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Article de méthode

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

7.7K vues

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DOI :

10.3791/61283

⸱

27 septembre 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Mary's College of California

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Résumé

Des neurones sympathiques des ganglions cervicals supérieurs de rat embryonnaire (SCG) ont été employés comme système de modèle in vitro pour les neurones périphériques pour étudier la croissance axonale, le trafic axonal, la synaptogenèse, la croissance dendritique, la plasticité dendritique et les interactions nerveuses-cibles dans les systèmes de co-culture. Ce protocole décrit l’isolement et la dissociation des neurones des ganglions cervicals supérieurs des embryons de rat E21, suivis de la préparation et du maintien des cultures neuronales pures dans le milieu sans sérum. Puisque les neurones n’adhèrent pas au plastique non couché, les neurones seront cultivés sur des couvercles en verre de 12 mm ou des plaques de 6 puits recouvertes de poly-D-lysine. Après un traitement avec un agent antimitotique (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), ce protocole génère des cultures neuronales saines avec moins de 5% de cellules non neuronales, qui peuvent être maintenues pendant plus d’un mois in vitro. Bien que les neurones embryonnaires de SCG de rat soient multipolaires avec 5-8 dendrites in vivo ; dans des conditions sans sérum, ces neurones ne s’étendent qu’à un seul axone en culture et continuent d’être unipolaires pendant toute la durée de la culture. Cependant, ces neurones peuvent être induits pour étendre les dendrites en présence de l’extrait de membrane de sous-sol, des protéines morphogenétiques d’os (BMP), ou 10% sérum foetal de veau. Ces cultures neuronales homogènes peuvent être utilisées pour la coloration immunocytochimique et pour les études biochimiques. Cet article décrit également le protocole optimisé pour la coloration immunocytochimique pour la protéine-2 associée aux microtubules (MAP-2) dans ces neurones et pour la préparation d’extraits neuronaux pour la spectrométrie de masse.

Introduction

Les neurones sympathiques dérivés des ganglions cervicals supérieurs embryonnaires (SCG) ont été largement utilisés comme système de culture neuronale primaire pour étudier de nombreux aspects du développement neuronal, y compris la dépendance aux facteurs de croissance, interactions neurone-cible, signalisation neurotransmetteur, croissance axonale, développement de dendrite et plasticité, synaptogenèse et mécanismes de signalisation sous-jacents nerf-cible/ neurone-glia interactions1,2,3,4,5,6,7,8,9. Malgré leur petite taille (environ 10000 neurones /ganglions), il ya trois raisons principales pour le développement et l’utilisation extensive de ce système de culture sont i) étant les premiers ganglions dans la chaîne sympathique, ils sont plus grands, et donc plus facile à isoler, que le reste des ganglions sympathiques10; ii) contrairement aux neurones centraux, les neurones de la SCG sont assez homogènes avec tous les neurones dérivés de la crête neuronale, ayant une taille similaire, la dépendance au facteur de croissance nerveuse et d’être nor-adrenergic. Cela en fait un modèle précieux pour les études morphologiques et génomiques10,,11 et iii) ces neurones peuvent être maintenus dans un milieu défini sans sérum contenant un facteur de croissance nerveuse pendant plus d’un mois10,12. Les neurones perinatal SCG ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’initiation et à l’entretien des dendrites2. C’est principalement parce que, bien que les neurones SCG ont une arborescence dendritique étendue in vivo, ils n’étendent pas les dendrites in vitro en l’absence de sérum, mais peuvent être induits à cultiver des dendrites en présence de certains facteurs de croissance tels que les protéines morphogenétiques osseuses2,12,13.

