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Article de méthode

Écran génétique avancé utilisant l’aequorin de journaliste transgénique de calcium pour identifier de nouvelles cibles dans la signalisation de calcium

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DOI :

10.3791/61259

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1 août 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

Dans cet article

Résumé

Un écran génétique avancé basé sur l’élévation de Ca2+ comme lecture conduit à l’identification des composants génétiques impliqués dans les voies de signalisation dépendantes du calcium dans les plantes.

Résumé

Les écrans génétiques avancés ont été des outils importants dans l’identification impartiale des composants génétiques impliqués dans plusieurs voies biologiques. La base de l’écran est de générer une population mutante qui peut être projeté avec un phénotype d’intérêt. Le SME (sulfonate de méthane éthylique) est un agent alcalinant couramment utilisé pour induire une mutation aléatoire dans un écran génétique avancé classique afin d’identifier plusieurs gènes impliqués dans un processus donné. L’élévation du calcium cytosolique (Ca2+) est une voie de signalisation précoce clé qui est activée lors de la perception du stress. Toutefois, l’identité des récepteurs, des canaux, des pompes et des transporteurs de Ca2+ est encore insaisissable dans de nombreux systèmes d’étude. L’aequorine est une protéine de journaliste de calcium cellulaire isolée d’Aequorea victoria et stablement exprimée dans l’Arabidopsis. En exploitant cela, nous avons conçu un écran génétique avancé dans lequel nous EMS-mutagationnized l’aequorin transgénique. Les graines des plantes mutantes ont été recueillies (M1) et le dépistage du phénotype d’intérêt a été effectué dans la population de ségrégation (M2). À l’aide d’un protocole de mesure Ca2+ de 96 puits, plusieurs nouveaux mutants peuvent être identifiés qui ont une réponse variable en calcium et sont mesurés en temps réel. Les mutants avec le phénotype d’intérêt sont sauvés et propagés jusqu’à ce qu’une population de plantes mutantes homozygotes soit obtenue. Ce protocole fournit une méthode pour les écrans génétiques avancés dans le contexte du journaliste Ca2+ et d’identifier les nouvelles cibles réglementées Ca2+ .

Introduction

Un changement dans la concentration de calcium cytosolic (Ca2+) sur la perception du stimulus biotique ou abiotique est un événement de signalisation précoce bien étudié qui active de nombreuses voies de signalisation1,2,3,4. Une cellule dans son état de repos basal maintient une concentration inférieure de Ca2+ dans le cytosol et séquestres excès de Ca2+ dans divers organites intracellulaires et apoplaste extracellulaire menant à un gradient raide de Ca2+ 5,6. Sur la perception du signal, les niveaux de Ca2+ augmentent dans le cytosol en raison d’un afflux de Ca2+ provenant de sources extracellulaires et/ou intracellulaires et génèrent une signature spécifique de calcium de stimuli7,8,9. Ca2+ élévations dans le cytosol sont activés par de nombreux stimuli, mais la spécificité est maintenue par des magasins distincts libérant Ca2 +, une signature unique Ca2 + et les protéines de capteur appropriée10,11.

L’utilisation d’un agent alkylating, le sulfonate d’éthyle-méthane (EMS) pour la mutagenèse est un outil puissant dans les écrans génétiques avant classiques pour identifier plusieurs gènes indépendants impliqués dans un processus. Ems est un mutagène chimique induisant principalement C à T et G à A transitions aléatoirement dans tout le génome et produit un changement de 1 pb dans chaque 125 kb du génome. La mutanéèse EMS entraînera 1000 changements de paires de base uniques, soit l’insertion/suppressions (InDel) soit le polymorphisme nucléotidique unique (SNP) par génome12. Les mutations induites par le SME sont des mutations à plusieurs points avec une fréquence de mutation allant de 1/300 à 1/30000 par locus. Cela réduit le nombre de plantes M1 nécessaires pour trouver une mutation dans un gène donné. Une gamme de population de semences M1 de 2000-3000 est généralement utilisée pour obtenir des mutations d’intérêt dans Arabidopsis thaliana13,14.

