Le protocole décrit un essai rapide, à haut débit, fiable, peu coûteux et impartial pour déterminer efficacement la viabilité cellulaire. Cet essai est particulièrement utile lorsque les mitochondries des cellules ont été endommagées, ce qui interfère avec d’autres analyses. L’essai utilise le comptage automatisé des cellules tachées de deux teintures nucléaires – Hoechst 33342 et iodure de propidium.
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Article de méthode
Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La contribution des mitochondries à la transformation oncogène fait l’objet d’un grand intérêt et d’une étude active. Comme le domaine du métabolisme du cancer devient plus complexe, l’objectif de cibler les mitochondries à l’aide de divers composés qui infligent des dommages mitochondriaux (soi-disant mitocans) devient très populaire. Malheureusement, de nombreux tests de cytotoxicité existants, tels que ceux à base de sels de tétrazolium ou de résazurine nécessitent des enzymes mitochondriques fonctionnelles pour leur performance. Les dommages infligés par les composés qui ciblent les mitochondries compromettent souvent l’exactitude de ces analyses. Ici, nous décrivons un protocole modifié basé sur la coloration différentielle avec deux colorants fluorescents, dont l’un est perméant de cellules (Hoechst 33342) et l’autre n’est pas (iodure de propidium). La différence dans la coloration permet de discriminer les cellules vivantes et mortes. L’analyse est appropriée à la microscopie automatisée et à l’analyse d’image, qui augmente le débit et réduit le biais. Cela permet également d’utiliser l’essai de façon à haut débit à l’aide de plaques de 96 puits, ce qui en fait une option viable pour les efforts de découverte de médicaments, en particulier lorsque les médicaments en question ont un certain niveau de mitotoxicité. Fait important, les résultats obtenus par Hoechst/PI colorant l’analyse montrent une cohérence accrue, à la fois avec des résultats d’exclusion bleu trypan et entre les répliques biologiques lorsque l’essai est comparé à d’autres méthodes.
Introduction
La première étape pour identifier des traitements efficaces contre le cancer est la sélection d’un essai robuste et impartial de cytotoxicité qui peut être utilisé pour examiner l’effet du traitement. Un choix commun pour les expériences à faible débit est l’exclusion du colorant bleu trypan des cellules vivantes. Cette méthode est favorisée parce qu’elle permet une méthode relativement impartiale pour quantifier la survie cellulaire. trypan bleu diffuse passivement dans les cellules dont les membranes sont compromises, mais il est effectivement bloqué d’entrer dans les cellules saines1. Le quotient des cellules vivantes et des cellules totales....
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Protocole
1. Cytotoxicity Assay: Configuration
- Préparer des solutions de composés d’intérêt aux concentrations désirées dans les médias appropriés (sans sérum ou 1, 2,5 ou 5 % FBS RPMI-1640).
- Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé (p. ex., pour déterminer des doses efficaces), préparez des composés à une concentration finale de 2 x.
- Pour mesurer la cytotoxicité des combinaisons composées, préparer les composés à la concentration finale 4x.
- Préparez des commandes uniquement sur solvant en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Par exemple, si les composés d’essai sont dissous dans le DMSO et le méthanol, f....
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Résultats
Le protocole susmentionné a été développé à l’aide de cellules OCI-AML2, qui ont été prises comme une lignée de cellules myéloïdes myéloïdes aiguës représentatives. La LAM se caractérise par une prolifération anormale de cellules hématopoïétiques indifférenciées et non fonctionnelles dans la moelleosseuse 26. Malgré les développements récents de la thérapie ciblée contre la LAM, la norme de soins est demeurée inchangée pendant plusieurs décennies et consiste en une thérapie par induction (générale.......
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Discussion
Bien que le protocole d’analyse de cytotoxicité Hoechst/PI soit robuste et nécessite relativement peu de temps pratique, plusieurs détails expérimentaux sont très importants pour assurer des résultats précis. Premièrement, il est essentiel de s’assurer que la concentration de DMSO reste inférieure à 0,5 % (v/v). Il est généralement admis que l’exposition à des doses même faibles de DMSO peut modifier considérablement la morphologie et l’attachement des cellules et retarder considérablement la progression du cycle
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
NVK, un chercheur du CPRIT en recherche sur le cancer, remercie le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) pour son généreux soutien, la subvention du CPRIT RR150044. Ces travaux ont également été soutenus par la Subvention de recherche C-1930 de la Fondation Welch et par les National Institutes of Health R35 GM129294 attribués à NVK. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| Plaques à 96 puits | Greiner Bio-One | 655090 | Plaques à fond plat noir ou transparent à 96 puits |
| Réactif de viabilité cellulaire HS bleu Alamar (100mL) ; | Thermo Fisher | A50101 | |
| Compteur de cellules automatisé Countess II | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | Solution de 20 mM ; concentration finale 1:1 000 |
| HyClone sérum fœtal bovin | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophénylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| Comprimés | PBS Thermo Fisher | BP2944100 | 1 comprimé + 200 mL d’eau stérile = 1x solution PBS |
| Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce Kit de dosage LDH | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Iodure de propidium | Thermo Fisher | 50-596-072 | Poudre sèche ; matière 1 mg/mL dans PBS ; concentration finale 5 & micro ; g/mL (cellules leucémiques), 1 & micro ; g/mL (PBMCs normaux) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium Avec L-glutamine et bicarbonate de sodium, liquide, filtré stérilement, adapté à la culture cellulaire | Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Bromure de tétrazolium de thiazolyle | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Coloration bleue de trypan (0,4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Lignées cellulaires | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML Lignée cellulaire |
| MOLM-13 | ATCC | AML | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | Lignée cellulaire ALL |
| OCI-AML2 | ATCC | AML |
Références
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
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Réimpressions et autorisations