Cet article décrit le protocole pour isoler et cultiver les neurones embryonnaires de SCG de rat. Au cours des 50 dernières années, les cultures neuronales primaires du SCG ont été principalement utilisées pour des études morphologiques avec un nombre limité d’études examinant les changements génomiques ou protéomiques à grande échelle. Ceci est principalement dû à la petite taille des tissus ayant pour résultat l’isolement de faibles quantités d’ADN ou de protéines, ce qui rend difficile d’effectuer des analyses génomiques et protéomiques sur ces neurones. Cependant, ces dernières années, une sensibilité accrue à la détection a permis le développement de méthodes d’examen du génome, du miRNome et du protéome dans les neurones SCG pendant le développement de la croissance dendritique14,15,16,17. Cet article décrira également la méthode d’analyse morphologique de ces neurones à l’aide de l’immunocytochimie et d’un protocole pour obtenir des extraits de protéines neuronales pour l’analyse spectrométrique de masse.

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Protocole

Toutes les procédures effectuées dans des études portant sur des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Saint Mary’s College of California. Les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux du Collège Saint Mary’s ont été élaborées sur la base des lignes directrices fournies par le Bureau du bien-être animal de laboratoire de l’Institut national de la santé (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf et https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Préparation des supports culturels (également appelé support de contrôle)

  1. Ajouter les ingrédients suivants, dans l’ordre énuméré ci-dessous, à une fiole stérile de 500 ml : 190 ml de DMEM à faible teneur en glucose, 10 ml de sérum bovin sans acide gras de 20 mg/mL (FAF-BSA) en DMEM, 2,8 mL de 200 mM L-glutamine, 4 mL de mélange insuline-sélénium-transferrine 100x, 0,4 mL de 125 μg/mL facteur de croissance nerveuse (dans 0,2% stabilisateur de protéine inerte dans DMEM), et 200 mL de facteur de croissance du nerf F-12 de Ham.
  2. Assurez-vous d’enrober la pipette du milieu contenant la FAF-BSA avant l’ajout de solutions contenant des protéines telles que l’insuline-sélénium-transferrine et la NGF pour éviter le collage de protéines à la pipette.
  3. Faire tourbillonner la fiole pour mélanger les ingrédients après chaque ajout. Bien mélanger avec une pipette de 25 mL après ajout de F-12.
  4. Aliquot les médias culturels dans 10 mL aliquots et stocker à -80 °C. Les aliquots peuvent être stockés pendant six mois sans perte d’activité.

2. Préparation de plaques pour la culture des neurones

  1. Diluer un stock de 1 mg/mL de poly-D-lysine (fabriqué en tampon Tris de 0,5 M, pH 8) à 100 μg/mL avec de l’eau distillée stérile.
  2. Pour l’analyse protéomique ou génomique, un à deux jours avant la dissection, enrober les plaques de 6 puits avec environ 2 mL de stérile 100 g/mL de poly-D-lysine (PDL). Ceci est nécessaire pour assurer l’adhérence cellulaire au puits. Envelopper les assiettes de film adhésif et conserver les assiettes pendant la nuit à 4 °C.
  3. Pour l’analyse morphologique et la microscopie, placez 12 mm2 couvercles en verre allemand prétraités (qui peuvent être nettoyés à l’aide d’un traitement à l’acide nitrique tel que décrit précédemment18 ou acheté) dans chacun des puits d’une plaque de 24 puits.
    1. Enrober les couvercles de 0,3 mL de 100 g/mL stérile de poly-D-lysine (PDL). Conserver les assiettes toute la nuit à 4 °C.
  4. Le jour de la dissection, avant le début de la dissection, retirer la solution de poly-D-lysine des puits et rincer les puits cinq fois avec de l’eau distillée stérile, suivie d’une fois avec un faible taux de glucose DMEM.
  5. Pendant la digestion enzymatique des ganglions (environ une heure avant le placage des cellules), l’asphyxie du DMEM des plaques et le remplacer par 0,3 mL de supports témoins. Conserver les plaques à 35,5 °C sous 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée.

