Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

6.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/61289

⸱

6 août 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les inhibiteurs de l’hétone acétyltransférases (HATs, également connu sous le nom d’acétyltransférases de lysine), tels que CBP/p300, sont des traitements potentiels pour traiter le cancer. Cependant, des méthodes rigoureuses pour valider ces inhibiteurs sont nécessaires. Trois méthodes in vitro pour la validation incluent des essais de HAT avec des acétyltransférases recombinantes, l’immunoblotting pour l’acétylation d’histone dans la culture cellulaire, et ChIP-qPCR.

Résumé

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les histones et d’autres protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et l’expression des gènes. KaTs, tels que CBP/p300, font l’objet d’une étude intense en tant que cibles thérapeutiques en raison de leur rôle critique dans la tumeur de divers cancers. Le développement de nouveaux inhibiteurs de petites molécules ciblant la fonction d’acétyltransférase histone (HAT) des KAT est difficile et nécessite des essais robustes qui peuvent valider la spécificité et la puissance des inhibiteurs potentiels.

Cet article décrit un pipeline de trois méthodes qui fournissent une validation in vitro rigoureuse pour les nouveaux inhibiteurs de la HAT (HATi). Ces méthodes incluent un test hat de tube d’essai, l’essai d’inhibition d’hyperacétylation de chromatine (ChHAI), et le PCR immunoprécipitation-quantitative de chromatine (ChIP-qPCR). Dans l’essai hat, les HAT recombinants sont incubés avec des histones dans une réaction de tube à essai, permettant l’acétylation des résidus spécifiques de lysine sur les queues d’histone. Cette réaction peut être bloquée par un HATi et les niveaux relatifs d’acétylation d’histone spécifique au site peuvent être mesurés par immunoblotting. Les inhibiteurs identifiés dans l’essai de la HAT doivent être confirmés dans l’environnement cellulaire.

L’essai de ChHAI utilise l’immunoblotting pour dépister le nouveau HATi qui atténue l’hyperacétylation robuste des histones induite par un inhibiteur de la déacétylase d’histone (HDACi). L’ajout d’un HDACi est utile parce que les niveaux basaux de l’acétylation histone peut être difficile à détecter par immunoblotting.

Les tests HAT et ChHAI mesurent les changements globaux dans l’acétylation de l’histone, mais ne fournissent pas d’informations concernant l’acétylation dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, ChIP-qPCR est utilisé pour étudier les effets de HATi sur les niveaux d’acétylation de l’histone aux éléments de régulation des gènes. Ceci est accompli par l’immunoprécipitation sélective des complexes histone-ADN et l’analyse de l’ADN purifié par qPCR. Ensemble, ces trois essais permettent la validation minutieuse de la spécificité, de la puissance et du mécanisme d’action du nouveau HATi.

Introduction

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les protéines histone et non-histone1,2,3,4. Des recherches récentes révèlent que les KAT et leur fonction d’acétyltransférase peuvent favoriser la croissance de tumeur solide4,5,6,7,8,9. Par exemple, les protéines liant le CREB (CBP)/p300 sont deux KAT paralogues qui régulent de nombreuses voies de signalisation dans le cancer2,3. CBP/p300 ont une fonction d’acétyltransférase d’histone bien caractérisée (HAT) et catalysent Histone 3 Lysine 27 acétylation (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marqueur important pour les exhausteurs actifs, les régions de promoteur et la transcription active de gène12,13,14. CBP/p300 servent de co-activateurs critiques pour les voies de signalisation pro-croissance dans les tumeurs solides en activant la transcription des oncogènes par acétylation des histones et d’autres facteurs de transcription4,9,15,16,17,18. En raison de leur rôle dans la progression de tumeur, CBP/p300 et d’autres KATs sont à l’étude pour le développement de nouveaux inhibiteurs qui bloquent leur fonction oncogène4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 et GNE-049 représentent deux tentatives réussies de développer des inhibiteurs puissants et spécifiques pour CBP/p3004,9. D’autres inhibiteurs font actuellement l’objet d’une enquête pour le CBP/p300 et d’autres TCA.

La qualité des inhibiteurs kat précédemment décrits (KATi) est remise en question, avec de nombreux inhibiteurs montrant les effets cibles et une mauvaise caractérisation21. Par conséquent, une caractérisation rigoureuse et la validation de nouveaux médicaments candidats sont essentielles au développement de sondes chimiques de haute qualité. Voici trois protocoles qui forment un pipeline pour le dépistage et la validation rigoureuse de la puissance et de la spécificité du nouveau KATi, avec un accent spécifique sur l’inhibition de la fonction HAT (HATi) des KAT. CBP/p300 et leurs inhibiteurs sont utilisés comme exemples, mais ces protocoles peuvent être adaptés pour d’autres KAT qui ont une fonction HAT7.

