Article de méthode

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

DOI :

10.3791/61278

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1 août 2020

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1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tendinopathie est une maladie chronique commune de tendon relative à l’inflammation et à la dégénérescence dans une zone orthopédique. Avec une morbidité élevée, une capacité d’auto-réparation limitée et, surtout, aucun traitement définitif, la tendinopathie influence encore négativement la qualité de vie des patients. Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie, et la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie. Ainsi, une méthode qui peut in vitro imiter la différenciation in vivo des TDSCs en cellules de tendon serait utile. Ici, le présent protocole décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissus semblables à des tendons. Il y a sept étapes du protocole actuel : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille cellulaire par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines. Pour favoriser le dépôt extracellulaire de matrice, l’acide ascorbique de 4.4 mg/mL a été employé dans le milieu de culture de stimulation. Une chambre séparée avec un moteur linéaire fournit une charge mécanique précise et est portable et facilement ajusté, qui est appliqué pour le bioréacteur. Le régime de chargement dans le protocole actuel était de 6% souche, 0,25 Hz, 8 h, suivie de 16 h de repos pendant 6 jours. Ce protocole pourrait imiter la différenciation cellulaire dans le tendon, ce qui est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie. En outre, le tissu tendon-like est potentiellement utilisé pour favoriser la guérison du tendon dans les blessures du tendon comme une greffe autologue ingénieur. En résumé, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Introduction

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La tendinopathie est l’une des blessures sportives courantes. Il se manifeste principalement par la douleur, l’enflure locale, la tension musculaire diminuée dans la zone affectée, et le dysfonctionnement. L’incidence de la tendinopathie est élevée. La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente chez les coureurs de moyenne et longue distance (jusqu’à 29 %), tandis que la présence de tendinopathie patellaire est également élevée chez les athlètes de volley-ball (45 %), de basket-ball (32 %), d’athlétisme (23 %), de handball (15 %) et de soccer(13%) 1,2,3,,4,,5. Cependant, en raison de la capacité d’auto-guérison limitée du tendon, et l’absence de traitements efficaces, tendinopathie influence encore la vie des patients négativement6,7. En outre, la pathogénie de la tendinopathie reste peu claire. Il ya eu de nombreuses enquêtes sur sa pathogénie, principalement y compris la « théorie de l’inflammation », « théorie de la dégénérescence », « théorie de la surutilisation », et ainsi de suite8. À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs croyaient que la tendinopathie était due à l’auto-réparation ratée aux micro-blessures causées par une charge mécanique excessive le tendon éprouve9,10.

Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie et dans la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie11,12,13. Il a été rapporté que la stimulation mécanique de contrainte pourrait causer la prolifération et la différenciation des ostéocytes, des ostéoblastes, des cellules musculaires lisses, des fibroblastes, des cellules souches mésenchymales et d’autres cellules sensibles à la force14,15,16,17,18. Par conséquent, les TDSC, en tant que l’une des cellules mécanosensibles et multipotentes, peuvent également être stimulées à différencier par chargement mécanique19,20.

Toutefois, différents paramètres de chargement mécanique (résistance au chargement, fréquence de chargement, type de chargement et période de chargement) peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules21. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la tenogenèse. En outre, il existe différents types de bioréacteurs que les systèmes de stimulation actuellement utilisés pour fournir le chargement mécanique aux TDSC. Les principes de chaque type de bioréacteur sont différents, de sorte que les paramètres de chargement mécanique correspondant à différents bioréacteurs sont également différents. Par conséquent, un protocole de stimulation simple, économique et reproductible est en demande, y compris le type de bioréacteur, le milieu de stimulation correspondant et le régime de chargement mécanique.

Le présent article décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissu tendinaire. Il y a sept étapes du protocole : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille de cellules par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines pour obtenir la construction de cellules 3D, ce qui est beaucoup moins que certaines méthodes existantes22,23. Le protocole actuel s’est avéré être capable d’inciter les TDSC à se différencier en tissu de tendon, et il est plus fiable que le système d’étirement bidimensionnel (2D) couramment utilisé (2D)courant 21. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. En bref, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

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Protocole

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Les méthodes décrites ont été approuvées et exécutées conformément aux lignes directrices et règlements du Comité d’éthique animale de l’Université d’Australie-Occidentale.