3. Configuration de dissection

  1. Préparation de 200 mL de supports pour la dissection (appelée média de dissection)
    1. Ajouter 8 mL de 20 mg/mL d’albumine de sérum bovin sans acide gras (FAF-BSA) dans le faible taux de glucose DMEM (avec 1 mg/mL de glucose) et 2 mL de 100x de pénicilline-streptomycine à 193 mL de L-15 moyen stérile de Leibovitz (ou tout milieu tamponné d’air)
  2. Dans le capot, mettre en place les éléments suivants pour la dissection: quatre tubes coniques stériles de 50 mL avec environ 20 ml de support de dissection dans chaque tube, quatre plats stériles de 35 mm avec 1,5 mL de milieux de dissection, un tube conique stérile de 50 mL avec 20 ml de support de dissection pour la centrifugation, un tube conique stérile de 15 mL pour centrifuger les ganglions , et un tube stérile de 10 ml pour la collecte des cellules dissociées.
  3. Utilisez un stérilisateur de perles sèches pour stériliser une paire de forceps fins (no.4 ou no 5 forceps) pendant au moins une minute.

4. Isolement des ganglions cervicals supérieurs des chiots embryonnaires de rat

  1. Enlèvement des embryons E21 du rat enceinte
    REMARQUE : Le retrait de la corne utérine peut être effectué à l’extérieur du capot si la zone environnante est complètement stérilisée.
    1. Euthanasier le rat enceinte à l’aide de l’inhalation de CO2. Cisaillez la fourrure de la région abdominale et essuyez la peau dans la région avec 70% d’alcool pour la stériliser.
    2. À l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux et de forceps stériles, couper à travers la peau, puis la couche musculaire pour exposer les cornes utérines contenant les embryons. Retirez les cornes utérines avec les embryons à l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux et de forceps, en prenant soin de ne pas endommager les intestins dans le processus.
    3. Transférer les cornes utérines avec les embryons dans une boîte de Pétri stérile de 150 mm2 et les transférer dans le capot.
    4. À l’aide d’un nouvel ensemble de forceps et de ciseaux, retirer les embryons de la corne utérine et séparer les embryons des membranes amniotiques et du placenta.
    5. Pour euthanasier les embryons, couper la moelle épinière des embryons le long de la ligne médiane sous le bras droit. Ceci réduira également le saignement de l’artère carotide pendant l’enlèvement de la SCG.
    6. Transférez ces embryons dans les tubes coniques préparés de 50 mL contenant des milieus de dissection. Assurez-vous que les embryons sont immergés dans les médias. Chaque tube peut contenir jusqu’à 3 embryons.
  2. Isolement du ganglion cervical supérieur de l’embryon
    1. Transférer un chiot du milieu de dissection sur un plat stérile de 150 mm2 Petri à moitié rempli de substrat solide (cire de paraffine ou polymère de silicone), avec sa surface dorsale sur le substrat. À l’aide de trois aiguilles stériles de 23 G, épingler le chiot dans le plat avec une aiguille sous chaque bras et une troisième aiguille par la bouche pour hyperextenser soigneusement le cou.
    2. Couper à travers la peau dans la région du cou à l’aide de forceps fins stériles (n° 4 ou no 5 forceps) pour exposer les glandes salivaires en dessous. Retirez ces glandes à l’aide de forceps fins.
    3. Localisez les muscles sternocleidomastoid et omohyoïdes près de la clavicule et de la trachée, respectivement. Coupez d’abord les muscles sternocleidomastoid transversaux, puis coupez soigneusement le muscle omohyoïde mince à l’aide de forceps fins. Une fois que ces muscles sont enlevés, la bifurcation dans l’artère carotide à l’extrémité antérieure sera visible de chaque côté de la trachée, avec le SCG situé sous cette fourche dans l’artère carotide.
    4. À l’aide de forceps fermés, soulevez doucement l’artère carotide pour visualiser le SCG. À l’aide d’un forceps de chaque côté de la SCG, retirer la carotide et la transférer dans les plats stériles préparés de 35 mm2. Ce tissu contiendra très probablement le SCG avec l’artère carotide, le nerf vague avec les ganglions nodose ainsi que d’autres segments de muscle ou de graisse dans la région.
