Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.
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Article de méthode
Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans des cellules HEK293, puis purifié de manière rentable par chromatographie d’affinité. Un protocole reproductible a été développé pour mono-biotinylate directement BDNFAvi avec l’enzyme BirA dans un tube. Dans cette réaction, le BDNFAvi mono-biotinylé conserve son activité biologique.
Les neurotrophines sont des facteurs de croissance dérivés de la cible qui jouent un rôle dans le développement et l’entretien des neurones. Ils nécessitent des mécanismes de transport rapide le long de la voie endocytique pour permettre la signalisation longue distance entre les différents compartiments neuronaux. Le développement d’outils moléculaires pour étudier le trafic de neurotrophines a permis le suivi précis de ces protéines dans la cellule à l’aide de l’enregistrement in vivo. Dans ce protocole, nous avons développé une procédure optimisée et rentable pour la production de BDNF mono-biotinylée. Une variante recombinante de BDNF contenant une séquence d’avi biotinylable (BDNFAvi) est produite dans les cellules HEK293 dans la gamme de microgrammes, puis purifiée dans une procédure facilement évolutive utilisant la chromatographie d’affinité. Le BDNF purifié peut alors être homogènement mono-biotinylé par une réaction in vitro directe avec l’enzyme BirA dans un tube. L’activité biologique du BDNF mono-biotinylé (mbtBDNF) peut être conjuguée à la streptavidine-conjuguée à différents fluorophores. BDNFAvi et mbtBDNF conservent leur activité biologique démontrée par la détection de cibles phosphorylyées en aval à l’aide de la tache occidentale et de l’activation du facteur de transcription CREB, respectivement. En utilisant des points streptavidine-quantiques, nous avons pu visualiser l’internalisation mbtBDNF concomitante à l’activation du CREB, qui a été détecté avec un anticorps spécifique au phospho-CREB. En outre, mbtBDNF conjugué aux points streptavidin-quantum était approprié pour l’analyse rétrograde de transport dans les neurones corticaux cultivés dans les chambres microfluidiques. Ainsi, dans le tube produit mbtBDNF est un outil fiable pour étudier la dynamique de signalisation physiologique endosome et le trafic dans les neurones.
Introduction
Les neurones sont les unités fonctionnelles du système nerveux possédant une morphologie complexe et spécialisée qui permet la communication synaptique, et donc, la génération de comportements coordonnés et complexes en réponse à divers stimuli. Les projections neuronales telles que les dendrites et les axones sont des caractéristiques structurelles essentielles impliquées dans la communication neuronale, et les neurotrophines sont des acteurs essentiels pour déterminer leur morphologie et leur fonction1. Les neurotrophines sont une famille de facteurs de croissance sécrétés qui incluent NGF, NT-3, NT-4, et le facteur neurotrophique cerveau-dér....
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Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le CONICYT (Commission nationale chilienne pour la recherche scientifique et technologique). Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par les Comités de biosécurité et de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Des expériences impliquant des vertébrés ont été approuvées par le Comité de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
REMARQUE : Le protocole suivant a été conçu pour purifier BDNFAvi à partir d’un volume total de 500 mL de milieu conditionné produit d....
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Résultats
L’utilisation d’un protocole chromatographique basé sur les colonnes permet le traitement de volumes importants de supports conditionnés HEK293. Dans la figure 1, les résultats de la purification de BDNFAvi à partir de 500 mL de support conditionné sont affichés. Les élutions consécutives de BDNFAvi des perles d’agarose Ni-NTA donnent des concentrations décroissantes de BDNFAvi (Figure 1A). Après quatre ellutions consécutives (chacune d’une durée de 15 min), la .......
