulé d’ARN. Ensuite, incuber la solution pendant 10-15 min à +65 °C.

3. Évaluation de l’intégrité de l’ARN avec électrophorèse de dénaturation

  1. Préparer le tampon de fonctionnement du gel : 50 mM NaAc (TRAITÉ DEPC) et 0,5 M EDTA (pH 8.0) en H2O traité par DEPC.
  2. Préparer un tampon de gel de formaldéhyde 5x (tampon de fonctionnement MOPS) : 0,1 M M. MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
    1. Dissoudre 20,6 g de MOPS dans 800 mL de DEPC traité 50 mM d’acétate de sodium. Ajuster le pH à 7,0 avec 2 N NaOH. Ajouter 10 mL de DEPC traité 0,5 M EDTA (pH 8.0). Ajuster le volume de la solution à 1 L avec de l’eau traitée par DEPC.
    2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et la garder à température ambiante à l’écart de la lumière pour la stérilisation. Le tampon devient jaune avec le temps s’il est exposé à la lumière ou s’il est autoclaved. Un tampon de couleur paille fonctionne bien, mais les plus foncés ne sont pas17.
  3. Préparer un gel agarose de 1,5 %18. Pour 50 mL, ajouter 0,75 g d’agarose et 31 mL de H2O. Micro-ondes la solution au micro-ondes pendant 1 min. Ajouter 9 mL de formaldéhyde et 10 mL de tampon en cours d’exécution MOPS 5x.
  4. Préparer les échantillons pour le gel. Mélanger ce qui suit dans un tube de microfuge stérile :
    ARN X μL (jusqu’à 30 μg)
    2 μL de tampon de chargement de gel 5x
    10 μL de formamide
    4 μL de tampon en cours d’exécution MOPS
    1 μL de 0,1 mg/mL EtBr
    3 μL de formaldéhyde 5-x μL de DEPC-H2O
  5. Incuber les échantillons à 65 °C pendant 15 min et les refroidir sur la glace. Centrifugeuse pendant 5 s jusqu’à ce que tout le liquide soit déposé.
  6. Pré-exécuter le gel à 5 V/cm pendant 5 minutes.
  7. Chargez immédiatement les échantillons dans les voies du gel, puis submergez le gel dans un tampon de 1x gel-running de formaldéhyde. Courir à 3-4 V/cm19.

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Résultats

Évaluation de l’intégrité de l’ARN dans le réactif d’extraction de l’ARN selon un protocole chirurgical courant et modifié sans réactif de stabilisation de l’ARN
Des bandes inacceptables ont été observées après l’extraction de l’ARN avec le réactif d’extraction d’ARN d’un protocole chirurgical courant. La voie 1 montre l’ARN du foie comme un contrôle. La voie 2 montre l’état dégradé des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical de routine. Lorsque la quantité de t...

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Discussion

En biologie moléculaire, il est essentiel d’obtenir un ARN de haute qualité. La présence des enzymes ribonucléase dans les cellules et les tissus dégrade rapidement l’ARN et rend l’extraction complexe. RNases sont des enzymes stables fonctionnant sans aucun co-facteur. De petites quantités de RNase sont suffisantes pour détruire l’ARN. Lorsque le tissu pancréatique du rat est retiré de la cavité abdominale, il est nécessaire de désinfecter les instruments chirurgicaux par des détergents solides, les rincer soigneusement ...

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Déclarations de divulgation

Aucun n’a été déclaré.

Remerciements

La présente étude a été soutenue financièrement par l’Université des sciences médicales de Shiraz (subvention no 93-01-01-7178\03-07-2014). Nous remercions M. Zomorodian et M. Rostami du Département d’e-Learning en sciences médicales, de l’École virtuelle et du Centre d’excellence en e-Learning de l’Université des sciences médicales de Shiraz pour avoir modifié la vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseMerck116801Allemagne
AtoclaveTeb ZaimIran
CentrifugeuseSigmaAllemagne
ChloroformeMerck107024Allemagne
Eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC)SigmaAllemagne
EDTAsigma60-00-4Allemagne
Réservoir d’électrophorèsePayapajooheshIran
Eppendorf microTubeExtrageneTaiwan
EtBrsigmaE 8751Allemagne
EthanolMerck81870Allemagne
Falcon TubeExtrageneTaiwan
FormaldéhydeMerck344198Allemagne
FormamideMerck344206Allemagne
Homogénéisateur-sunicateurMicroson XL 2000USA
Isopropanolsigma19516Allemagne
Chlorhydrate de kétaminesigma1867-66-9Allemagne
Hotte à flux laminaireJal TajhizIran
Agitateur MgneticLabrotechnikUSA
MicrocentrifugeuseEppendorfAllemagne
Embouts de micropipetteExtrageneTaiwan
MOPSsigma85022106Allemagne
Na ACMerck567422Allemagne
NaOHMerck 109137Allemagne
FourTeb ZaimIran
PH mètreKnickGermany
RNA Later/RNA stabilization réactifQiagen76104USA
Instrument chirurgicalAgn Thosde fabrication allemande
AvaPezeshkIran
TriPure réactif/réactif d’extraction d’ARNRoche11667157001USA
VortexLabincoPays-Bas
Bain-marieMemmertGermany
zylazinesigma7361-61-7Allemagne
Seringues

Références

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