Ce protocole décrit trois étapes pour préparer les lobes optiques de la drosophile larvaire et adulte à l’imagerie : 1) dissections cérébrales, 2) immunohistochimie et 3) montage. L’accent est mis sur l’étape 3, car des orientations de montage distinctes sont nécessaires pour visualiser des structures spécifiques du lobe optique.
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Article de méthode
Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le lobe optique de la drosophile , composé de quatre neuropilles : la lame, la moelle, le lobula et la plaque lobula, est un excellent système modèle pour explorer les mécanismes de développement qui génèrent la diversité neuronale et pilotent l’assemblage des circuits. Compte tenu de son organisation tridimensionnelle complexe, l’analyse du lobe optique nécessite de comprendre comment ses neuropils adultes et ses progéniteurs larvaires sont positionnés les uns par rapport aux autres et par rapport au cerveau central. Nous décrivons ici un protocole de dissection, d’immunomarquage et de montage de cerveaux larvaires et adultes pour l’imagerie du lobe optique. Un accent particulier est mis sur la relation entre l’orientation du montage et l’organisation spatiale du lobe optique. Nous décrivons trois stratégies de montage chez la larve (antérieure, postérieure et latérale) et trois chez l’adulte (antérieure, postérieure et horizontale), chacune offrant un angle d’imagerie idéal pour une structure de lobe optique distincte.
Introduction
Le système visuel de la drosophile, composé de l’œil composé et du lobe optique sous-jacent, a été un excellent modèle pour l’étude du développement et de la fonction des circuits neuronaux. Ces dernières années, le lobe optique en particulier est devenu un système puissant dans lequel étudier les processus neurodéveloppementaux tels que la neurogenèse et le câblage des circuits 1,2,3,4,5,6,7,8.....
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Protocole
1. Préparation des cerveaux larvaires pour l’imagerie confocale
- Dissections
REMARQUE : Avant de commencer la dissection, préparez les solutions de correctif (formaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et de PBT (0,1 à 0,3 % de Triton dans le PBS). La solution fixe doit être placée sur de la glace pendant la dissection. Bien que le fixateur de paraformaldéhyde (PFA) soit utilisé dans ce protocole, d’autres stratégies de fixation (utilisant le PLP20 ou le PEM21) ont été décrites pour des épitopes spécifiques. Pour les dissections larvaires, deux paires de pinces ....
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Résultats
Des images confocales des lobes optiques larvaires et adultes montés dans les orientations décrites dans le protocole sont présentées à la figure 1 et à la figure 2.
La figure 1 montre des schémas et des coupes confocales représentatives de cerveaux larvaires positionnés dans les orientations antérieure, postérieure et latérale. Dans l’orientation antérieure montante, l’épithélium OPC (DE-Cadhérine), les .......
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour immunocolorer les cerveaux des larves et des adultes de drosophile et les monter dans plusieurs orientations. Bien que des méthodes de coloration des cerveaux larvaires et adultes aient déjà été décrites 22,23,24,27,28, les stratégies de montage pour la visualisation optimale de structures spécifiques du lobe optique ont reçu moins d’attention28........
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous tenons à remercier Claude Desplan d’avoir partagé avec nous une aliquote de l’anticorps Bsh. Les anticorps monoclonaux DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up et Bruchpilot ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank, créée par le NICHD du NIH et maintenue à l’Université de l’Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA 52242. Ces travaux ont été financés par une subvention à la découverte du CRSNG accordée à T.E. U.A. est soutenu par une bourse d’études supérieures canadiennes Alexander-Graham-Bell du CRSNG. P.V. est soutenu par une bourse d’études supérieures de l’Ontario.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37 % formaldéhyde | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (chèvre) secondaire | Invitrogen | A-11055 | utilisation à 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (souris) secondaire | Invitrogen | A-31570 | utilisation à 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (cobaye) secondaire | Invitrogen | A-21450 | à 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (rat) secondaire | Invitrogen | A-21247 | utilisation à 1:500 |
| Couvercles | VWR | 48366-067 | |
| Pince à dissection - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Pince à dissection - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Plat de dissection | Corning | 722085 | |
| Lingettes sèches | Kimbery Clark | 34155 | |
| Anticorps primaire anti-Bgal de chèvre | Biogenèse | utilisation au 1:1000 | |
| Anticorps primaire anti-Bsh de cobaye | Cadeau de Claude Desplan | utilisation à 1:500 | |
| Anticorps primaire anti-Vsx1 de cobaye | Erclik et al. 2008 | à 1:1000 | |
| Film de laboratoire | Parafilm | PM-996 | |
| Tubes de microcentrifugation | Sarstedt | 72.706.600 | |
| Lames de microscope | VWR | CA4823-180 | |
| Anticorps primaire anti-dac de souris | Etudes développementales Hybridoma Bank (DSHB) | mabdac2-3 | utilisation à 1:20 |
| Anticorps primaire anti-eya de souris | DSHB | eya10H6 | utilisation à 1:20 |
| Anticorps primaire anti-nc82 de souris | DSHB | nc82 | utilisation à 1:50 |
| Souris anticorps primaire anti-svp | DSHB | Seven-up 2D3 | utilisation à 1:100 |
| Pâte polymère | Tout type d’argile peut être utilisé | ||
| Lapin anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | utilisation à 1:1000 |
| Rat anti-DE-Cadhérine anticorps primaire | DSHB | DCAD2 | utilisation à 1:20 |
| Milieu de montage à fondu lent | Invitrogen | S36967 | Le support de montage Vectashield (cat# H-1000) peut également être utilisé |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Références
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
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Réimpressions et autorisations
