Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

Summary

La pureté et l’intégrité de l’ARN isolé est une étape essentielle dans les tests dépendants de l’ARN. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et peu coûteuse pour extraire l’ARN d’une petite quantité de tissu pancréatique intact.

Abstract

Indépendamment de la méthode d’extraction, l’extraction optimisée de l’ARN des tissus et des lignées cellulaires se fait en quatre étapes : 1) homogénéisation, 2) dénaturation efficace des protéines de l’ARN, 3) l’inactivation de la ribonucléase, et 4) l’élimination de la contamination de l’ADN, des protéines et des glucides. Cependant, il est très laborieux de maintenir l’intégrité de l’ARN quand il ya des niveaux élevés de RNase dans le tissu. L’autolyse spontanée rend très difficile d’extraire l’ARN du tissu pancréatique sans l’endommager. Ainsi, une méthode pratique d’extraction d’ARN est nécessaire pour maintenir l’intégrité des tissus pancréatiques pendant le processus d’extraction. Une étude expérimentale et comparative des protocoles existants a été réalisée en obtenant 20-30 mg de tissus pancréatiques de rat en moins de 2 minutes et en extrayant l’ARN. Les résultats ont été évalués par électrophorèse. Les expériences ont été réalisées trois fois pour la généralisation des résultats. L’immersion du tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h a donné un ARN à haute intégrité, lorsque le réactif d’extraction de l’ARN a été utilisé comme réactif. Les résultats obtenus étaient comparables aux résultats obtenus à partir de kits commerciaux avec fixations de colonne de spin.

Introduction

Les données génétiques structurelles peuvent être transcrites à un produit fonctionnel par l’expression des gènes. L’analyse de l’ARN est utilisée pour découvrir des différences dans l’expression des gènes dans différentes conditions. Il existe un certain nombre de méthodes pour extraire les acides nucléiques comme suit : guanidinium thiocyanate, extraction par phénol-chloroforme, chromatographie à base de cellulose, extraction par matrices de silice, et anion-échange^1,2.

Une détection adéquate de l’expression génique est influencée par l’intégrité de l’ARN isolé des tissus; par con....

Protocol

L’approbation éthique de cette étude a été obtenue auprès de l’Université des sciences médicales de Shiraz (numéro d’approbation : 93-01-01-7178\03-07-2014).

REMARQUE : Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley pesant 250 g. Placez le flacon contenant un morceau de tissu pancréatique immergé dans le réactif stabilisateur de l’ARN dans un réservoir d’azote liquide à -80 °C et utilisez une solution de réactif d’extraction d’ARN pour maintenir l’intégrité de l’ARN.

1. Ablation du tissu pancréatique du rat

1. Préparer la salle d’opération et placer tous les matériaux requis sous le capot.
....

Results

Évaluation de l’intégrité de l’ARN dans le réactif d’extraction de l’ARN selon un protocole chirurgical courant et modifié sans réactif de stabilisation de l’ARN
Des bandes inacceptables ont été observées après l’extraction de l’ARN avec le réactif d’extraction d’ARN d’un protocole chirurgical courant. La voie 1 montre l’ARN du foie comme un contrôle. La voie 2 montre l’état dégradé des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical de routine. Lorsque la quantité de t.......

Discussion

En biologie moléculaire, il est essentiel d’obtenir un ARN de haute qualité. La présence des enzymes ribonucléase dans les cellules et les tissus dégrade rapidement l’ARN et rend l’extraction complexe. RNases sont des enzymes stables fonctionnant sans aucun co-facteur. De petites quantités de RNase sont suffisantes pour détruire l’ARN. Lorsque le tissu pancréatique du rat est retiré de la cavité abdominale, il est nécessaire de désinfecter les instruments chirurgicaux par des détergents solides, les rincer soigneusement .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Merck	116801	Allemagne
Atoclave	Teb Zaim		Iran
Centrifugeuse	Sigma		Allemagne
Chloroforme	Merck	107024	Allemagne
Eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma		Allemagne
EDTA	sigma	60-00-4	Allemagne
Réservoir d’électrophorèse	Payapajoohesh		Iran
Eppendorf microTube	Extragene		Taiwan
EtBr	sigma	E 8751	Allemagne
Ethanol	Merck	81870	Allemagne
Falcon Tube	Extragene		Taiwan
Formaldéhyde	Merck	344198	Allemagne
Formamide	Merck	344206	Allemagne
Homogénéisateur-sunicateur	Microson XL 2000		USA
Isopropanol	sigma	19516	Allemagne
Chlorhydrate de kétamine	sigma	1867-66-9	Allemagne
Hotte à flux laminaire	Jal Tajhiz		Iran
Agitateur Mgnetic	Labrotechnik		USA
Microcentrifugeuse	Eppendorf		Allemagne
Embouts de micropipette	Extragene		Taiwan
MOPS	sigma	85022106	Allemagne
Na AC	Merck	567422	Allemagne
NaOH		Merck 109137	Allemagne
Four	Teb Zaim		Iran
PH mètre	Knick		Germany
RNA Later/RNA stabilization réactif	Qiagen	76104	USA
Instrument chirurgical	Agn Thos		de fabrication allemande
	AvaPezeshk		Iran
TriPure réactif/réactif d’extraction d’ARN	Roche	11667157001	USA
Vortex	Labinco		Pays-Bas
Bain-marie	Memmert		Germany
zylazine	sigma	7361-61-7	Allemagne