1. Isolement des souris TDSCs

  1. Euthanasier les souris C57BL/6 de 6-8 semaines par dislocation cervicale.
  2. Moisson tendons rotuleux24 et tendons d’Achille25.
  3. Digest tendons de l’un avec 6 mL de collagènease de type I (3 mg/mL) pour 3 h.
    NOTE: Comme la taille du tendon de la souris est petite, tous les tendons récoltés à partir d’une souris doivent être utilisés dans cette étape.
  4. Recueillir les cellules et la culture dans le milieu essentiel complet (Alpha-MEM) contenant 10% du sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de la streptomycine et le mélange de pénicilline pendant 7 jours.
  5. Identifier les TDSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie de flux (expression des marqueurs de surface cellulaire, y compris CD44, CD90 et Sca-1; absence d’expression de CD34 et CD45).
  6. Cellules de passage et de congélation (les cellules de passage 4 seront utilisées pour d’autres étapes).

2. Culture et expansion des souris TDSC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Prenez les cellules réchauffées (souris TDSC, 1 million de cellules, passage 4, à 37 °C).
  2. Ajoutez lentement 4 à 5 mL supplémentaires de support minimal essentiel complet (Alpha-MEM).
  3. Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à l’aide d’une pipette.
  4. Garnir d’un total moyen à 8 mL avec une pipette.
    1. Préwarm moyen dans un incubateur de four à 37 °C.
  5. Placez le tube dans la centrifugeuse et l’équilibre.
  6. Cellules de centrifugeuse et de granulé à 347 x g pendant 5 min.
  7. Sortir après la centrifugeuse et vérifier la pastille au fond.
  8. Décanter le milieu de congélation et resuspend les cellules doucement en 1-2 mL de milieu complet (éviter de faire trop de bulles).
  9. Transférer les cellules réesspendées dans une fiole T-75 par une pipette.
  10. Utilisez une pipette pour ajouter un alpha-MEM moyen complet à la fiole pour atteindre un volume total de 10 ml avec une concentration finale de 13 000 cellules/cm2.
  11. Placez la fiole dans l’incubateur et la culture à 37 °C avec 5% de CO2.
  12. Changer le milieu tous les 3 jours.
  13. Observez et surveillez les cellules au microscope lors du changement du milieu jusqu’à ce que les cellules soient cultivées à 100% confluent (environ 40 000 cellules/cm2).

3. Préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuilles cellulaires

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Verser 15 ml de milieu Alpha-MEM complet dans un tube stérile de 15 ml.
  2. Ajouter 6 μL d’acide ascorbique (11 mg/mL) dans 15 mL de milieu pour une concentration finale de 4,4 μg/mL.
    REMARQUE : En plus d’ajouter 25 ng/mL facteur de croissance du tissu conjonctif dans le milieu de culture de stimulation peut accélérer l’ensemble du processus de croissance et de différenciation.
  3. Mélanger délicatement en inversant de haut en bas.

4. Formation de feuille de cellule par la culture dans le milieu de stimulation

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Jetez soigneusement le milieu alpha-MEM complet normal et évitez de toucher les cellules fixées au fond de la fiole.
  2. Ajouter 10 mL de milieu de stimulation lentement et éviter de causer des perturbations aux cellules entièrement confluentes.
  3. Culture des cellules en milieu de stimulation pendant 9 jours (changer le milieu tous les 3 jours) pour générer suffisamment la feuille cellulaire à 37 °C avec 5% de CO2.
    REMARQUE : La matrice extracellulaire deviendra épaisse et présente pour être trouble lorsqu’elle est observée du fond de la fiole après avoir été stimulée par de l’acide ascorbique, ce qui signifie que la feuille cellulaire est suffisamment générée.

5. Préparation de la construction de cellules souches du tendon 3D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Sortez la fiole de l’incubateur.
  2. Jeter complètement le milieu de stimulation.
  3. Laver la feuille de cellule monocouche à l’une de la solution saline tampon de phosphate (PBS) en faisant tourbillonner la fiole.
  4. Jetez complètement le PBS.
  5. Utilisez une pipette pour ajouter 1 ml de trypsin de 0,25 % au coin de la fiole.
  6. Appuyez sur le coin de la fiole pour dé-attacher la feuille de cellule monocouche jusqu’à ce que le coin de la feuille de cellule soit hors du fond de la fiole.
  7. Ajoutez immédiatement 9 mL de support Alpha-MEM complet pour arrêter la trypsinisation.
  8. Continuer à tourbillonner la fiole pour décoller complètement la feuille de cellules monocouches.
  9. Verser la feuille de cellule totale dé-attachée dans une boîte de Pétri avec un milieu.
  10. Utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser un coin de la feuille de cellule et tourner dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 15 fois.
  11. Prenez une autre extrémité de la feuille cellulaire et tournez dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 10 fois pour générer fermement une construction in vitro semblable à un tendon (Figure 1A).

6. Assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-stretching dans un bioréacteur unique conçu

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Connectez les crochets par le raccordeur et réglez-vous à la distance souhaitée (2 cm) entre deux crochets.
  2. Enroulez doucement la construction 3D TDSC sur le crochet assemblé 3 fois sur chaque crochet (Figure 1B).
  3. Fixer les crochets avec la construction de cellules sur la chambre du bioréacteur en serrant les vis sur deux extrémités.
    REMARQUE : Toute la chambre, y compris les vis et les crochets, est stérile (autoclave pendant 1,5 h à 134 °C et les rayons ultraviolets (UV) exposent pendant 24 heures avant l’utilisation). Pour le support métallique des chambres, la lumière UV s’expose pendant 48 heures avant l’utilisation.
  4. Remplissez la chambre avec un support Alpha-MEM complet.
  5. Connectez l’actionneur à la chambre de culture par câble.
  6. Couper le raccordeur de crochets par des ciseaux stériles.
  7. Allumez la puissance et le contrôleur de canal correspondant pour commencer la stimulation mécanique.
  8. Mettez le couvercle sur la chambre.
  9. Vérifiez les feux indicateurs et assurez-vous que le bioréacteur peut fonctionner correctement.
  10. Placez le bioréacteur dans l’incubateur et soumettez la construction de cellules 3D à des étirements mécaniques pendant 6 jours (6% d’étirement, 0,25 Hz, 8 h, suivi de 16 h de repos).

7. Évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro semblable à un tendon

  1. Desserrez les vis par un tournevis et retirez soigneusement l’assemblage.
  2. Placez le tissu tendinaire dans 4% de paraformaldéhyde pour la fixation pendant 15 min.
  3. Placez le tissu fixé en forme de tendon dans une cassette de biopsie avec des coussinets en mousse de biopsie.
  4. Procédé pour déshydrater l’échantillon et finalement évaluer par H&E coloration histologique.
  5. Répétez l’ensemble du protocole et extrayez l’ARN du tissu tendinaire pour évaluer l’expression des marqueurs tenogènes par PCR quantitatif (qPCR). Les amorces pour les gènes sélectionnés sont répertoriées dans le tableau 1.
    REMARQUE : Le protocole histologie et le protocole qPCR sont standard et après une étude précédente21.

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Résultats

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Avant la stimulation mécanique, les TDSC étaient cultivés à 100% confluent dans un milieu complet et affichaient une morphologie ultrastructurale désorganisée (figure 2A). Après 6 jours de chargement mécanique uniaxial d’étirement, la matrice extracellulaire (ECM) et les alignements cellulaires étaient bien orientés (figure 2B). Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans ecm après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour être allongée et était...

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Discussion

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Le tendon est un tissu conjonctif fibreux mécanosensible. Selon des recherches antérieures, l’excès de charge mécanique pourrait conduire à la différenciation ostéogénique des cellules souches du tendon, alors qu’une charge insuffisante conduirait à une structure désordonnée de fibres de collagène au cours de la différenciation destendons 21.

Un point de vue commun est que la clé d’un bioréacteur idéal est la capacité de simuler le microenvironnement cellulaire in vitro...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche a été réalisée alors que l’auteur recevait « une bourse d’études internationales de l’Université d’Australie-Occidentale et un prix universitaire de troisième cycle à l’Université d’Australie-Occidentale ». Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81802214).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide ascorbiqueSigma-aldrichPHR1008-2G
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibcoä ; de Life Technologies1908361 Processeur d’histologie
LeicaTP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)Gibcoä ; de Life Technologies2003802
Cellulessouches dérivées de tendons de sourisIsolé des tendons d’Achille de souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines. Puis digéré avec de la collagénase de type I (3 mg/ml ; MilliporeSigma, Burlington, MA, États-Unis) pendant 3 h et passés à travers une crépine de 70 mmcell pour produire des suspensions unicellulaires.
ParaformaldéhydeSigma-aldrich441244
Mélange de streptomycine et de pénicillineGibcoä ; par Life Technologies15140122
Système de bioréacteur de stimulation mécanique uniaxiale tridimensionnelleCentre de recherche translationnelle orthopédique, Faculté de médecine, Université d’Australie-OccidentaleDisponible auprès de l’auteur correspondant sur demande. Ou le faire selon notre conception* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. La stimulation mécanique programmable influence l’homéostasie tendineuse dans un système de bioréacteur. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5) :1495&ndash ;1507. doi :10.1002/bit.24809
TrypsineGibcoä ; par Life Technologies1858331

Références

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Mots-clés

tirement uniaxial 3Dformation de feuillets cellulairesfraction vasculaire stromalecytom trie en fluxtraitement l acide ascorbiquevaluation histologiqueanalyse par qPCR

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