Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra

3.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/61297

⸱

15 mai 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est d’injecter de la globulaire conjuguée à la rhodamine dans les embryons de Drosophila et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine d’image suivant le stress thermique.

Résumé

Le but de ce protocole est de visualiser les tiges intranucléaires d’actine qui se réunissent dans les embryons vivants de Drosophila melanogaster suivant le stress thermique. Les tiges d’actine sont la marque d’une réponse de stress actin (ASR) conservée et inductible qui accompagne les pathologies humaines, y compris les maladies neurodégénératives. Précédemment, nous avons montré que l’ASR contribue aux échecs de morphogenèse et à la viabilité réduite des embryons en développement. Ce protocole permet d’étudier en continu les mécanismes sous-jacents à l’assemblage des tiges d’actine et à l’ASR dans un système modèle très sensible à l’imagerie, à la génétique et à la biochimie. Les embryons sont recueillis et montés sur un coverslip pour les préparer à l’injection. L’actine globulaire conjuguée à la rhodamine (G-actinRed)est diluée et chargée dans un microneedle. Une seule injection est effectuée au centre de chaque embryon. Après injection, les embryons sont incubés à haute température et les tiges d’actine intranucléaire sont ensuite visualisées par microscopie confoccale. La récupération de la fluorescence après des expériences de photobleaching (FRAP) peut être effectuée sur les tiges d’actine; et d’autres structures riches en actine dans le cytoplasme peuvent également être photographiées. Nous constatons que G-actinRed polymérise comme la G-actine endogène et n’interfère pas, à lui seul, avec le développement normal de l’embryon. Une limitation de ce protocole est que le soin doit être pris pendant l’injection pour éviter des dommages graves à l’embryon. Cependant, avec la pratique, l’injection de G-actinRouge dans les embryons de Drosophila est un moyen rapide et fiable de visualiser les tiges d’actine et peut facilement être utilisé avec des mouches de n’importe quel génotype ou avec l’introduction d’autres contraintes cellulaires, y compris l’hypoxie et le stress oxydatif.

Introduction

Ce protocole décrit comment injecter G-actinRed pour visualiser l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires dans les embryons stressés par la chaleur qui subissent une réponse inductible au stress actin (ASR)1. Nous avons développé ce protocole pour faciliter les études de l’ASR, qui dans les embryons conduit à une morphogenèse perturbée et une viabilité réduite, et dans les types de cellules humaines adultes est associée à des pathologies, y compris l’insuffisancerénale 2, myopathies musculaires3, et la maladie d’Alzheimer et de Huntington4,5,6,7,8. Cet ASR est induit par de nombreuses contraintes cellulaires, y compris le chocthermique 9,10,11, stress oxydatif4,6, réduction de la synthèse ATP12, et anormal Huntingtin ou oligomérisation β-amyloïde4,5,6,7,9,13,14,15,16. Une caractéristique de l’ASR est l’assemblage de tiges d’actine aberrantes dans le cytoplasme ou le noyau des cellules affectées, qui est entraînée par l’hyperactivation induite par le stress d’une protéine actin interagissant, Cofilin1,5,6,10. Malheureusement, des lacunes importantes subsistent en matière de connaissances concernant le RSE. Par exemple, la fonction des tiges d’actine n’est pas connue. Nous ne comprenons pas pourquoi les tiges se forment dans le cytoplasme de certains types de cellules, mais le noyau d’autres. Il n’est pas clair non plus si l’ASR est protecteur ou inadapté pour les cellules ou les embryons soumis à un stress. Enfin, nous ne connaissons toujours pas les mécanismes détaillés sous-jacents à l’hyperactivation cofiline ou à l’assemblage de tiges d’actine. Ainsi, ce protocole fournit un essai rapide et polyvalent pour sonder l’ASR en visualisant la formation et la dynamique de tige d’actine dans le système expérimental hautement tractable de l’embryon vivant de mouche de fruit.