Le premier protocole est un test in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) qui utilise le p300 recombinant purifié et les histones dans une réaction contrôlée de tube à essai. Ce test est simple à effectuer, est rentable, peut être utilisé pour filtrer les composés dans un réglage à faible débit, et ne nécessite pas de matières radioactives. Dans ce protocole, le p300 recombinant catalyse l’acétylation de lysine sur les queues d’histone pendant une brève période d’incubation et les niveaux d’acétylation d’histone sont mesurés à l’aide de procédures standard d’immunoblotting. La réaction enzymatique peut être effectuée en présence ou en l’absence d’inhibiteurs CBP/p300 pour dépister les composés qui réduisent l’acétylation de l’histone. En outre, l’essai hat peut être utilisé pour vérifier si les nouveaux composés sont sélectifs pour le CBP/p300 en évaluant leur activité par rapport à d’autres KAT purifiés, tels que le PCAF. L’essai HAT est un excellent point de départ pour étudier de nouveaux inhibiteurs en raison de sa simplicité, faible coût, et la capacité de déterminer la puissance / sélectivité d’un inhibiteur. En effet, ce protocole est souvent utilisé dans la littérature comme un écran in vitro5,10. Cependant, les inhibiteurs identifiés dans l’essai hat ne sont pas toujours efficaces dans la culture cellulaire parce qu’une réaction de tube à essai est beaucoup plus simple qu’un système de cellules vivantes. Par conséquent, il est essentiel de caractériser davantage les inhibiteurs dans les expériences de culture cellulaire22,23.

Le deuxième protocole dans le pipeline est le test d’inhibition de l’hyperacétylation de la chrométine (ChHAI). Ce test à base de cellules utilise des inhibiteurs de la dacetylase histone (HDACi) comme un outil pour hyperacétiller les histones dans la chromatine avant co-incubation avec un HATi24. L’acétylation d’histone basal peut être faible dans la culture cellulaire, ce qui rend difficile de sonder pour par l’immunoblotting sans l’ajout d’un HDACi pour augmenter l’acétylation. Le but de l’essai de ChHAI est d’identifier le roman HATi qui peut atténuer l’augmentation de l’acétylation d’histone provoquée par l’inhibition de HDAC. Les avantages de cet essai incluent son faible coût, la facilité relative à effectuer, et l’utilisation des cellules dans la culture, qui fournit plus de pertinence physiologique que le test de hat de tube à essai. Semblable à l’essai HAT, ce protocole utilise l’immunoblotting standard pour la collecte de données.

Les tests HAT et ChHAI fournissent des données sur la puissance de nouveaux composés pour inhiber l’acétylation de l’histone globale, mais ne fournissent pas de perspicacité dans la façon dont ces composés affectent les modifications dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, le protocole final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) est une expérience de culture cellulaire qui étudie les interactions ADN-protéines à des régions spécifiques du génome. Dans le protocole ChIP, la chromatine est croisée pour préserver les interactions ADN-protéines. La chromatine est ensuite extraite des cellules et le complexe ADN-protéine subit une immunoprécipitation sélective pour la protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’un anticorps spécifique au H3K27ac). L’ADN est ensuite purifié et analysé à l’aide de qPCR. Par exemple, ChIP-qPCR peut être utilisé pour déterminer si un roman HATi downregulates histone acétylation à des oncogènes individuels, tels que Cyclin D125. Bien que ChIP-qPCR soit une technique courante utilisée sur le terrain, il peut être difficile d’optimiser4,,10,26. Ce protocole fournit des conseils pour éviter les pièges potentiels qui peuvent se produire lors de l’exécution de la procédure ChIP-qPCR et comprend des contrôles de qualité qui doivent être effectués sur les données.

Lorsqu’ils sont utilisés ensemble, ces trois protocoles permettent la caractérisation rigoureuse et la validation du nouveau HATi. En outre, ces méthodes offrent de nombreux avantages parce qu’elles sont faciles à exécuter, relativement bon marché et fournissent des données sur l’acétylation mondiale ainsi que régionale d’histone.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Essai in vitro de HAT