Les transgéniques d’Aequorin sont des plantes d’écotype Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) exprimant p35S-apoaequorine (pMAQ2) dans le cytosol15. L’aequorine est une protéine de liaison Ca2+ composée d’apoprotéine et d’un groupe prothétique composé de molécule de luciferine, coelenterazine. La liaison de Ca2+ à l’aequorin, qui a trois Ca2+ liant les sites de mains EF, a comme conséquence la coelenterazine étant oxydée et cyclisée pour donner la dioxétanone intermédiaire, suivie d’un changement conformational de la protéine accompagné par la libération de dioxyde de carbone et de coelenteramide singlet-excité16. Le coelentermine ainsi produit émet une lumière bleue (λmax, 470 nm) qui peut être détectée par le luminomètre17. Les altitudes extrêmement rapides de Ca2+ peuvent ainsi être mesurées en temps réel et exploitées pour des écrans génétiques avancés rapidement. Ce protocole vise à utiliser la spécificité de la réponse de calcium pour identifier les nouveaux acteurs clés qui sont impliqués dans la signature Ca2+. Pour réaliser cette tâche, nous utilisons la mutagène EMS dans l’aequorin transgénique et identifions les SNP associés à la signalisation Ca2+ modifiée. Le protocole identifie les mutants qui ne montrent pas ou réduit Ca2+ altitudes sur l’addition de stimuli. Ces mutants peuvent ensuite être cartographiés pour identifier les gènes responsables de la réponse Ca2+. La méthode s’applique à tout type de stimuli liquides dans les plantes qui se traduit par une altitude Ca2+. Puisque l’élévation de Ca2+ est l’une des premières réponses dans la voie de signalisation de défense de plante, l’identification des composants de réponse en amont peut fournir des candidats pour le génie génétique pour développer des usines résilientes.

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Protocole

1. Ems mutagènesis et collecte de semences à base de pedigree unique (1-3 mois)

  1. Peser 150 mg de graines (~7500) d’aequorine pour la mutagenèse EMS (graines M0). Peser 150 mg de graines à utiliser comme un contrôle.
  2. Transférer les graines dans un tube de 50 ml et ajouter 25 ml de SME à 0,2 % (v/v) (ATTENTION) (pour traitement) ou 25 ml d’eau autoclavée (pour contrôle).
    REMARQUE : Le sulfonate d’éthyle-méthane est un agent chimique pour la mutagation des matières végétales.
  3. Sceller le tube avec du parafilm et l’envelopper dans du papier d’aluminium. Faire pivoter l’extrémité du tube pendant 18 h à température ambiante.
  4. Laisser les graines s’installer. Retirez soigneusement la solution EMS et jetez-les dans un contenant de déchets contenant 1 M NaOH en volumes égaux (NaOH aide à neutraliser/inactiver le SME, ce qui le rend sécuritaire à jeter). Jetez la plastique usagée dans une solution NaOH de 1 M.
    REMARQUE : Après 24 h, jetez les rejets selon les pratiques de laboratoire des matières dangereuses.
  5. Laver soigneusement les graines mutagées avec 40 mL d’eau autoclavée au moins 8 fois. Jeter le SME contenant de l’eau dans un conteneur à déchets NaOH comme mentionné ci-dessus.
  6. Pour le lavage final, ajouter 40 mL de thiosulfate de sodium de 100 mM et rincer 3 fois pour enlever les traces de SME.
  7. Faire tremper les graines dans 40 mL d’eau autoclavée pendant ~1 h pour diffuser le SME hors des graines, puis les placer sur du papier filtre jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
  8. Transférer les graines dans un tube de microcentrifuge et stratifier les graines à 4 °C dans 40 ml d’eau autoclavée pendant 2-4 jours. Cela aide à briser la dormance des semences et assure une croissance homogène.
  9. Transférer les graines mutagées (M0)et les graines témoins sur le sol (composition du sol : agropet : sollerite, 1:1) et les transférer dans des salles de croissance avec une photopériode sombre de 16 h/8 h, une intensité lumineuse de 150 μmol•m−2•s−1 et ~70% d’humidité relative.
  10. Pour déterminer si la mutagenèse a réussi, recherchez une vitesse de germination réduite et la croissance des semis, et la chlorophylle sectoring18 (Figure 1A). Comparez les plantes mutagéenisées aux plantes témoins pour identifier ces différences physiologiques et développementales.
    REMARQUE : Différentes méthodes peuvent être utilisées pour récolter des graines de plantes M1. Dans ce protocole, nous avons utilisé la méthode unique de collecte de semences à base de pedigree. Chaque usine M1 reçoit un numéro unique, à partir de A1 à A3500.
  11. Maintenir les plantes numérotées individuellement en tant que lignées végétales discrètes (figure 1B).
  12. Lors de la maturation, récolter les graines de ces plantes mutantes individuelles et les stocker sous forme de lignées M1 individuelles (figure 2). À partir de la collection de semences à base de pedigree unique, nous avons obtenu environ 5000 M1 lignes dont 3500 M1 lignes ont été projetées.