Le protocole de microinject G-actinRouge dans les embryons vivants de Drosophila a été initialement développé pour étudier la dynamique des structures normales d’actine cytoplasmique17 pendant des événements de construction de tissu. Dans ces études, nous avons constaté que l’injection rouge de G-actin n’a pas affecté défavorablement des processus développementaux tôt dans l’embryon, y compris la cytokinésie ou la gastrulation17,18. Nous avons ensuite modifié le protocole, en adaptant la manipulation de l’embryon etl’injection rouge de G-actine pour permettre l’imagerie des tiges d’actine dans les embryons stressés par la chaleur subissant l’ASR1. D’autres méthodes que l’injection de G-actin Red peuvent être utilisées pour visualiser l’actine chez les embryons. Ces méthodes reposent sur l’expression de protéines fluorescentes (FPs) étiquetées à l’actine ou à des domaines de protéines liant l’actine, telles que utrophine-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, et Moesin-GFP (examinédans 19). Toutefois, l’utilisation de ces sondes FP exige de la prudence parce qu’elles peuvent stabiliser ou perturber certaines structures d’actine, ne pas étiqueter également toutes les structures d’actine20, et dans le cas de l’actin-GFP, sont fortement surexprimées – problématiques pour l’analyse de l’assemblage de tiges qui dépend non seulement du stress, mais aussi de la concentration d’actinedépendante 1. Ainsi, G-actinRed est la sonde préférée pour les études de tige dans les embryons de mouche, et la grande taille de l’embryon permet son injection facile.

Le flux de travail de ce protocole est similaire à d’autres techniques bien établies de microinjection qui ont été utilisées pour injecter des protéines, des acides nucléiques, des médicaments et des indicateurs fluorescents dans les embryons de Drosophile 21,22,23,24,25,26,27. Cependant, à la suite de la microinjection de G-actinRouge ici, les embryons sont exposés à un léger stress thermique pour induire l’ASR et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine. Pour les laboratoires ayant accès aux mouches et une plate-forme d’injection, cette méthode devrait être facilement implémentable et adaptable pour des lignes d’étude spécifiques en ce qui concerne l’ASR, y compris son induction par différents stress ou modulation dans des milieux génétiques distincts.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparer des tasses de collecte d’embryons et des assiettes d’agar de jus de pomme

  1. Cinq jours avant l’expérience d’injection, construisez28 ou procurez-vous au moins deux petites tasses de collecte d’embryons. Faire des assiettes fraîches de 60 mm de jus de pomme agar à utiliser avec de petites tasses de collecte28. Conserver les assiettes dans des boîtes en plastique recouvertes de serviettes en papier humide à 4 °C.
    REMARQUE : Les petites tasses de collecte d’embryons, peuplées de nombres de mouches décrites à l’étape 1.3, fourniront un nombre suffisant d’embryons par expérience, tout en veillant à ce que la manipulation et l’injection d’embryons puissent être effectuées en assez peu de temps pour permettre l’imagerie des premiers stades du développement.
  2. Chauffer les assiettes de jus de pomme à 18 °C et ajouter une touche de pâte de levure au centre de l’assiette. La pâte de levure est une pâte simple de levure active et d’eau distillée.
  3. Pour promouvoir la ponte la plus généreuse, installez des tasses de collecte avec des mouches 2 jours avant l’expérience. Ajouter au moins 100 femelles et 50 mouches mâles aux tasses de collecte, et garnir d’une assiette préparée de jus de pomme (figure 1, étape 1). Les jours précédant l’expérience d’injection, changez les assiettes de jus de pomme au moins deux fois par jour, une fois le matin et une fois le soir.
    REMARQUE : Les meilleurs résultats d’injection et d’imagerie sont obtenus lorsque les tasses de collecte d’embryons sont conservées à 18 °C avec une lumière de 12 h sur/lumière hors cycle.

2. Préparer une solution de stock de travail de G-actinRed pour la microinjection

REMARQUE : Cette préparation ne fait que 2 μL d’un stock de travail de 5 mg/mL de G-actinRed,donc si les utilisateurs ne sont pas habitués à la technique de microinjection, il est avantageux de passer à l’étape 3 et de pratiquer les microinjections avec un tampon de pH neutre pour conserver le précieux stock de travail. Le stock de 10 μg de G-actinRed du vendeur peut être stocké dans son emballage d’origine dans un bocal de 16 oz vissé avec ~500 g de desiccant à 4 °C pendant un temps jusqu’à 6 mois.