  1. Préparation tampon
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon.
    1. Préparer le tampon d’essai 5x et le sulfate de Dodecyl de sodium (SDS) et conserver à -20 °C. Aliquot SDS en 1 mL aliquots.
    2. Préparer 10x gel SDS tampon de fonctionnement et 10x TBST et stocker à température ambiante.
    3. Préparer le tampon de transfert 1x et conserver à 4 °C.
      ATTENTION : Vérifiez la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques utilisés dans ce protocole. La SDS, la TNT et le bleu bromophénol sont toxiques et ne doivent pas être ingérés, inhalés ou exposés à la peau ou aux yeux. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour les procédures de manipulation appropriées. S’il vous plaît utiliser un capot de fumée chimique pour la manipulation de produits chimiques dangereux.
  2. Réaction de HAT
    REMARQUE : L’acide anacardique est un inhibiteur p300connu 3 et est utilisé comme exemple pour démontrer comment l’essai de la HAT peut identifier de nouveaux inhibiteurs du p300. Voir Protocole supplémentaire ( Schéma1) pour un schéma de l’étape 1.2.1.
    1. Préparer la réaction enzymatique suivante dans un tube PCR de 0,2 mL : 2 μL de tampon d’analyse 5x, 1 μL de p300 purifié (0,19 μg/μL), 1 μL d’acide anacardique (HATi) ou de contrôle DMSO dilué dans un tampon d’essai 1x et 2 μL de ddH autoclaved2O. Préacuber ce mélange pendant 10 min à température ambiante. Ajouter ensuite 3 μL de 100 μM d’acétyl-coA et 1 μL de H3.1 purifié (0,2 μg/μL) à la réaction.
    2. Incuber le mélange de réaction complet à 30 °C pendant 1 h dans un cycleur thermique PCR.
    3. Ajouter 2-mercaptoéthanol à un rapport de 1:10 à la mémoire tampon échantillon SDS 6x.
    4. Retirer les échantillons du cycleur thermique PCR et ajouter 2 μL de SDS 6x (avec 2-mercaptoéthanol ajouté) au mélange de réaction.
      ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé à l’intérieur d’un capot de fumée chimique. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour une bonne manipulation.
    5. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 min sur un bloc de chaleur et refroidir sur la glace. Stockez les échantillons à -20 ou -80 °C ou effectuez l’électrophorèse de gel et l’immunoblotting comme indiqué ci-dessous.
  3. Électrophorèse de gel et immunoblotting
    REMARQUE : Si vous n’êtes pas familier avec l’électrophorèse du gel et l’immunoblotting, consultez cette procédure standard27 pour plus de détails sur la façon d’effectuer les étapes 1.3.1-1.3.17. Des informations supplémentaires peuvent être trouvées ici28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 μL d’échantillons (de l’étape 1.2.5.) dans les puits d’un gel polyacrylamide gradient de 4-20%. Pipette 5 μL d’échelle protéique dans l’un des puits comme référence de poids moléculaire. Exécutez le gel à 120 V pendant 90 min à l’aide d’un réservoir de gel.
    2. Transférer le gel dans une membrane de difluorure polyvinylidene (PVDF) à 100 V pendant 70 min à l’aide d’un réservoir de transfert.
    3. Retirez la membrane de l’appareil de transfert et placez-la dans un contenant en plastique. Bloquez la membrane en ajoutant 1x TBST (contenant 5 % de lait) au récipient et secouez doucement pendant 1 h à température ambiante.
    4. Retirez le TBST 1x de l’étape 1.3.3. Incuber la membrane pendant la nuit avec des anticorps acétyls spécifiques au site sélectionnés (p. ex., H3K18ac ou H3K27ac anticorps primaires à une dilution de 1:5 000 dans 1x TBST contenant 5% de lait) à 4 °C avec secousse douce.
    5. Retirez la solution d’anticorps primaire. Laver la membrane 2x avec 1x TBST (pas de lait) à température ambiante avec une secousse douce pendant 15 min chaque lavage.
    6. Diluer l’anticorps secondaire à 1:20 000 dans 1x TBST (contenant 5% de lait) et incuber la membrane pendant 1 h à température ambiante avec des secousses douces.
    7. Retirez la solution d’anticorps secondaires. Laver la membrane 2x avec 1x TBST (pas de lait) à température ambiante avec une secousse douce pendant 15 min chaque lavage.
    8. Égoutter le 1x TBST de la membrane. Mélanger la solution de peroxyde de substrat HRP et la solution de luminol de substrat de HRP dans un rapport de 1:1 (1 mL de chacun) et de la pipette 2 mL de la solution combinée à la surface de la membrane.
    9. Incuber la solution avec la membrane pendant 5 min à température ambiante.
    10. Égoutter l’excès de substrat chemiluminescent de la membrane sur une serviette en papier et placer la membrane dans une pellicule plastique à l’intérieur d’un porte-cassette à rayons X.
    11. Déplacez-vous dans une pièce sombre dédiée au traitement des films à rayons X. Exposer la membrane à un film à rayons X en plaçant le film sur la membrane et en fermant la cassette pendant 30 s.
      REMARQUE : L’heure du contact entre le film et la membrane doit être déterminée expérimentalement. Les signaux forts auront besoin d’expositions courtes (secondes) et les signaux plus faibles peuvent avoir besoin d’expositions plus longues.
    12. Retirez le film à rayons X de la cassette et traitez le film en le faisant passer par un processeur de film à rayons X. Consultez les manuels du fabricant pour obtenir des instructions spécifiques sur la façon de traiter le film à rayons X.
    13. Retirez la membrane de la pellicule plastique et lavez-la avec2O ddH pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
    14. Incuber la membrane avec 0,2 M De NaOH pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
    15. Laver la membrane avec ddH2O pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
    16. Bloquez la membrane en ajoutant 1x TBST (contenant 5 % de lait) au récipient et secouez doucement pendant 1 h à température ambiante.
    17. Ajouter la prochaine dilution primaire des anticorps (p. ex., sonder le H3K27ac si le premier anticorps utilisé était H3K18ac) et secouer pendant la nuit à 4 °C. Répétez les étapes 1.3.4-1.3.17 jusqu’à ce que toutes les sondes d’anticorps soient terminées.