2. Dépistage à haut débit pour sélectionner les mutants (8 mois)

  1. Identifiez les nouveaux mutants en fonction de la réponse ca2+ à un stimulus sélectionné. Ici, nous avons utilisé H2O2 comme exemple.
  2. Pour identifier les mutants, filtrez la génération M2. Puisque les mutants récessifs se séparent à 1/8 de fréquence dans la génération M2 sur ems mutagenesis14, le dépistage de 8-12 M2-plantes de ségrégation couvre une ligne M1 et identifie un mutant récessif homozygote (en utilisant 12 semis augmente la probabilité de trouver un mutant). De chaque ligne indépendante M1, testez 12 M2 semis pour la réponse de Ca2+ à H2O2 (12 M2 semis par ligne M1).
  3. Utilisez un protocole de stérilisation des semences à haut débit et de croissance hydroponique des plantes19. Placer près de 12-15 M2 graines par ligne M1 dans des puits individuels d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et stériliser à l’aide de gaz de chlore (40 mL d’hypochlorite de sodium et d’acide chlorhydrique de sodium, 3:1, v/v) dans un désiccateur pendant 4 h dans un capot de fumée. Après la procédure, ouvrez le desiccateur et laissez reposer toute la nuit pour que le gaz de chlore s’évapore.
  4. Après stérilisation, apportez les plaques à l’extérieur et ajoutez du liquide 1/2 MS (mi-résistance MS sans agar) à des puits individuels. Sceller les plaques avec le parafilm et stratifier les graines pendant 2-4 jours à 4 °C, puis déplacer les graines dans une chambre de croissance avec 10 h de photopériode sombre à 20-22 °C avec 70% d’humidité relative.
  5. Une fois que les semis ont entre 8 et 12 jours, placez 12 M2 semis de chaque ligne individuellement dans une plaque de luminomètre de 96 puits. Pour mesurer la réponse ca2+ à H2O2, utilisez un lecteur de plaque de luminomètre.
  6. Après le transfert des semis, ajouter 150 μL de solution de coelentrazine de 5 à 10 μM (dilué dans de l’eau autoclavée à partir d’un stock de 5 mM en méthanol) (ATTENTION) dans des puits individuels dans une zone sombre/faible lumière et conserver dans l’obscurité à 21 °C pendant 8 h.
    REMARQUE : Coelentrazine est un groupe prothétique qui se lie à l’apo-aequorin et la reconstitue en aequorine fonctionnelle. Coelentrazine est sensible à la lumière et est donc stocké dans des bouteilles de couleur foncée, protégée de la lumière.
  7. Le lendemain, effectuer écran mutant en utilisant 10 mM H2O2 comme un stimulus et mesurer la réponse suivante Ca2 +.
  8. Pour la mesure simultanée de 24 puits, créer un programme cinétique automatisé qui mesure l’arrière-plan pendant 1 min, suivi de l’ajout de stimuli (40 μL) et de la mesure pendant 10 min, suivi d’une décharge totale d’aéquorine (2 M CaCl2 dans 150 μL 20 % d’éthanol) pendant 1-2 min.
    REMARQUE : Une décharge d’extrémité pour l’aequorin total est nécessaire pour quantifier le Ca2+ mesuré et comme contrôle supplémentaire pour l’aequorine fonctionnelle. La décharge d’extrémité est une courte course de 1-2 min et ne cause pas la mort importante de plante. Alternativement, si les plantes meurent après l’étape de décharge, puis ré-écran de la ligne spécifique M1 et de sauvetage sans décharge. Ces mutants peuvent être confirmés dans les générations M3 et M4 en utilisant l’étape de décharge.
  9. Utilisez une méthode de numérisation au format 24 puits qui mesure chaque ligne en intervalle de 7 s avec un temps d’intégration de 300 ms par puits par point de mesure. Utilisez un semis de type sauvage comme contrôle dans chaque ligne pour la comparaison et l’évaluation du mutant.
    REMARQUE : Une seule plaque de puits de 96 contenant des semis M2 couvrira 8 lignes M1 individuelles (8 M1*12= 96 M2) et peut être projetée en 2,5 h et chaque jour 32 M1 lignes seront examinées, 640 M1 plantes par mois. L’ensemble de la procédure de dépistage après les plantes sont prêtes prendrait environ 8 mois.
  10. Identifier les mutants en fonction de la perte ou de la réduction de la réponse ca2+ avec H2O2. Sauvez les mutants sélectionnés grâce à un processus de lavage à base d’antibiotiques. Laver le semis avec une solution de céfotaxime de 25 mg/L deux fois, puis transférer vers un milieu de sauvetage qui contient 25 mg/L de céfotaxime dans 1/2 MS agar.
  11. Cultivez les plaques à une photopériode de 10 h/ 14 h foncée pour obtenir une plante mutante. Le lavage de cefotaxime aide à éliminer tous les micro-organismes nuisibles sur le semis. Étant donné que les semis après la reconstitution ne sont pas scellés, réduisez au minimum la contamination lors du transfert à l’état stérile.
  12. Transférer la plante mutante sur le sol pour obtenir la population d’homozygotes M3.