  1. Préparez une solution de stock g-buffer à l’avance : 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Filtrer et conserver à température ambiante.
  2. Le jour des injections, préparez 1 mL d’une solution de travail g-tampon dans un tube de microcentrifugeuse à bouchons cassés frais sur la glace à l’aide du stock tampon G de l’étape 2.1, complété par ce qui suit aux concentrations finales indiquées : 1 mM dithiothreitol (DTT) et 0,2 mM ATP, pH 8.0.
    REMARQUE : Le volume de 1 mL de solution de travail G-buffer est supérieur à ce qui est nécessaire pour une expérience, mais simplifie la préparation. L’excès peut être jeté après l’expérience ou les utilisateurs peuvent réduire en fonction de leur préférence.
    1. Garder lebouillon rouge de 10 μg de G-actine sur la glace, ajouter d’abord 1 μL d’eau filtrée distillée au sommet de la gouttelette rose de G-actinRed à l’intérieur du tube.
    2. Ensuite, ajoutez 1 μL de la solution de travail g-tampon fraîchement préparée à partir de l’étape 2.2. Pipet de haut en bas ~ 20 fois pour bien mélanger avec le volume pipette mis à 1 μL. Le stock rouge de G-actin sera maintenant à la dilution finale de 5 mg/mL.
  3. Incuber le G-actinRed préparé pendant 30 min sur la glace intacte.
  4. Centrifugeuse la G-actinerouge préparée à 16.000 x g pendant 20 min à 4 °C dans une microcentrifugeuse pour enlever tout précipité.
  5. Égouttez soigneusement 1,5 μL du supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à bouchons cassés frais sur la glace, en évitant la pastille rose foncé.
  6. Conserver le supernatant rouge G-actin préparé sur la glace jusqu’à 6 h jusqu’à ce qu’il soit prêt à être chargé dans un microneedle.
    REMARQUE : Les micronédules peuvent être tirés des tubes capillaires à l’avance sur un puller de micropipette, puis stockés à température ambiante sur une bande d’argile de modélisation dans une boîte de Petri de 100 x 20 mm. Les paramètres suggérés pour la traction des micronouilles peuvent être trouvés dans le livre de cuisine Pipette29.

3. Recueillir des embryons et monter pour injection

  1. Laisser les mouches pondre des embryons pendant 30 min sur des assiettes de jus de pomme avec de la pâte de levure à 18 °C.
  2. Pendant que les mouches sont couchées, préchauffer une plaque d’agar de jus de pomme sans pâte de levure à température ambiante, découper un coin rectangulaire de 4 cm x 1 cm d’agar de jus de pomme avec une lame de rasoir, et placer sur une lame de verre de 25 mm x 75 mm.
    1. Plaque de récolte de la collection de 30 minutes et embryons de déchorionate en versant de l’eau de Javel fraîche, diluée 1:1 avec de l’eau distillée, sur l’assiette et tourbillonnant la plaque pendant 1 min, tel que décritdans 28 (Figure 1, étape 2).
      REMARQUE : Différentes marques d’eau de Javel sont vendues à différentes concentrations. L’eau de Javel utilisée ici est 6% hypochlorite de sodium de la bouteille et est dilué à une concentration finale de 3% d’hypochlorite de sodium. D’autres marques d’eau de Javel à des concentrations légèrement inférieures fonctionneront tout aussi bien.