2. Essai de ChHAI

  1. Traitements médicamenteux in vitro et analyse des histones acétylées
    NOTE: A-485 est un puissant et bien caractérisé p300 HATi2,4 . Cet inhibiteur sera utilisé dans les essais restants en raison de son efficacité et de sa spécificité dans la culture cellulaire. MS-275 (Entinostat)24 est un HDACi qui augmente nettement les niveaux d’acétylation d’histone et est utilisé pour faciliter la détection des sondes d’acétylation avec l’immunoblotting standard. Voir Protocole supplémentaire (Schéma 2) pour un schéma des dilutions de médicaments utilisés à l’étape 2.1.
    1. Semer 100 000 cellules MCF-7 dans une plaque de 12 puits et permettre aux cellules de croître jusqu’à 80-90% de confluence dans 1 mL de culture cellulaire moyenne. Marquer les puits pour la conception expérimentale suivante : puits 1 : contrôle DMSO (point de référence); puits 2: A-485 (3 μM); puits 3: A-485 (10 μM); bien 4: MS-275 (3 μM); puits 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bien 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      REMARQUE : Pour cultiver des cellules MCF-7, utilisez un support DMEM complet et permettez aux cellules de croître à 37 °C avec 5 % de CO2. Voir le tableau 1 pour la recette complète de DMEM.
    2. À 24 h après l’ensemencement, pipette 4 ml de support complet DMEM à un tube conique stérile de 15 mL. Pipette 2 μL de MS-275 (6 mM en DMSO) à 4 mL de milieu pour une concentration finale de 3 μM MS-275.
    3. Pipette 2 μL de DMSO à 4 ml de milieu dans un tube conique stérile séparé de 15 mL.
      ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour la bonne gestion de DMSO. Certains types de gants ne sont pas évalués pour la manipulation de DMSO.
    4. Aspirate le milieu de culture cellulaire des puits 4-6 et pipette 1 mL de 3 μM MS-275 en milieu (étape 2.1.2) à chaque puits. Jeter le MS-275 dilué inutilisé.
    5. Apirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-3 et pipette 1 mL de DMSO dilué (étape 2.1.3) à chaque puits. Jeter DMSO dilué inutilisé.
    6. Remettre les cellules à l’incubateur et incuber pendant 4 h pour permettre l’accumulation d’histones acétylés dans les cellules exposées au MS-275 (puits 4-6).
      NOTE: MS-275 est un HDACi et causera l’hyperacétylation histone24. Cette pré-incubation de 4 h est nécessaire pour permettre au MS-275 d’induire une hyperacétération avant l’ajout de L’A-485, ce qui réduit l’acétylation histone2,4.
    7. Après 4 h d’incubation avec MS-275, préparer les dilutions suivantes dans des tubes stériles séparés de 1,5 mL par pipetage : 1,0 μL de DMSO à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL A-485 (6 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL d’A-485 (20 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL d’A-485 (6 mM) et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de supportS DMEM; 0,5 μL d’A-485 (20 mM) et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de support DMEM.
    8. Apirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-6 et pipette 1 mL de dilution 1 à puits 1, dilution 2 à bien 2, dilution 3 à puits 3, dilution 4 à bien 4, dilution 5 à puits 5, et dilution 6 à puits 6.
      REMARQUE : Une règle générale consiste à équilibrer la teneur en DMSO (solvant) entre les groupes expérimentaux et à ne pas dépasser la teneur en DMSO de 0,1 % dans la culture cellulaire afin d’éviter la toxicité cellulaire et les changements de prolifération.
    9. Retournez les cellules à l’incubateur et à la culture pendant 20 h.
    10. Après 20 h, aspirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-6.
    11. Laver les cellules en canalisant 1 mL de PBS aux puits 1-6. L’aspirate du PBS.
    12. Ajouter 100 μL de tampon de lyse passive de 1x (voir tableau 1) aux puits 1-6. Stockez la plaque de culture cellulaire (avec des échantillons dans un tampon de lyse passive) à −80 °C pendant la nuit pour le gel-dégel et la lyse des cellules.
      ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques avant de fabriquer des tampons. CdTA peut causer de graves lésions oculaires et une irritation.
    13. Décongeler les échantillons à température ambiante en secouant doucement pendant 10 min. Transférer les échantillons dans des tubes séparés de 1,5 mL et les placer immédiatement sur la glace.
    14. Mesurer la concentration de protéines de chaque échantillon. La concentration de protéines peut être déterminée à l’aide de plusieurs protocoles bien établis34.
    15. Équilibrer la concentration de protéines entre les échantillons 1-6 (dans un volume égal) à l’aide d’un tampon de lyse passive 1x pour diluer, au besoin.
    16. Ajouter 2-mercaptoéthanol à un rapport de 1:10 à 6x tampon échantillon SDS.
    17. Ajouter un tampon d’échantillon SDS 6x avec 2 mercaptoéthanol aux échantillons 1-6 à une concentration finale de tampon échantillon SDS 1x.
    18. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 min sur un bloc de chaleur et refroidir sur la glace. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C ou -80 °C jusqu’à l’étape 2.1.19.
    19. Pipette un volume contenant 30 μg de protéines pour les échantillons 1-6 aux puits dans un gel polyacrylamide gradient de 4-20%. Effectuer la procédure d’immunoblotting selon le protocole décrit dans le protocole 1.