    5. Répétez le processus de dissection de l’autre côté. Retirez les SPG de tous les embryons avant de poursuivre les étapes de dissection restantes décrites ci-dessous. Distribuer les tissus isolés entre deux des plats de 35 mm2 pour faciliter le traitement des échantillons de tissus.
  3. Post-traitement de SCG
    1. Pour séparer le SCG du tissu disséqué, utilisez d’abord des forceps fins pour enlever tout tissu étranger, tel que la graisse ou le muscle, en prenant soin d’éviter la zone près de la bifurcation carotide.
    2. Une fois que ces tissus ont été enlevés, deux ganglions sont visibles. Le ganglion nodose est plus petit et circulaire, tandis que le SCG est en forme d’amande. Tirez doucement sur le nerf vague pour séparer le nerf vague et les ganglions nodoses de la carotide, puis séparer le SCG de l’artère carotide.
    3. Utilisez des forceps fins pour enlever la capsule qui entoure le SCG. Transférer le SCG dans un nouveau plat de culture de 35 mm. Répétez le processus avec tous les échantillons de tissus disséqués.
    4. Enrober une pipette en verre stérilisée et colmatée en coton d’un milieu de dissection pour empêcher le tissu d’adhérer aux parois de la pipette. Utilisez la pipette pour remplacer le milieu de dissection par 2 mL stériles de collagène de type II (1 mg/mL)/dispase de type II (5 mg/mL) dans le HBSS sans calcium et magnésium, et incuber pendant 50 min à 37 °C pour aider à décomposer les tissus.
      REMARQUE : Le temps d’incubation peut devoir être optimisé avec différents lots de collagène/dispase et varie habituellement de 40 min à une heure.
    5. Pendant l’incubation, remplacez le DMEM des plaques et remplacez-le par 0,3 mL de support de commande. Conserver les plaques à 35,5 °C sous 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée.
    6. Après l’incubation, transférer les SCG dans la collagènease/dispase dans un tube conique stérile de 15 ml. Utilisez le support de dissection pour rincer les plaques et transférer la solution dans le tube. Ajouter suffisamment de supports de dissection pour porter le volume à environ 10 mL.
    7. Centrifugeuse à 200 x g (1000 - 1200 tr/min) pendant 5 minutes à température ambiante pour granuler l’échantillon. Remplacer le supernatant, en prenant soin de ne pas déloger le granulé. Resuspendez le granulé avec 10 mL de support de dissection. Répétez la centrifugation et jetez le supernatant.
    8. Remplacer par 1 à 2 mL de culture moyenne. À l’aide d’une pipette pasteur stérile à bout étroit et à pointe pliée (pré-enduite avec un milieu de culture), dissocient mécaniquement les amas en triturant doucement 5-6 fois. Laissez les plus gros amas se contenter d’environ une minute. Transférer la suspension de cellules supernatantes dans un nouveau tube de 10 mL.
    9. Répétez ce processus 3 fois de plus, avec une force croissante de trituration à chaque fois pour assurer une dissociation presque complète des SCG. Transférer le supernatant après chaque tour de trituration à un tube de 10 mL avec le supernatant de la première trituration.
    10. Ajoutez suffisamment de supports culturels pour porter le volume à 8 à 10 mL. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et quantifier la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
    11. Distribuer la suspension cellulaire dans les puits à la densité cellulaire appropriée pour les expériences. Mélanger la suspension cellulaire continuellement pendant le processus de placage pour assurer une distribution uniforme des cellules dans les puits.
      REMARQUE : Pour l’analyse morphologique, plaquez les cellules autour de 8 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits et pour les protocoles génomiques et protéomiques, plaquez les cellules jusqu’à 30 000 cellules/puits.
    12. Transférer les plaques dans un dessiccateur de verre avec de l’eau stérile au fond pour créer une chambre humidifiée. Injecter suffisamment de CO2 (environ 120 mL) pour obtenir un environnement de CO2 de 5 % dans le desiccateur, avant l’étanchéité. Maintenir les plaques à 35,5 °C. C’est ce qu’on appelle le jour 0 dans le protocole.
      REMARQUE : Ces plaques peuvent également être maintenues dans un incubateur régulier de CO2 de 5 %. La méthode décrite ci-dessus minimise les changements de température et de pH et aide également à prévenir la contamination croisée.