    2. Verser l’eau de Javel et les embryons déchorionés dans un panier de collecte (une passoire cellulaire de 70 μm) et rincer l’assiette deux fois à l’eau distillée d’une bouteille de gicler, en ajoutant ces lavages au panier de collecte.
    3. Rincer vigoureusement les embryons déchorionés dans le panier de collecte avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’aucune touffe de levure ne soit visible et que le panier ne laisse aucune marque rose de l’excès d’eau de Javel lorsqu’il est effacé sur une serviette en papier.
  3. À l’aide d’un pinceau avec des poils amortis à l’eau distillée, transférer les embryons déchorionés et lavés du panier de collecte sur le coin d’agar de jus de pomme préparé sur la glissière en verre.
  4. Utilisez une paire de pinces à pointe fine ou une aiguille disséquante pour disposer dix embryons en ligne droite le long du long axe du coin rectangulaire de l’agar (figure 1, étape 3). Disposer les embryons tête à queue, de sorte que leur pôle antérieur soit orienté vers la droite et que le côté dorsal soit face au chercheur (figure 1, étape 3, agrandie).
  5. Couper 0,5 cm de l’extrémité d’une pointe de pipette P200 à l’aide d’une lame de rasoir et plonger dans la « colle embryonnaire »(décrite dans 28). Enduire généreusement une région de 5 mm de largeur (figure 1, étape 4) le long du long bord d’un coverslip rectangulaire de 24 mm x 50 mm, et laisser sécher, côté colle vers le haut. Le séchage prendra ~30 s et est complet une fois que toute la région recouverte de colle semble mat plutôt que humide ou brillant.
    REMARQUE : Préparez de la « colle embryonnaire » au moins 48 h à l’avance. Ajouter n-Heptane à des bandes de ruban adhésif à double face dans un flacon de scintillation tel que décritdans 28.
  6. Une fois que la « colle embryonnaire » a séché, placez doucement le côté colle coverslip vers le bas sur le dessus de la rangée d’embryons alignés sur l’agar, laissant 2-3 mm d’espace entre le bord de la couverture et la rangée d’embryons.
    REMARQUE : Coller les embryons trop près du bord du coverslip peut conduire les embryons à sécher trop au cours de l’expérience.
  7. Retournez le coverslip de sorte que les embryons sont maintenant face vers le haut. Ils doivent être coincés dans une ligne le long d’un long bord de la couverture, et leur région ventrale face au bord le plus proche de la couverture (Figure 1, étape 4, magnifié).
  8. Desiccate les embryons en plaçant le coverslip avec des embryons doucement sur le dessus de 150 g de desiccant bleu frais stocké dans un pot de 16 oz vis dessus. Visser hermétiquement sur le couvercle et incuber pendant 8-10 min (Figure 1, étape 5).
  9. Après la dessiccation, retirez le coverslip du bocal desiccant et collez chaque côté court du coverslip à une glissière de microscope, côté embryon vers le haut,avec deux morceauxde 4 cm 2 de ruban adhésif à double face de sorte que le coverslip embryonnaire s’adaptera au stade d’injection ( figure1, étape 6).
  10. Ajouter 2 à 3 gouttes d’huile d’halocarbone 27 avec une pipette Pasteur pour couvrir les embryons alignés et les protéger contre la déshydratation (figure 1, étape 6).

