Le but de ce protocole est d’injecter de la globulaire conjuguée à la rhodamine dans les embryons de Drosophila et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine d’image suivant le stress thermique.
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Article de méthode
Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le but de ce protocole est de visualiser les tiges intranucléaires d’actine qui se réunissent dans les embryons vivants de Drosophila melanogaster suivant le stress thermique. Les tiges d’actine sont la marque d’une réponse de stress actin (ASR) conservée et inductible qui accompagne les pathologies humaines, y compris les maladies neurodégénératives. Précédemment, nous avons montré que l’ASR contribue aux échecs de morphogenèse et à la viabilité réduite des embryons en développement. Ce protocole permet d’étudier en continu les mécanismes sous-jacents à l’assemblage des tiges d’actine et à l’ASR dans un système modèle très sensible à l’imagerie, à la génétique et à la biochimie. Les embryons sont recueillis et montés sur un coverslip pour les préparer à l’injection. L’actine globulaire conjuguée à la rhodamine (G-actinRed)est diluée et chargée dans un microneedle. Une seule injection est effectuée au centre de chaque embryon. Après injection, les embryons sont incubés à haute température et les tiges d’actine intranucléaire sont ensuite visualisées par microscopie confoccale. La récupération de la fluorescence après des expériences de photobleaching (FRAP) peut être effectuée sur les tiges d’actine; et d’autres structures riches en actine dans le cytoplasme peuvent également être photographiées. Nous constatons que G-actinRed polymérise comme la G-actine endogène et n’interfère pas, à lui seul, avec le développement normal de l’embryon. Une limitation de ce protocole est que le soin doit être pris pendant l’injection pour éviter des dommages graves à l’embryon. Cependant, avec la pratique, l’injection de G-actinRouge dans les embryons de Drosophila est un moyen rapide et fiable de visualiser les tiges d’actine et peut facilement être utilisé avec des mouches de n’importe quel génotype ou avec l’introduction d’autres contraintes cellulaires, y compris l’hypoxie et le stress oxydatif.
Introduction
Ce protocole décrit comment injecter G-actinRed pour visualiser l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires dans les embryons stressés par la chaleur qui subissent une réponse inductible au stress actin (ASR)1. Nous avons développé ce protocole pour faciliter les études de l’ASR, qui dans les embryons conduit à une morphogenèse perturbée et une viabilité réduite, et dans les types de cellules humaines adultes est associée à des pathologies, y compris l’insuffisancerénale 2, myopathies musculaires3, et la maladie d’Alzheimer et de Huntington4,
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Protocole
1. Préparer des tasses de collecte d’embryons et des assiettes d’agar de jus de pomme
- Cinq jours avant l’expérience d’injection, construisez28 ou procurez-vous au moins deux petites tasses de collecte d’embryons. Faire des assiettes fraîches de 60 mm de jus de pomme agar à utiliser avec de petites tasses de collecte28. Conserver les assiettes dans des boîtes en plastique recouvertes de serviettes en papier humide à 4 °C.
REMARQUE : Les petites tasses de collecte d’embryons, peuplées de nombres de mouches décrites à l’étape 1.3, fourniront un nombre suffisant d’embryons par expérience, tout en veillant à ce q....
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Résultats
Un flux de travail schématique de la manipulation des embryons est représenté à la figure 1,et un calendrier pour une expérience typique est présenté dans le tableau 1. Une estimation pour un bon résultat expérimental est que pour chaque 10 embryons injectés, au moins la moitié des embryons vus seront au stade de développement correct, intact, et présentent un ASR robuste avec le stress thermique à 32 °C. Cet ASR sera démontré par l’assemblage de tiges d’actine intranucléai.......