5. Entretien des neurones et traitements SCG cultivés

  1. Le jour 1 (24 heures après le placage), retirez soigneusement la moitié des supports de culture et remplacez-le par 2 μM Ara-C (cytosine β-D-arabinofuranoside, un agent anti-mitotique). Laissez le traitement sur les cellules pendant 48 h. Habituellement, cette durée du traitement est suffisante pour éliminer les cellules non neuronales dans la culture.
  2. Le jour 3, augmenter doucement la moitié du milieu et remplacer par un milieu de commande.
  3. Le jour 4, les cellules sont prêtes pour des traitements expérimentaux. Nourrissez les cultures tous les deux jours avec le milieu approprié, en remplaçant doucement la moitié du milieu dans le puits par un milieu frais.
  4. Les neurones SCG cultivés dans le milieu sans sérum ne s’étendent que les axones. Si les expériences nécessitent la présence de dendrites, traiter les cellules avec 10% de sérum de veau foetal, 75-100 μg/mL d’extrait de matrice de membrane de sous-sol ou 50 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse-7. La croissance dendritique est observée dans les 48 heures suivant le traitement avec l’arborescence dendritique élaborée observée dans la semaine suivant le traitement.

6. Immunostaining cultivés neurones SCG

  1. Remplacer progressivement le milieu de culture cellulaire dans le puits par 4% de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate de 0,1 M, le pH 7.2 dans un capot de fumée.
    1. Retirez la moitié du support de culture dans le puits et remplacez-le doucement par 4% de paraformaldéhyde. Ensuite, répétez le processus au moins deux fois de plus, en supprimant les deux tiers des médias dans le puits à chaque fois et en remplaçant par 4% de paraformaldéhyde. À la fin de ce processus, la couleur des médias dans le puits aurait dû changer de rose à incolore.
    2. Une fois que tout le milieu a été remplacé par 4% de paraformaldéhyde, incuber les puits pendant 15 à 20 minutes à température ambiante.
  2. Avec un processus similaire tel que décrit ci-dessus, remplacer progressivement la solution de paraformaldéhyde de 4 % par une solution saline tamponnée par phosphate (PBS), pH 7.2. Laisser reposer 5 minutes. Rincer les puits deux fois de plus pendant 5 minutes chacun avec PBS.
    1. Une fois que le paraformaldéhyde de 4 % est enlevé, déplacez les plaques sur le banc pour un traitement ultérieur. Cette étape est un bon point d’arrêt où les plaques peuvent être stockées à 4 °C pendant la nuit.
  3. Retirez tous les PBS. Ajouter un volume suffisant de 0,1% Triton X-100 dans PBS pour couvrir les cellules. Laissez-le sur les cultures pendant 5 minutes pour perméabiliser les neurones. Le moment de cette étape est essentiel pour assurer une bonne coloration tout en maintenant l’intégrité des cellules.
  4. Retirez soigneusement la solution Triton X-100 et rincez les puits trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec pbs. Supprimez la solution PBS.
  5. Ajouter suffisamment de 5 % de BSA dans pbs pour couvrir les cellules et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour réduire la liaison d’anticorps non spécifique.
  6. Retirez la solution de blocage et remplacez-la par un anticorps monoclonal de souris contre la protéine MAP-2 diluée dans 5% de BSA dans PBS. Laisser l’anticorps primaire sur les cellules pendant la nuit à 4 °C.
  7. Retirez et enregistrez l’anticorps principal pour les réutiliser. L’anticorps primaire peut être réutilisé au moins deux fois sans perte d’intensité de détection.
  8. Rincer trois fois avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules. Laisser pbs sur les cellules pendant 10 minutes par rinçage.
  9. Retirez la solution PBS et remplacez-la par un anticorps secondaire IgG anti-souris à 1:1000 dans 5% BSA dans PBS. Incuber pendant 2 heures dans l’obscurité à température ambiante.
  10. Retirez l’anticorps secondaire et remplacez-le par PBS. Rincer les puits trois fois avec pbs pendant 10 minutes par rinçage. Rincer les puits une fois avec de l’eau pour enlever les sels.
  11. Placez les couvercles sur des lames de verre contenant une goutte de supportant aqueux qui convient aux échantillons étiquetés fluorescents. Conservez les diapositives à 4 °C, dans un dossier de diapositives jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être imagerie.