4. Injecter et chauffer les embryons de stress pour favoriser la formation de tiges d’actine

REMARQUE : Toutes les injections se font dans une pièce à température contrôlée à 18 °C.

  1. Préparer des chambres d’incubation humides à partir d’une boîte de Pétri en verre d’au moins 100 mm x 20 mm de taille et tapisser la chambre de torsions d’essuie-glaces de tissu de laboratoire amortis avec de l’eau distillée (figure 1, étape 8). Préchauffer les chambres d’incubation à 32 °C ou la température d’incubation désirée avant l’injection d’embryons.
  2. Ouvrez la valve de flux d’air pour le microinjecteur et allumez le microinjecteur (l’air comprimé ou l’air de la maison avec une pression d’au moins 90 psi est approprié).
  3. Pendant que les embryons se dessèquent, rechargez le supernatant rouge G-actin précédemment préparé dans le microneedle à l’aide d’une pointe de micro chargeuse. Réglez la pipette pour dessiner 1-1.5 μL.
    REMARQUE : En raison de la viscosité de l’actine, les volumes de chargement peuvent ne pas être exacts et il peut rester suffisamment d’actine pour charger au moins un à deux micronèdès de plus. Jusqu’à 60 embryons peuvent être injectés par microneedle chargé si le microneedle est calibré correctement et ne s’obstrue pas au cours de l’expérience.
  4. Fixez le microneedle au porte-aiguille et serrez la vis. Connectez le tube d’air au microinjecteur et assurez-vous que la pression de retour sur les équilibres de micronèdre à 30 hPa.
  5. Calibrer les paramètres du microinjecteur pour expulser une bulle de 100 μm de diamètre de G-actineRouge (~500 pL) sur un micromètre de diapositives. Faites pivoter le bouton de pression (500-1500 hPa) et le bouton de temps d’impulsion d’injection (0,1-0,5 s) sur le microinjecteur pour obtenir la bonne taille de bulle. Ajustez ces paramètres chaque fois qu’un nouveau microneedle est chargé pour tenir compte de la variabilité de la viscosité de l’actine et de la taille de la pointe du microneedle.
    REMARQUE : Le rouge G-actin préparéest visqueux et il peut y avoir de l’air dans le bout du microneedle qui devrait être expulsé avant d’injecter des embryons. Si le rouge G-actine n’expulse pas facilement de l’extrémité du microneedle, casser doucement la pointe du microneedle contre le bord du micromètre de glissière.
  6. Placez la lame avec des embryons montés sur le stade du microscope.
    REMARQUE : Chaque injection mise en place sera différente, de sorte que les chercheurs devront ajuster leur méthode d’injection en conséquence. Ici, les embryons sont déplacés à l’égard d’un microneedle stationnaire, injectant chaque embryon en exécutant l’embryon dans le micronèdle.
  7. Ajustez le stade du micromanipulateur et concentrez l’objectif 10x sur le microscope léger afin que les embryons soient visibles. Les embryons sont dans le plan focal correct lorsque les contours de la membrane vitelline sont les plus pointus et l’embryon apparaît le plus grand. Choisissez des embryons à injecter qui en sont au bon stade de développement, de sorte qu’au moment où l’incubation post-injection est terminée, la majeure partie de l’embrayage atteint le stade de développement souhaité (p. ex., injecter des embryons au stade 2-330 de Bownes afin d’observer les tiges à la cellularisation après un stress thermique à 32 °C).
  8. Utilisez les commandes de micronèdre pour amener l’aiguille dans le même plan focal que les embryons.
    REMARQUE : Si le microneedle attrape sur le coverslip tout en déplaçant la scène ou le microneedle, alors le microneedle est trop près de la glissière et n’est pas dans le plan focal correct. Le microneedle doit être parallèle au coverslip, et non pas à un angle significatif (Figure 1, étape 7).
  9. Insérer le micronèdre dans l’embryon afin qu’il frappe l’embryon au milieu de sa région ventrale, à l’embryon « équateur ». Déclenchez l’injection avec la pédale ou le bouton « injecter » lorsque la pointe du microneedle est visible à l’intérieur du milieu de l’embryon (figure 1, étape 7).
  10. Injecter le G-actinRouge une fois et retirer lentement le microneedle. Déplacez le stade et répétez pour chaque embryon de l’étape de développement appropriée.
    REMARQUE : L’expansion de l’embryon est normale car le rouge G-actine est injecté et un peu de cytoplasme peut s’échapper de l’embryon.
  11. Une fois que tous les embryons ont été injectés, placez la lame avec les embryons dans la chambre d’incubation humide préparée et fermez le couvercle (figure 1, étape 8). Si vous essayez d’obtenir des embryons qui atteignent la cellularisation, la chaleur stresse les embryons à 32 °C pendant 60-75 min dans la chambre d’incubation humide.
    REMARQUE : Les temps d’incubation sont notés qui permettent la visualisation des tiges dans la cellularisation des embryons stressés par la chaleur. Le temps d’incubation sera plus long pour les embryons non anti-stress thermique parce que le développement sera plus lent à une température inférieure31. Ces embryons de contrôle peuvent être incubés dans des chambres humides à des températures telles que 18 °C ou 25 °C, selon la conception de l’expérience spécifique et la question à poser. Le temps d’incubation minimum nécessaire à la diffusion du rouge G-actine dans tout l’embryon est de 30 min.