3. ChIP-qPCR

NOTE : Le protocole ci-dessous est décrit pour les inhibiteurs de p300 comme exemple.

  1. Préparation tampon
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon. Les étapes générales du protocole ChIP (p. ex. recettes tampons, temps de lavage et temps de centrifugation) ci-dessous sont modifiées et adaptées des recommandations du fabricant d’un kit disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)et de la documentation35,36.
    1. Préparer le tampon de dilution chIP, tampon de gonflement des noyaux, tampon de lavage à faible sel, tampon de lavage de sel élevé, tampon de lavage de LiCl et tampon TE. Conserver à 4 °C.
    2. Préparer le tampon de lyse SDS, le tampon de glycine 10x et le tampon d’ellion chIP. Conserver à température ambiante.
      ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques avant de fabriquer des tampons pour assurer une bonne manipulation.
  2. Traitement médicamenteux
    REMARQUE : Voir Protocole supplémentaire (Schéma 3) pour un schéma des dilutions de médicaments utilisés à l’étape 3.2.
    1. Seed MCF-7 cells in two 15 cm culture lacks and grow cells to 90% confluence in 12 mL of the complete DMEM medium. Marquez les plats pour la conception expérimentale suivante : Plat 1 : contrôle DMSO (point de référence); Plat 2: A-485 (3 μM).
      REMARQUE : Pour cultiver des cellules MCF-7, utilisez des supports DMEM complets et développez à 37 °C avec 5 % de CO2. Voir le tableau 1 pour la recette complète de DMEM.
    2. Dans un tube conique stérile de 15 mL, pipette 12 ml de support DMEM et pipette 6 μL de DMSO. Bien mélanger.
    3. Dans un tube conique stérile séparé de 15 mL, la pipette 12 ml de support DMEM et la pipette 6 μL d’A-485 (6 mM en DMSO) pour obtenir une concentration finale de 3 μM A-485. Bien mélanger.
    4. Apirate les médias des plats 1 et 2.
    5. Ajouter les 12 mL de DMSO dilué dans DMEM (étape 3.2.2.) au plat 1.
    6. Ajouter les 12 mL de 3 μM A-485 dans DMEM (étape 3.2.3.) au plat 2.
    7. Remettre les plats de culture cellulaire à l’incubateur et incuber pendant 24 h.
  3. Fixation cellulaire
    1. Pipette 330 μL (27,5 μL par mL) de 37 % de formaldéhyde au milieu complet et agiter doucement la plaque pour mélanger.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour les procédures de manipulation appropriées.
    2. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    3. Pipette 2 mL de glycine 10x à l’assiette et tourbillonner pour mélanger.
    4. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
    5. Après l’incubation, déposer les plats sur la glace et décongeler un aliquot de cocktail inhibiteur de la protéase.
    6. Préparer les solutions suivantes pour les échantillons DMSO et A-485 à l’aide des tampons préparés à l’étape 3.1.
      1. 2 mL de PBS avec une dilution de 1:1,000 du cocktail inhibiteur de la protéase
      2. 1 mL de tampon de gonflement des noyaux avec une dilution de 1:1,000 du cocktail inhibiteur de la protéase
      3. 0,5 mL de tampon de lyse SDS avec une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de la protéase
    7. Apirate les médias de la vaisselle de culture cellulaire et laver les cellules deux fois avec 15 mL de PBS froid.
    8. Pipette 2 mL de PBS avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.1) aux plats de culture cellulaire. Soulevez les cellules dans la solution à l’aide d’un grattoir cellulaire.
    9. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge. Recueillir les cellules restantes avec pbs supplémentaires si nécessaire.
    10. Tubes de rotation à 800 x g à 4 °C pendant 5 min pour granuler les cellules.
    11. Remplacer le supernatant et la pipette 1 mL de tampon de gonflement des noyaux avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.2) jusqu’au granulé. Resuspendez le granulé et incuber sur la glace pendant 10 min.
    12. Centrifugez les tubes à 2 700 x g à 4 °C pendant 5 min à granulés.
    13. Remplacer le supernatant et la pipette 0,5 mL du tampon de lyse SDS avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.3) jusqu’au granulé. Resuspendez le granulé et incuber sur la glace pendant 10 min.
    14. Conserver les échantillons de chromatine à -80 °C jusqu’à l’étape 3.4.1 ou passer immédiatement à l’étape 3.4.
  4. Sonication de l’ADN
    1. Transférer 130 μL de chromatine de l’échantillon DMSO (étape 3.3.14) à deux tubes de sonication de l’ADN à l’aide d’une pipette (130 μL chacun).
    2. Transférer 130 μL de chromatine de l’échantillon A-485 (étape 3.3.14) à deux tubes de sonication de l’ADN à l’aide d’une pipette (130 μL chacun).
    3. Sonicate l’ADN à environ 150-200 fragments de paire de base en utilisant les paramètres sonicator suivants: Peak Incident Power (W) de 175, Facteur de service de 10%, 200 cycles par rafale et 430 s temps de traitement.
      REMARQUE : Les paramètres de sonication peuvent différer entre les modèles et les paramètres peuvent devoir être ajustés pour obtenir la taille appropriée des fragments pour différentes lignées cellulaires.
    4. Gardez les échantillons sur la glace après la sonication.
    5. Transférer la chromatine sonique à un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et d’une centrifugeuse à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min à des débris de granulés.
    6. Pipette le supernatant (contient de la chromatine sonique) à un nouveau tube et jeter les débris. La chromatine sonique peut être stockée à -80 °C.
  5. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
