Un écran génétique avancé basé sur l’élévation de Ca2+ comme lecture conduit à l’identification des composants génétiques impliqués dans les voies de signalisation dépendantes du calcium dans les plantes.
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Article de méthode
Écran génétique avancé utilisant l’aequorin de journaliste transgénique de calcium pour identifier de nouvelles cibles dans la signalisation de calcium
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les écrans génétiques avancés ont été des outils importants dans l’identification impartiale des composants génétiques impliqués dans plusieurs voies biologiques. La base de l’écran est de générer une population mutante qui peut être projeté avec un phénotype d’intérêt. Le SME (sulfonate de méthane éthylique) est un agent alcalinant couramment utilisé pour induire une mutation aléatoire dans un écran génétique avancé classique afin d’identifier plusieurs gènes impliqués dans un processus donné. L’élévation du calcium cytosolique (Ca2+) est une voie de signalisation précoce clé qui est activée lors de la perception du stress. Toutefois, l’identité des récepteurs, des canaux, des pompes et des transporteurs de Ca2+ est encore insaisissable dans de nombreux systèmes d’étude. L’aequorine est une protéine de journaliste de calcium cellulaire isolée d’Aequorea victoria et stablement exprimée dans l’Arabidopsis. En exploitant cela, nous avons conçu un écran génétique avancé dans lequel nous EMS-mutagationnized l’aequorin transgénique. Les graines des plantes mutantes ont été recueillies (M1) et le dépistage du phénotype d’intérêt a été effectué dans la population de ségrégation (M2). À l’aide d’un protocole de mesure Ca2+ de 96 puits, plusieurs nouveaux mutants peuvent être identifiés qui ont une réponse variable en calcium et sont mesurés en temps réel. Les mutants avec le phénotype d’intérêt sont sauvés et propagés jusqu’à ce qu’une population de plantes mutantes homozygotes soit obtenue. Ce protocole fournit une méthode pour les écrans génétiques avancés dans le contexte du journaliste Ca2+ et d’identifier les nouvelles cibles réglementées Ca2+ .
Introduction
Un changement dans la concentration de calcium cytosolic (Ca2+) sur la perception du stimulus biotique ou abiotique est un événement de signalisation précoce bien étudié qui active de nombreuses voies de signalisation1,2,3,4. Une cellule dans son état de repos basal maintient une concentration inférieure de Ca2+ dans le cytosol et séquestres excès de Ca2+ dans divers organites intracellulaires et apoplaste extracellulaire menant à un gradient raide de Ca2+ 5,
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Protocole
1. Ems mutagènesis et collecte de semences à base de pedigree unique (1-3 mois)
- Peser 150 mg de graines (~7500) d’aequorine pour la mutagenèse EMS (graines M0). Peser 150 mg de graines à utiliser comme un contrôle.
- Transférer les graines dans un tube de 50 ml et ajouter 25 ml de SME à 0,2 % (v/v) (ATTENTION) (pour traitement) ou 25 ml d’eau autoclavée (pour contrôle).
REMARQUE : Le sulfonate d’éthyle-méthane est un agent chimique pour la mutagation des matières végétales. - Sceller le tube avec du parafilm et l’envelopper dans du papier d’aluminium. Faire pivoter l’extrémité du tube pendant 18 h à température ambiante. <....
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Résultats
La population de SME a été examinée pour h2O2 induit Ca2+ altitude. Comme nous l’avons vu précédemment, 12 semis M2 individuels ont été examinés à partir de chaque ligne M1. Dans la figure 3, une telle ligne M1 est tracée avec chaque panneau montrant 12 semis M2 individuels. Une aequorine de type sauvage est utilisée comme contrôle pour comparer et évaluer la réponse mutante. Un mutant récessif sépare dans le rappor.......
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Discussion
La mutanéèse ems est un outil puissant pour générer des mutations dans la population. Les écrans génétiques avancés classiques utilisant le SME ont été un outil efficace pour identifier de nouveaux gènes pour deux raisons principales : premièrement, ils ne nécessitent aucune hypothèse préalable sur l’identité génétique et, deuxièmement, ils n’introduisent aucun biais. Il existe plusieurs méthodes pour générer un dépistage des populations comme le SME, les insertions d’ADN T, les radiations, etc. De toutes les méthodes, l.......
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Déclarations de divulgation
Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions le National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale pour la séance vidéo et le Department of Biotechnology- eLibrary Consortium d’avoir fourni l’accès aux ressources électroniques. Ces travaux ont été soutenus par le Département de biotechnologie de l’Inde par l’intermédiaire du National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; et bourse de recherche CSIR-Junior (à D.M et S.M) et De la Bourse de recherche du Département de biotechnologie-junior (à R.P).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque de culture tissulaire à 24 puits | Jetbiofil | 11024 | pour la croissance des semis |
| Plaque cliniplate blanche à 96 puits | Thermo Scientific | 9502887 | pour les mesures au luminomètre |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | pour la croissance des plantes | |
| Chlorure | de calcium Fisher Scientific | 12135 | pour la décharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | groupe prothétique pour l’aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | pour la mutagenèse |
| des graines Éthanol | Réactif analytique | 1170 | pour solution de décharge |
| Acide chlorhydrique | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | solution de sterlisation |
| Peroxyde d’hydrogène | Fisher Scientific | 15465 | comme stimulus pour l’élévation calcique |
| Ascension de Luminoskan | Thermo Scientific | 5300172 | mesure de la luminescence de l’aequorin |
| Tampon MES | Himedia | RM1128-100G | Croissance des plantes |
| Murashige et skoog media | Himedia | PT021-25L | des plantes |
| Hydroxyde de sodium | Fisher Scientific | 27805 | pour neutralisant EMS |
| Hypochlorite de sodium | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | solution de sterlisation |
| Thiosulfate de sodium | Fisher Scientific | 28005 | pour le lavage des graines à l’étape 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | pour la croissance des plantes | |
| Pots carrés | Lab Chem India | pour la croissance des plantes | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | croissance des plantes |
| Taxim | Alkem | 7180720 | pour le sauvetage des semis |
Références
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
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Réimpressions et autorisations