7. Préparation de l’échantillon pour l’analyse du protéome à l’aide d’une chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse

  1. Lysy des neurones cultivés
    1. Retirez doucement tous les supports de culture dans les puits. Remplacez-le par du calcium froid et stérile et de la solution saline tamponnée au phosphate sans magnésium (PBS), pH 7.4. Retirer rapidement et remplacer par PBS et laisser reposer pendant 5 min. Cette étape est faite pour éliminer toutes les protéines présentes dans les milieuux de culture.
    2. Retirez soigneusement tous les PBS de tous les puits pour un traitement particulier. Répétez le processus une fois de plus. Maintenir les plaques au-dessus de la glace lors du lysage des cellules afin de minimiser les dommages neuronaux et la protéolyse.
    3. Ajouter 100 à 150 μL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM, pH 7,5 (NH4HCO3)à l’un des puits et gratter les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules stériles. À l’aide d’une micropipette, transférer le liquide et répéter le processus de grattage avec tous les puits pour un traitement particulier. Examiner les puits au microscope après le grattage pour vous assurer que la plupart des cellules ont été enlevées.
      1. Avec le faible nombre de neurones, utiliser un volume limité pour lyser les cellules pour assurer une concentration assez élevée pour l’analyse protéomique.
    4. Congeler la solution à -80 °C pendant la nuit pour aider à la lyse cellulaire. Les lysates peuvent être stockés à ce stade jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traités ultérieurement.
    5. Une fois décongelés, gicler les échantillons à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 26 G ou 28 G pour lyser mécaniquement les cellules.
    6. Sonifier les échantillons dans un bain d’eau sonicante deux fois pendant 10 minutes. Ajouter de la glace dans le bain d’eau pour éviter la surchauffe et la dénaturation des protéines. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 4 °C à 12 000 x g.
    7. Mesurer la concentration de protéines. Les concentrations typiques de protéines varient de 0,4 à 1 μg/μL
  2. Préparation de l’échantillon et digestion de trypsine pour l’analyse du protéome
    1. Transférer un maximum de 60 μL du lysate ou 50 μg de protéines dans un tube de 1,5 mL sans DNase, RNase et protéase. Si le volume du lysate est inférieur à 60 μL, ajouter suffisamment de bicarbonate d’ammonium de 50 m MM pour compenser le volume.
    2. Ajouter 25 μL de surfactant et vortex de 0,2 % d’acide labile. Incuber le tube dans un chauffe-bloc à 80 °C pendant 15 minutes. Centrifuge du tube à 12 000 x g pour 30 s.
    3. Ajouter 2,5 μL de 100 mM de dithiothreitol et de vortex. Cela rend la protéine plus accessible pour l’alkylation et la digestion. Incuber le tube à 60 °C dans un chauffe-bloc pendant 30 minutes. Refroidir à température ambiante et centrifugeuse.
    4. Ajouter 2,5 μL d’iodoacetamide de 300 mM à l’échantillon et au vortex. Cette étape aide à alkylate les cysteines et les empêche de réformer les liens disulfure. Incuber les tubes à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
    5. Ajouter la trypsie de type spectrométrie de masse (0,5 μg/μL) au tube à une trypsin : rapport protéique de 1:10. Digèrez les échantillons à 37 °C pendant la nuit.
    6. Ajouter 10 μL d’acide trifluoroacétique à 5 % (TFA) et vortex. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 90 minutes. Cette étape est nécessaire pour hydrolyser le surfactant acide labile pour prévenir les interférences pendant la spectrométrie de masse.
    7. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g à 4 °C pendant 30 minutes et transférer le supernatant vers un flacon en verre transparent certifié chromatographie avec des bouchons de septum en téflon/silicone prééclairé. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C avant l’analyse de spectrométrie de masse.
    8. Soumettez les flacons d’échantillon à la chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse haute définition.