    REMARQUE : Voir Protocole supplémentaire (Schéma 3) pour un schéma des groupes ip à l’étape 3.5.
    1. Mesurer la teneur en protéines de la chromatine sonique pour les échantillons DMSO et A-485 de l’étape 3.4.6. La teneur en protéines peut être mesurée à l’aide de protocoles bien établis34.
      REMARQUE : Par souci de simplicité, ce protocole suppose que la teneur en protéines est égale et que 100 μL de chromatine sonique seront utilisés. Dans le cas contraire, la teneur en protéines devra être équilibrée entre tous les échantillons dans un volume égal.
    2. Pipette 100 μL de chromatine sonique DMSO à deux tubes de 1,5 mL (100 μL chacun). Pipette 400 μL de tampon de dilution ChIP (contenant une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de la protéase) à chaque tube pour porter le volume total à 500 μL. Retirez 5 μL de la solution d’un des tubes et rangez-le à -20 °C sous forme d’entrée DMSO.
    3. Pipette 100 μL de chromatine sonique A-485 à deux tubes de 1,5 mL (100 μL chacun). Pipette 400 μL de tampon de dilution chIP (contenant une dilution de 1:1000 du cocktail inhibiteur de la protéase) à chaque tube pour porter le volume total à 500 μL. Retirer 5 μL de la solution d’un des tubes et conserver à -20 °C sous forme d’entrée A-485.
    4. À l’aide d’une pipette, ajouter l’anticorps d’immunoprécipitation (IP) (p. ex. contrôle igg non spécifique ou anticorps spécifique h3K27ac) aux tubes correspondants pour les échantillons DMSO et A-485 : IP #1 chromatine DMSO avec anticorps IgG (5-10 μg); IP #2 chromatine DMSO avec anticorps H3K27ac (5-10 μg); IP #3 la chromatine A-485 avec anticorps IgG (5-10 μg); IP #4 la chromatine A-485 avec l’anticorps H3K27ac (5-10 μg).
    5. Ajouter 20 μL de protéineS A perles magnétiques à chaque tube. Assurez-vous que les perles sont bien resuspendées.
    6. Faire pivoter les échantillons pendant la nuit à 4 °C.
    7. Pelleter la protéine Perles magnétiques À l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le supernatant. Ne pas déranger les perles.
    8. Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage à faible teneur en sel et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
    9. Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage à haute teneur en sel et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
    10. Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage LiCl et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
    11. Laver les perles avec 500 μL à 1 mL de tampon TE et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un rapide spin vers le bas. Conservez les perles dans la mémoire tampon TE jusqu’à l’étape 3.5.14.
    12. Retirer les échantillons d’entrée (des étapes 3.5.2 et 3.5.3) du congélateur et les conserver sur la glace.
    13. Décongeler un aliquot de Proteinase K.
    14. Pelleter les perles à l’aide d’un séparateur magnétique et retirer le tampon TE des perles (à partir de l’étape 3.5.11).
    15. Ajoutez 100 tampon d’olution chIP de μL + 1 μL de Proteinase K à chaque échantillon, y compris les échantillons d’entrée. Incuber des échantillons avec des secousses à 62 °C pendant 2 h à l’aide d’un thermocycleur.
    16. Après 2 h, chauffer les échantillons jusqu’à 95 °C pendant 10 min à l’aide d’un thermocycleur.
    17. Refroidir les échantillons à température ambiante.
    18. Perles magnétiques de granulés utilisant un séparateur magnétique et supernatant de transfert (contient l’ADN d’intérêt) à un nouveau tube de 1.5 mL.
    19. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR standard.
    20. L’ADN purifié peut être stocké à -20 °C et peut être utilisé comme modèles dans les protocoles qPCR standard. Suivez les protocoles du fabricant pour l’exécution de qPCR.
  6. Analyse des données ChIP-qPCR
    REMARQUE : Deux méthodes courantes pour analyser les résultats de ChIP-qPCR sont l’enrichissement de pli sur l’anticorps IgG et la méthode d’entrée de 1%. Un excellent modèle pour les deux méthodes d’analyse est fourni par une source commerciale peut être utilisé pour calculer rapidement l’enrichissement de pliage pour chaque anticorps IP / cible d’intérêt37.
    1. Pour calculer l’enrichissement du pliage et % d’entrée, copiez et collez les valeurs ΔCt à partir des données qPCR obtenues pour chaque anticorps (IgG non spécifique, anticorps IP H3K27ac et 1% d’entrée) dans la région correspondante du modèle d’analyse et le cumul de l’apport en enrichissement et rendement sera automatiquement rempli.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L’essai in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) peut être employé pour sonder pour des composés qui inhibent l’activité de p300 HAT vers un substrat d’histone. La figure 1A fournit un schéma expérimental pour l’essai HAT. L’acide anacardique, un HATi3,38connu, a été utilisé dans ce test dans une gamme de concentration de 12,5 à 100 μM. À 100 μM, l’acide anacardique descend par la p300 catalysé l’acétylation de l’histone à Histon...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Lysine acétyltransférases (KATs) acetylate plusieurs résidus de lysine sur les queues d’histone et les facteurs de transcription pour réguler la transcriptiongénique 2,3. Les travaux des deux dernières décennies ont révélé que les KAT, tels que CBP/p300, PCAF et GCN5, interagissent avec les facteurs de transcription oncogène et aident à stimuler la croissance tumorale dans plusieurs types de tumeurs solides4,5<...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts ou de divulgations à faire.