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Discussion
Dans cet article, une méthodologie optimisée pour la production et la purification du mbtBDNF dans une procédure basée sur la chromatographie d’affinité est décrite, basée sur le travail de Sung et collaborateurs17. Les optimisations comprennent l’utilisation d’un réactif transfection rentable (Î.-P.-É.) tout en maintenant l’efficacité de méthodes de transfection plus coûteuses comme la lipofectamine. Cette optimisation se traduit par une réduction significative des coûts du protocole, permettant .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de Fondecyt (1171137) (FCB), du Centre basal d’excellence en science et technologie (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), le Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) et un prix de la Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Ce travail a été soutenu par l’Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Robinet d’arrêt 2 voies | BioRad | 7328102 | Appareil de chromatographie composant |
| 2-mercaptoéthanol | Sigma | M6250 | Tampon d’élution BDNF |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | Préparation de gel SDS-PAGE |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | Concentration de BDNF |
| Persulfate d’ammonium | Sigma | A9164 | Préparation de gel SDS-PAGE |
| anti anticorps B-III-Tubuline | Sigma | T8578 | Dosages Western blot pour la détection de l’activité biologique BDNF |
| Anticorps anti-BDNF | Alomone | AGP-021 | Dosages Western blot pour la quantification BDNF |
| Anticorps anti-BDNF | Alomone | ANT-010 | Dosages Western blot pour quantification BDNF |
| Cellule d’anticorps anti-ERK | Signalisation | 9102 | Tests Western blot pour la détection de l’activité biologique BDNF |
| Anticorps anti pCREB (S133) | Signalisation cellulaire | 9198 | Tests Western blot pour la détection de l’activité biologique BDNF |
| Anticorps anti pERK (T202, Y204) | Signalisation cellulaire | 4370 | Tests Western blot pour la détection de l’activité biologique BDNF |
| Anticorps anti pTrkB (Y515) | Abcam | ab109684 | Tests Western blot pour la détection de l’activité biologique du BDNF |
| Antibiotique/Antimycosique | Gibco | 15240-062 | HEK293 Maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | Tampon de monobiotinylation BDNF |
| B-27 Supplément | Gibco | 17504-044 | Maintenance des neurones |
| Bicine | Sigma | B3876 | Tampon de monobiotinylation BDNF |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme pour BDNF AviTag monobiotinylation |
| Sérum fœtal bovin | HyClone | HC. SH30396.02 | HEK293 entretien Albumine |
| sérique bovine | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Composant de modification du tampon BDNF, tampon bloquant pour western blot et immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | Tampon de monobiotinylation BDNF |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Ensemencement de neurones |
| DMEM | Medium Gibco | 11995-081 | HEK293 Maintenance |
| Econo Column Funnel BioRad | 7310003 | Composant de l’appareil de chromatographie | |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Détection de protéines par western blot |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron et HEK293 |
| Maintenance Glycérol | Merck | 104094 | Tampon d’élution BDNF, tampon de lyse pour les dosages par transfert western |
| Hettich Rotina 46R Centrifugeuse | Hettich | Discontinued | Centrifugeuse utilisée pour éliminer le milieu des débris |
| Hettich Universal 32R Centrifugeuse | Hettich | Discontinued | Centrifugeuse utilisée pour la centrifugation du concentrateur de protéines |
| Sérum de cheval | Gibco | 16050-122 | Ensemencement de |
| neuronesImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Acquisition d’images par transfert Western |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF |
| KCl | Winkler | BM-1370 | Composant PBS |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | Composant PBS |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Revêtement de revêtement pour neurones compartimentés |
| Adaptateur de tube Luer BioRad | 7323245 | Composant d’appareil de chromatographie | |
| Luminata&trade ; Forte Western HRP Substrat | Millipore | WBLUF0100 | Détection des protéines par western blot |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | Tampon de monobiotinylation BDNF |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Réactif de montage pour les dosages d’immunofluorescence |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Vérification de la biotinylation |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | Composant de modification du tampon BDNF |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | Composant PBS, Composant de modification du tampon BDNF |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | Composant de modification du tampon BDNF |
| Milieu neurobasal | Gibco | 21103-049 | Maintenance des neurones |
| Ni-NTA Perles d’agarose | Qiagen | 30210 | BDNF Purification AviTag |
| Nikon Ti2-E | Nikon | pour l’imagerie par fluorescence | |
| Membrane nitrocellulosique | BioRad | 1620115 | Transfert de protéines pour western blot |
| ORCA-Flash4.0 V3 Caméra CMOS numérique | Hamamatsu | C13440-20CU | Caméra pour l’imagerie par épifluorescence |
| P8340 Inhibiteur de protéase Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF Composant de modification |
| du tampon Paraformaldéhyde | Merck | 104005 | Fixateur pour dosages d’immunofluorescence |
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Maintenance des neurones |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Revêtement de couverture pour neurones compartimentés |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Revêtement de couverture pour neurones non compartimentés |
| Colonne de chromatographie Poly-Prep BioRad | 7311550 | Composant d’appareil de chromatographie | |
| Polyéthylèneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 conjugué de streptavidine | Invitrogen | Q10121MP | BDNF monobiotinylé Étiquette AviTag pour expériences sur cellules vivantes et fixées |
| Saponin | Sigma | S4521 | Détergent pour tests d’immunofluorescence |
| Syldgard 184 base en élastomère de silicone | Poirot | 4019862 | Préparation de la chambre microfluidique |
| TEMED | Sigma | T9281 | Préparation de gel SDS-PAGE |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Composant tampon de lyse |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Perméabilisation cellulaire dans les tests d’immunofluorescence et de transfert Western |
| Trypsine-EDTA 0,5 % | Gibco | 15400-054 | HEK293 passage |
Références
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology.
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Réimpressions et autorisations
