Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

Résumé

Ici, des méthodes sont présentées pour comprendre les effets anticancéreux du surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS). Les lignées cellulaires du cancer colorectal montrent des décès cellulaires lorsqu’elles sont traitées avec LCFS dans des cultures 3D. Le processus de génération de sphéroïdes peut être optimisé en fonction de l’échafaudage et les méthodes d’analyse présentées sont utiles pour évaluer les voies de signalisation impliquées.

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole pour évaluer les décès de cellules cancéreuses dans les sphéroïdes tridimensionnels (3D) de types multicellulaires de cellules cancéreuses en utilisant des surnageants issus de la culture cellulaire Lactobacillus fermentum, considérés comme des cultures probiotiques. L’utilisation de cultures 3D pour tester le surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS) est une meilleure option que les tests dans des monocouches 2D, d’autant plus que L. fermentum peut produire des effets anticancéreux dans l’intestin. L. fermentum surnageant a été identifié pour posséder des effets anti-prolifératifs accrus contre plusieurs cellules du cancer colorectal (CCR) dans des conditions de culture 3D. Fait intéressant, ces effets étaient fortement liés au modèle de culture, démontrant la capacité notable de L. fermentum à induire la mort des cellules cancéreuses. Des sphéroïdes stables ont été générés à partir de divers CRC (cellules cancéreuses colorectales) en utilisant le protocole présenté ci-dessous. Ce protocole de génération de sphéroïde 3D est un gain de temps et rentable. Ce système a été développé pour étudier facilement les effets anticancéreux du LCFS dans plusieurs types de sphéroïdes du CCR. Comme prévu, les sphéroïdes CRC traités avec LCFS ont fortement induit la mort cellulaire au cours de l’expérience et ont exprimé des marqueurs moléculaires d’apoptose spécifiques tels qu’analysés par qRT-PCR, Western blotting et ANALYSE FACS. Par conséquent, cette méthode est précieuse pour explorer la viabilité cellulaire et évaluer l’efficacité des médicaments anticancéreux.

Introduction

Les probiotiques sont les micro-organismes les plus avantageux dans l’intestin qui améliorent l’homéostasie immunitaire et le métabolisme énergétique de l’hôte¹. Les probiotiques de Lactobacillus et Bifidobacterium sont les plus avancés de son genre trouvés dans l’intestin^2,3. Des recherches antérieures ont montré que Lactobacillus a des effets inhibiteurs et antiprolifératifs sur plusieurs cancers, y compris le cancer colorectal⁴. De plus, les probiotiques préviennent les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et la....

Protocole

1. Cultures cellulaires bactériennes et préparation du surnageant sans cellules lactobacillus (LCFS)

REMARQUE : Les étapes 1.2 à 1.9 sont effectuées dans une chambre anaérobie.

1. Préparer une plaque de gélose MRS et un bouillon contenant de la L-cystéine et stériliser par autoclavage.
2. Pré-incuber la plaque de gélose MRS dans une chambre anaérobie_H2 maintenue à 37 °C avec 20 ppm d’oxygène.
3. Décongeler le stock bactérien de Lactobacillus et inoculer la plaque de gélose avec la culture bactérienne (Figure 1A (i)).
4. Incuber les bacté....

Résultats

Nous décrivons le protocole d’obtention de sphéroïdes à partir de diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Une supplémentation en méthylcellulose était nécessaire pour générer des sphéroïdes. Nous présentons également une méthode de préparation de LCFS et présentons un modèle pour étudier la corrélation entre les probiotiques et le cancer colorectal. Les protocoles de formation de sphéroïdes et de préparation LCFS sont illustrés schématiquement à la Figure 1A,B. Co.......

Discussion

Le microenvironnement tissulaire, y compris les cellules voisines et la matrice extracellulaire (ECM), est fondamental pour la génération de tissus et crucial dans le contrôle de la croissance cellulaire et du développement tissulaire¹³. Cependant, les cultures 2D présentent plusieurs inconvénients, tels que la perturbation des interactions cellulaires, ainsi que des altérations de la morphologie cellulaire, des environnements extracellulaires et de l’approche de la division^14.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % Mini-PROTEAN TGX Gels de protéines préfabriquées, 15 puits, 15 & micro ; l	Biorad	4561036	paquet de 10
films adhésifs optiques Applied Biosystems MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 couvre
10x tampon de transfert	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (polypropylène), transparent, non stérile, 500 tubes/paquet, 10 paquets/caisse	Corning	SCT-200-C	500 tubes/paquet, 10 paquets/caisse
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Bouillon	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Test de viabilité cellulaire	Promega	G9681	100&mu ; l/dosage en plaques de 96 puits
Cocktail complet d’inhibiteur de protéase	Sigma-Aldrich	11697498001	flacon de 20 comprimés
Corning Saline tamponnée au phosphate, 1X sans calcium ni magnésium, PH 7,4 ± ; 0,1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P Membranes de transfert PVDF	fisher Scientific	IPVH00010	rouleau de 26,5 cm x 3,75 m ; Taille des pores : 0,45 um
Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre cellulaire Snap Cap		Corning 352235	25/paquet, 500/caisse
Sérum de veau fœtal, certifié, origine américaine	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
Kit de synthèse d’ADNc iScript, 25 x 20 µ ; l rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 & micro ; L rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Collection coréenne pour cultures de type	KCTC 3112
Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Méthylcellulose (3500-5600mPa· ; s, 2 % dans l’eau à 20° ; C)	TCI	M0185
Plaque de réaction optique rapide à 96 puits MicroAmp de 500 g avec code-barres, 0,1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plaques
Unité de filtre à seringue Millex-GS, 0,22 & micro ; m, esters de cellulose mixtes, 33 mm, oxyde d’éthylène stérilisé	Millipore	SLGS033SB	250
PE Kit de détection de l’apoptose de l’annexine V avec 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
d’iodure de propidium	Introgen	P1304MP	100 mg
Tampon de lyse et d’extraction RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Nom des matériaux/équipements/logiciels	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments/Description
anti - p-I&kappa ; B&alpha ; (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 & micro ; g/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µ ; g/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µ ; l ascite
anti-&beta ;-actine (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µ ; g/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Lecteur de microplaques multimode	BioT	S1LFA
Incubateur CO2	Thermo fisher	HERAcell 150i
Tube conique 15 ml	SPL	50015
Tube conique 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Accessoire ultra-bas Plaque à puits multiples	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Fixation ultra-faible Plaque	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar Réservoirs de réactifs de 50 ml, 5/sac, stérile	Costar	4870
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	Thermofisher	C10228
Countess II FL Compteur de cellules automatisé	invitrogen
EnSpire Lecteur multimode	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Pipette multicanaux, 8 canaux	Eppendorf	3122000051
logiciel	FlowJo TreeStar		Ashland, OR, États-Unis
Chèvre Anti-souris IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1,5 mL
Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japon
Agitateur incubé	Compagnon de laboratoire	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,Fujifilm			Tokyo, Japon
Densité optique (OD)Spectrophotomètres UV/Vis lambda	Perkin Elmer		Waltham, MA, États-Unis
Microscope à contraste de phase	Olympus		Tokyo, Japon
Tube à microcentrifuger SPL 1,5 mL	SPL	60015
Réservoirs multicanaux, 12 canaux, PS, Stérile	SPL	21012
Système de PCR en temps réel StepOnePlus	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA,
États-Unis Processeurs de liquides à ultrasons Vibra-Cell	SONICS-Vibra	Cell VC 505	500 Watt
Chambre anaérobie en vinyle COY	LAB PRODUCTS