Remerciements

Ce travail a été appuyé par des subventions de James et Esther King Biomedical Research Program (6JK03 et 20K07), et Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 et 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, et UF Health Cancer Center. De plus, nous tenons à remercier le Dr Zachary Osking et le Dr Andrea Lin pour leur soutien au cours du processus de publication.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 1,5 mlFisher Scientific05-408-129Pour toutes les méthodes
Plat de 10 cmSarstedt AG & Co.83.3902Pour la culture cellulaire de cellules MCF-7
10 embouts ulFisher Scientific02-707-454Pour toutes les méthodes
1000 embouts ulCorning4846Pour toutes les méthodes
10X TamponPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
d’exécution 10Xpour les méthodes 1 et 2. Voir le tableau 1 pour la recette.
10X TBSTpour les méthodes 1 et 2. Voir le tableau 1 pour la recette.
Plaque à 12 puitsCorning3513Pour la méthode 2
Plat de 15 cmSarstedt AG & Co.83.3903Pour la méthode 3
Tube conique de 15 mlSanta Cruz Biotechnologysc-200249Pour les méthodes 2 et 3 1X
TBST avec 5 % de lait et 0,02 % d’azoture dePour les méthodes 1 et 2. Peut être utilisé pour diluer les anticorps primaires qui seront utilisés plus d’une fois. Permet le stockage à court terme des dilutions d’anticorps primaires. Ne pas utiliser pour la dilution secondaire des anticorps. ATTENTION : L’azoture de sodium est toxique.
1X TBST avec du laitPour les méthodes 1 et 2. Utilisé pour bloquer la membrane PVDF et pour les diltions d’anticorps. Voir le tableau 1 pour la recette.
200 embouts ulCorning4844Pour toutes les méthodes
2-mercaptoéthanolSigma-AldrichM3148pour la préparation du tampon d’échantillon SDS
Gel de polyacrylamide 4-20Thermo Fisher : InvitrogenXP04205BOXPour les méthodes 1 et 2
TamponPour la méthode 1. Voir le tableau 1 pour la recette.
de lyse passifPour la méthode 2. Voir le tableau 1 pour la recette.
6X Dodécylsulfate de sodium (FDS)Pour les méthodes 1 et 2. Voir le tableau 1 pour la recette.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor pour utilisation dans les méthodes 2 et 3. Dissous dans le DMSO.
Anticorps acétyl-CBP (K1535)/p300 (K1499)Technologie de signalisation cellulaire4771Pour la méthode 1
Acétyl-CoASigma-AldrichA2056pour utilisation dans la méthode 1
Anticorps anti-acétyl-histone H3 (Lys 27) (H3K27ac)Technologie de signalisation cellulaireCST 8173Antoibodies pour H3K27ac pour immunoblots et ChIP
Anticorps acétyl-histone H3 (Lys18) (H3K18ac)Technologie de signalisation cellulaireCST 9675antoibodies pour H3K18ac pour immunoblots et ChIP
alpha tubulineanticorps Millipore SigmaT5168pour la méthode 2. Dilué 1:20 000
Acide anacardiqueCayman Chemical13144Pour la méthode 1
Anticorps secondaires liés à l’IgG HRP anti-sourisTechnologie de signalisation cellulaire7076Pour les méthodes 1 et 2. Diluer 1:10 000
anticorps secondaire IgG anti-lapinJackson ImmunoResearch711-035-152Pour les méthodes 1 et 2. Dilué 1:10 000 à 1:20 000
Film d’autoradiographieMIDSCIBX810Pour les méthodes 1 et 2
Plateforme tournante de danseuse orientaleStovall Life Science Incorporatednon disponiblePour les méthodes 1 et 2
Sérum de veau bovin (BCS)HyCloneSH30072.03Milieu de culture cellulaire
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA2153pour la préparation du tampon
Bleu de bromophénolSigma-AldrichB0126pour la préparation du tampon d’échantillon SDS
CDTASpectrum Chemical125572-95-4Pour la préparation du tampon
racleur de celluleMillipore SigmaCLS3010Pour la méthode 3
dilution ChIPPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
d’élution ChIPpour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
DMEM complet pour les cellulespour les méthodes 2 et 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
Covaris 130 & micro ; l microTUBECovaris520045Tube de sonication à utiliser avec Covaris S220 dans la méthode 3
Covaris S220 Détecteur d’ADN focaliséCovarisS220pour utilisation dans la méthode 3
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich41639pour la dilution de médicament et le traitement de contrôle du véhicule
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815pour tampon d’échantillon SDS préparation
DMEMCorning10-013-CVmilieux de culture cellulaire
EDTAFisher ScientificBP120-1pour la préparation de tampons
Exemple de réservoir de transfert et appareil de transfertBio-rad1704070Pour les méthodes 1 et 2