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Discussion
L’importance de cette méthode est qu’elle utilise le protocole bien établi de microinjection chez les embryons de Drosophile 21 , 22,23,24,25,26,27pour permettre de nouvelles recherches concernant l’ASR et l’assemblage de tiges d’actine qui l’accompagnent. Un avantage majeur de l’in.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le travail de Liuliu Zheng et Zenghui Xue, qui ont contribué au pionnier de cette technique dans le laboratoire Sokac, ainsi que Hasan Seede qui a aidé à l’analyse. Les travaux de cette étude sont financés par une subvention des NIH (R01 GM115111).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Adénosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Composant du tampon G |
| Jus de pomme, Mott’s, 64 fl oz | Mott’s | 014800000344 Composant des assiettes de jus de pomme | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Composant des plaques de jus de pomme Eau de |
| Javel, germicide PureBright, hypochlorite de sodium à 6,0 % | KIK International | 059647210020 | Pour les embryons déchorionnés |
| Chlorure | de calcium Millipore-Sigma | C1016500G | Composant de G |
| tampon Passoire à cellules, 70 &mu ; m | Falcon | 352350 | Pour la collecte d’embryons déchorionnés Microscope |
| confocal, LSM 880 34 canaux avec Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | Pour l’imagerie de bâtonnets d’actine intranucléaires |
| Déshydratant Drierite | 24001 | Pour la dessiccation d’embryons | |
| Microscope de dissection, Stemi 508 Stéréoscope avec zoom 8:1 | Zeiss | 4350649000000 | Pour disposer les embryons sur un coin de gélose |
| Aiguille de dissection, 5 po | Fisher Scientific | 08965A | Pour disposer les embryons sur un coin |
| gélose Dithiothréitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Composant du tampon G |
| Ruban adhésif double face, Scotch Permanent, 0,5 po x 250 po | 3M | 021200010323 | Pour fabriquer de la colle embryonnaire |
| Cage de collecte d’embryons | Genessee Scientific | 59100 | Pour l’hébergement des mouches adultes et la collecte d’embryons |
| Pince à épiler à pointe fine, pince Dumont, Style 5 | Microscopie électronique Sciences | 72701D | Pour disposer les embryons sur un coin de gélose |
| Capillaires en verre, verre borosilliqué, minces 1 mm x 0,75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | Pour micro-aiguilles |
| Huile d’halocarbure 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | Pour l’hydratation des embryons |
| Incubateur à étage chauffé | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | Pour l’imagerie confocale |
| Essuie-glaces de laboratoire, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Essuie-glaces de laboratoire |
| Microscope optique, Invertoskop 40C Contraste de phase inversé microscope, remis à neuf | Zeiss | Discontinué | Microscope à injection |
| Méthyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Composant des plaques de jus de pomme |
| Micro-injecteur, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Micro-injecteur |
| Embouts de micro-chargeur, epU.I.P.S. 20 &mu ; L | Eppendorf | 5242956003 | Pour le chargement de micro-aiguilles |
| Micromanipulateur et platine d’injection avec cadrans x,y,z pour le réglage de l’aiguille | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Personnalisé | Pour effectuer des micro-injections |
| Extracteur de micropipettes, Modèle P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | Pour tirer des tubes capillaires pour fabriquer des micro-aiguilles |
| Verre de couverture de microscope 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | Pour le montage d’embryons |
| Lames de microscope, Lilac Colorfrost, Prénettoyées, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | Pour le montage d’embryons pour injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Composant de colle embryonnaire |
| Objectif, 10x | Zeiss | Discontinued | Objectif 10x pour microscope |
| à injectionObjectif, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | Objectif à eau 40x pour objectif confocal |
| , LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 pour immersion dans l’huile, l’eau, l’huile de silicone ou la glycérine (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm à D=0,17mm) | Zeiss | 4208529871000 | Objectif à immersion mixte 25x pour objectif confocal |
| Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Huile DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x Objectif à huile pour confocal |
| Pinceau, Robert Simmons Expression E85 Pointu Rond taille 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | Pour le transfert d’embryons |
| Essuie-tout, Mouchoirs en papier à pliage en C, | Kimberly-Clark | 884266344845 | Pour passoire à cellules buvard |
| , pipette Pasteur, 5 3/4 po | Fisher Scientific | 1367820A | Pour recouvrir les embryons d’huile |
| Boîte de Pétri, verre, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | Pour chambre d’incubation humide |
| Boîte de Pétri, plastique, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | Pour plaques de jus de pomme |
| Pipette, Eppendorf Référence 0.5-10 &mu ; L | Eppendorf | 2231000604 | Pour le chargement de la micro-aiguille |
| Pointe de pipette, xTIP4 250 &mu ; L | Biotix | 63300006 | Pour ajouter de la colle embryonnaire à la lamelle |
| Lame de rasoir | VWR | 55411050 | Pour couper le coin de gélose, le ruban, les pointes de pipette |
| Actine globulaire conjuguée à la rhodamine, plaquette humaine (non musculaire ; 4x10 &mu ; g) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Flacon à scintillation, 20 mL Verre borosillicate avec doublure en polyéthylène et bouchons d’urée | Fisher Scientific | 033377 | Pour la fabrication de colle d’embryon |
| Pot à vis, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | Pour la dessiccation des embryons |
| Micromètre de stade Microscopie | Sciences | 602104PG | Pour calibrer le volume de l’injection de G-actine |
| Saccharose | Millipore-Sigma | 840971KG | Composant des assiettes de jus de pomme |
| Base Trizma | Millipore-Sigma | T15031KG | Composant de la levure tampon G |
| , Levure Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz | Levure Lesaffre Corporation | 117929157002 | Composant de la pâte de levure |
Références
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytos....
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Réimpressions et autorisations