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Résultats

Isoler et maintenir les cultures neuronales des neurones embryonnaires scg
Les cellules dissociées du RAT embryonnaire SCG ont été plaquées dans une plaque enduite de poly-D-lysine ou coverslip et maintenues dans les milieux de culture sans sérum contenant le facteur de croissance de b-nerf. Les cellules dissociées contenant un mélange de neurones et de cellules gliales regardent circulaire sur le placage (Figure 1A). Dans les 24 heures suivant le placage, les neurones pr...

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Discussion

Cet article décrit les protocoles pour cultiver des neurones sympathiques des ganglions cervical supérieurs des chiots embryonnaires de rat. Les avantages de l’utilisation de ce système modèle sont qu’il est possible d’obtenir une population homogène de neurones fournissant une réponse similaire aux facteurs de croissance, et puisque les exigences de facteur de croissance pour ces neurones a été bien caractérisé, il est possible de cultiver ces neurones in vitro dans des médias définis, dans des conditions sans sérum

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Ces travaux ont été appuyés par le Fonds de développement de la faculté et la subvention du Programme de recherche d’été du Saint Mary’s College of California. Les auteurs tiennent également à remercier la Dre Pamela Lein de l’Université de Californie à Davis et le Dr Anthony Iavarone de l’UC Berkeley Mass spectrometry facility pour leurs conseils lors de l’élaboration de ces protocoles. Les auteurs tiennent également à remercier Haley Nelson au Bureau des communications collégiales du Saint Mary’s College of California pour son aide à la production vidéo et au montage vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Bicarbonate d’ammoniumSigma-Aldrich9830
BMP-7R& D Systems354-BP
Sérum bovin AluminSigma-Aldrich5470
Grattoir cellulaireCorningCLS-3010
CollagénaseWorthington Biochimique4176
Corning Costar ou Nunc Fond plat Plaques de culture cellulaireFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- &beta ;- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
Solution saline tamponnée au D-phosphate (sans calcium ni magnésium)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Eau distilléeThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Faible teneur en glucose + glutamine, + pyruvate de sodiumThermo Fisher Scientific11885
Sans Acides Gras BSACalbiochem12660920 mg/mL Stock en DMEM à faible teneur en glucose
Pince fine Dumont n°4 et n°5Ted Pella Inc5621, 5622
Pinces et ciseaux pour la dissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Recouvrement en verre - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Chèvre-Anti-Souris IgG Alexa 488 conjuguéThermo Fisher ScientificA32723
Mélange de nutriments Ham F-12Thermo Fisher Scientific11765
Soluble de sel équilibré de Hank (sans calcium ni magnésium)Thermo Fisher Scientific14185
Insuline-Sélénium-Transferrine (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacétamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Supports de montage pour lamelles en verreThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Anticorps anti-MAP2 de la souris (SMI-52)BioLegendSMI 52
Facteur de croissance nerveuseEnvigo Bioproducts (anciennement Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 &mu ; g/mL dans 0,2 % de Prionex dans du DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Pénicilline-Streptomycine (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore529600Solution à 10 %, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 Spectrométrie de masse haute définitionWaters Corporation
Acide trifluoroacétique - Séquençage gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinePromega ou NEBV511A, P8101S100 &mu ; g ou 5 X 20 mg
Waters Flacons de récupération totaleWaters Corporation186000385c

Références

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