3. Analyse des données et identification des mutants (1-3 mois)

REMARQUE : Les lectures fournies par la méthode ci-dessus sont en unités de lumière relative (RLU).

  1. Pour calculer [Ca2+] la concentrationcyt, utilisez l’équation de concentration suivante20.
    pCa = 0,332588(−log (L/Lmax)) + 5,5593
    Compte de luminescence () et nombre total restant (max).
  2. Convertir les valeurs pCa obtenues en valeurscyt [Ca2+] en μM en multipliant par 106. Puis graphiquement tracer contre un aequorin (transgénique Col-0 aequorin) contrôle pour identifier putatif H2O2 mutants à Ca2 + réponse.
  3. Les semis de sauvetage montrant une perte ou une réponse réduite à l’applicationH2O2 ont été secourus.
  4. Lors de la maturation, récolter les graines du mutant sauvé et ré-examiner la réponse aux semis H2O2 en M3. Si tous les 12 M3 semis montrent une réponse Ca2+ similaire à la plante mère, considérez la population comme une population mutante homozygote M3. Si les 12 semis ne montrent pas une telle réponse, puis les prendre à la génération M4 et re-écran pour obtenir la population d’homozygotes.
  5. Une fois qu’une lignée de plantes homozygotes a été obtenue, identifiez le gène conduisant à un phénotype altéré à l’aide du séquençage de la prochaine génération.

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Résultats

La population de SME a été examinée pour h2O2 induit Ca2+ altitude. Comme nous l’avons vu précédemment, 12 semis M2 individuels ont été examinés à partir de chaque ligne M1. Dans la figure 3, une telle ligne M1 est tracée avec chaque panneau montrant 12 semis M2 individuels. Une aequorine de type sauvage est utilisée comme contrôle pour comparer et évaluer la réponse mutante. Un mutant récessif sépare dans le rappor...

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Discussion

La mutanéèse ems est un outil puissant pour générer des mutations dans la population. Les écrans génétiques avancés classiques utilisant le SME ont été un outil efficace pour identifier de nouveaux gènes pour deux raisons principales : premièrement, ils ne nécessitent aucune hypothèse préalable sur l’identité génétique et, deuxièmement, ils n’introduisent aucun biais. Il existe plusieurs méthodes pour générer un dépistage des populations comme le SME, les insertions d’ADN T, les radiations, etc. De toutes les méthodes, l...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale pour la séance vidéo et le Department of Biotechnology- eLibrary Consortium d’avoir fourni l’accès aux ressources électroniques. Ces travaux ont été soutenus par le Département de biotechnologie de l’Inde par l’intermédiaire du National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; et bourse de recherche CSIR-Junior (à D.M et S.M) et De la Bourse de recherche du Département de biotechnologie-junior (à R.P).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de culture tissulaire à 24 puitsJetbiofil11024pour la croissance des semis
Plaque cliniplate blanche à 96 puitsThermo Scientific9502887pour les mesures au luminomètre
Aequorin
AgropetLab Chem Indiapour la croissance des plantes
Chlorurede calcium Fisher Scientific12135pour la décharge solution
CoelenterazinePJK55779-48-1groupe prothétique pour l’aequorin
Ehtylmethane sulfonateSigma AldrichM0880-5Gpour la mutagenèse
des graines ÉthanolRéactif analytique1170pour solution de décharge
Acide chlorhydriqueMerck Life Sciences1.93001.0521solution de sterlisation
Peroxyde d’hydrogèneFisher Scientific15465comme stimulus pour l’élévation calcique
Ascension de LuminoskanThermo Scientific5300172mesure de la luminescence de l’aequorin
Tampon MESHimediaRM1128-100GCroissance des plantes
Murashige et skoog mediaHimediaPT021-25Ldes plantes
Hydroxyde de sodiumFisher Scientific27805pour neutralisant EMS
Hypochlorite de sodiumMerck Life Sciences1.93607.5021solution de sterlisation
Thiosulfate de sodiumFisher Scientific28005pour le lavage des graines à l’étape 1.6
soilriteLab Chem Indiapour la croissance des plantes
Pots carrésLab Chem Indiapour la croissance des plantes
SaccharoseSigma AldrichS0389croissance des plantes
TaximAlkem7180720pour le sauvetage des semis
croissance

Références

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