Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Summary

Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.

Abstract

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.

Introduction

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents^1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le l....

Protocol

1. Fabrication d’appareils

1. Définir la région à imprimer sur papier à l’aide d’un logicield’imprimante( Table des matériaux ).
   REMARQUE : La conception comporte 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones d’échantillonnage circulaires se rétrécissent progressivement de 5 mm à 2 mm (figure 1A).
2. Imprimer de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulosique ( Tableau des matériaux) àl’aide d’uneimprimante de cire commerciale (Tableau des matériaux) ( Figure1B).
3. Placer le pap....

Results

Le temps d’opération doit être optimisé pour atteindre le rendement maximal de récupération des microvesicles enrichis et des exosomes. Le temps insuffisant ne permet pas une migration suffisante des microvesicules et des exosomes, ce qui diminue l’enrichissement, alors que le temps excessif détériore la focalisation spatiale et disperse donc les microvesicules et les exosomes. Ainsi, grâce à l’étape d’optimisation du temps, le facteur maximum de préconcentration des microvesicules et des exosomes et l’emplacement final .......

Discussion

Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.

Le temps et la température d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Électrodes Ag/AgCl	A-M Systems, Inc.	531500	0,15" de diamètre
(BSA), conjugué Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A13101	BSA conjugué avec Alexa Fluor 594 (Ex/Em : 590/617 nm)
Tampon carbonate-bicarbonate	Sigma-Aldrich	C3041-50CAP	Tampon carbonaté
Logiciel CorelDraw (Coral Co., Canada)	Corel Corporation		pour définir l’impression à la cire région
ColorQube 8870	Xerox Corporation		Imprimante à cire
Papier de chromatographie grade 1	Whatman	3001-861	Papier cellulose, dimension : 20 * 20 cm
Étalons d’exosomes marqués par fluorescence	HansaBioMed Life Sciences, Ltd.	HBM-F-PEP-100	Exosome marqué avec FITC (Ex/Em : 490/520 nm)
Keithley 2410 source-mètre de courant/tension	Keithley Instruments, Inc.		Actuel&ndash ; système de mesure de source de tension
Solution de résine perfluorée de nafion	Sigma-Aldrich	31175-20-9	Membrane permsélective, 20 % en poids dans le mélange d’alcools aliphatiques inférieurs et d’eau ; contient 34 % d’eau
NanoSight LM10	Technologie		Machine d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
Saline tamponnée au phosphate (PBS, pH7,4)	Thermo Fisher Scientific	10010001