EZ-Magna ChIP A/G Kit d’immunoprécipitation de la chromatineMillipore Sigma17-10086Pour la méthode 3
FK228 ( Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7Inhibiteur de HDAC à utiliser dans la méthode 2
Solution de formaldéhydeSigma-AldrichF8775pour la fixation cellulaire
glycérolFisher ScientificBP229-1Pour la préparation du tampon
glycineSigma-AldrichG7126pour la préparation du tampon
HEPESSigma-Aldrich54457pour Préparation du tampon
TamponPour la méthode 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021pour la préparation du tampon
Substrat HRP chimiluminescent ImmobilonMillipore SigmaWBKLS0500Pour les méthodes 1 et 2
KClFisher ScientificBP366-500pour la préparation du tampon
LiClSigma-AldrichL9650Pour la préparation du tampon
TamponPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
de lavage à faible teneur en selPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
Séparateur magnétiquePromegaZ5341Pour une utilisation dans la méthode 3
MéthanolSigma-Aldrich494437Pour la préparation de tampons
Mini réservoir de gelInvitrogenA25977Pour les méthodes 1 et 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2Inhibiteur de HDAC pour une utilisation dans la méthode 2. Dissous dans le DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5pour la préparation du tampon
NaOHFisher ScientificS318-100pour la préparation du tampon dans les méthodes 1 et 2
IgG normalesde lapin Bethyl LaboratoriesP120-101Anticorps de lapin de contrôle pour utilisation dans la méthode 3
TamponPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
Kit de nettoyage PCRQiagen28104Pour une utilisation dans la méthode 3
Pénicilline/Streptomycine 100XCorning30-002-CIMilieu de culture cellulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CVPour les méthodes 2 et 3
PIPESSigma-Aldrich80635pour la préparation tampon
lait en poudreNestlé CarnationPour Méthodes 1 et 2
Power Pac 200 pour le transfert par transfert Western BlotBio-radPour les méthodes 1 et 2
Power Pac 3000 pour l’utilisation du gel SDSBio-radPour les méthodes 1 et 2
Échelle de protéines précoloréesThermo Fisher26616Pour les méthodes 1 et 2
Cocktail inhibiteur de protéaseSigma-AldrichPI8340pour utilisation dans la méthode 3
Perles magnétiques de protéine ANew England BioLabsS1425SPour une utilisation dans la méthode 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SPour une utilisation dans la méthode 3
Contrôleur thermique programmable PTC-100MJ Research Inc.PTC-100Pour la méthode 1
Membrane de transfert PVDFMillipore SigmaIEVH00005Pour les méthodes 1 et 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Spour utilisation dans la méthode 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100pour utilisation dans la méthode 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9Inhibiteur de HDAC pour utilisation dans la méthode 2
de lyse SDSPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
Azoture de sodiumFisher Scientific26628-22-8Pour les méthodes 1 et 2. ATTENTION : L’azoture de sodium est toxique. Voir la FDS pour une manipulation appropriée.
Bicarbonate de sodiumFisher ScientificS233-500pour la préparation d’un tampon
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750pour la préparation d’un tampon
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma-Aldrich71725pour la préparation d’un tampon d’échantillon SDS
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN : 949030Pour les méthodes 1 et 2
centrifugeuseEppendorf5417RPour toutes les méthodes
TE bufferPour la méthode 3. Voir le tableau 1 pour la recette.
TamponPour les méthodes 1 et 2. Voir le tableau 1 pour la recette.
Trichostatine ACayman Chemical58880-19-6Inhibiteur de HDAC pour utilisation dans la méthode 2
TrisFisher ScientificBP152-5pour la préparation du tampon
Triton X-100Sigma-AldrichT8787pour la préparation du tampon
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5pour la préparation du tampon dans les méthodes 1 et 2
Processeurde film à rayons XKonica Minolta Medical & Graphique, Inc.SRX-101Apour les méthodes 1 et 2
de glycine Tampon sodium 5 %  % de dosage 5X 5X Tampon Tampon deTampon MCF-7 à haute teneur en sel de lavage LiCl Tampon de gonflement des noyaux Tampon de transfert

Références

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Essai HATEssai ChHAIChIP qPCRAc tylation des histonesImmunotransfertProt inase KBilles magn tiquesAnalyse par qPCRR gulation pig n tique
Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.