5. Tiges d’actine d’image dans les embryons stressés par la chaleur par microscopie confoccale

  1. Pendant que les embryons sont stressés par la chaleur, allumez le microscope confocal et sélectionnez le canal laser de 561 nm.
  2. Déplacez l’objectif (25x, 40x ou 63x recommandé) vers la position de travail.
  3. Si la chaleur d’imagerie stressait les embryons, puis réglez l’incubateur de stade chauffé pour atteindre une température interne de 32 °C. Un thermomètre point-and-shoot ou infrarouge peut être utilisé pour vérifier la température à ou près de l’objectif.
  4. Retirer la lame avec des embryons injectés de la chambre d’incubation humide une fois l’incubationterminée ( figure 1, étape 9).
  5. En travaillant rapidement, retirez doucement les morceaux de ruban adhésif à double face qui ont été utilisés pour adhérer à la couverture avec des embryons montés à la diapositive (figure 1, étape 9).
    ATTENTION : Soyez doux pendant ces étapes car les coverslips peuvent facilement se briser si trop de force est appliquée.
  6. Coller deux morceaux de ruban adhésif à double face de 2,5 cm de long ensemble et couper le ruban en deux dans le sens de la longueur pour faire deux bandes de 2,5 x 0,5 cm de long (figure 1, étape 10).
  7. Coller les deux tiers de la longueur de chaque bande de ruban sur le premier coverslip, flanquant chaque côté des embryons dans l’huile d’Halocarbon 27 (Figure 1, étape 10, orange), laissant un tiers des bandes de ruban suspendu au bord de la première couverture où les embryons sont coincés. Utilisez des mains gantées et veillez à ne pas toucher les embryons pendant cette étape.
  8. Placez délicatement un deuxième coverslip rectangulaire sur les bandes de ruban pour prendre en sandwich les embryons entre les coverslips(figure 1, étape 10, bleu). Alignez les bords de 25 mm, mais gardez les bords de 50 mm décalés les uns des autres de 1 cm de largeur.
    REMARQUE : La surface complète de ce deuxième coverslip deviendra la nouvelle surface d’imagerie qui fera face à la lentille objective, alors prenez soin de ne pas obtenir d’empreintes digitales ou d’huile Halocarbon 27 sur cette deuxième surface de coverslip. Le décalage est nécessaire pour que l’huile supplémentaire Halocarbon 27 puisse être ajoutée pour immerger uniformément les embryons. Si nécessaire, ajouter l’huile Halocarbon 27 à la couture où les deux coverslips se rencontrent au sommet du sandwich et il enrobera les embryons par action capillaire (voir lignes pointillées dans la figure 1, étape 10).
  9. Appuyez doucement sur les zones du coverslip qui sont directement sur le dessus des bandes de ruban adhésif avec le côté émoussé d’une lame de rasoir pour obtenir le coverslip pour adhérer à la bande.
  10. Retournez le sandwich coverslip et placez-le sur un essuie-glace de tissu de laboratoire pour garder la surface d’imagerie propre et porter au microscope confocal (figure 1, étape 11). Assurez-vous que la bande est complètement collée aux deux coverslips avant l’imagerie.
  11. Confirmez que le stade chauffé est à température et si vous utilisez un microscope inversé, ajoutez du liquide d’immersion sur la lentille objective sélectionnée.
  12. Placez soigneusement le sandwich coverslip sur la scène pour vous assurer que la nouvelle surface d’imagerie (2nd coverslip) est celle qui touche le liquide d’immersion (figure 1, étape 11).
    REMARQUE : Si nécessaire, adhérez le sandwich coverslip à la scène avec deux petits morceaux de ruban adhésif à double face pour éviter les mouvements inutiles pendant l’imagerie si les coverslips ne s’adaptent pas bien dans le stade chauffé.
  13. Concentrez-vous sur un embryon en cellularisation (stade Bownes 4a30)ou sur le stade de développement souhaité à l’aide de la lumière transmise ou de la fluorescence.
  14. Une fois qu’un embryon a été mis au point, passez au mode d’acquisition laser sur le microscope confocal et ajustez la puissance et le gain laser, la taille du cadre, le carrelage et les paramètres de projection comme vous le souhaitez.
  15. Prenez des images de surface à travers les plans focaux des noyaux de l’embryon pour trouver des tiges d’actine intranucléaires. Les tiges doivent apparaître dans de multiples orientations sous forme de stries brillantes ou de points à l’intérieur des noyaux relativement foncés (figure 2A, 2C).

6. Expériences d’imagerie alternative

  1. Effectuer FRAP pour étudier le chiffre d’affaires de l’actine le long de la longueur des tiges d’actine intranucléaire ou dans les structures cytoplasmiques d’actine, telles que les extrémités des sillons de membrane de plasma pendant la cellularisation.
  2. Dans le logiciel d’imagerie, choisissez une région rectangulaire autour des pointes de sillon ou des tiges d’actine dans lesquelles acquérir l’expérience.
  3. Choisissez une petite région carrée du centre d’une tige d’actine dans la région d’acquisition rectangulaire pour blanchir. Assurez-vous que les extrémités de la tige d’actine sont visibles et ne sont pas blanchies au cours de l’expérience pour permettre un suivi précis de la tige à l’intérieur du noyau.
  4. Réglez le laser d’eau de Javel pour itérer 50x et réglez la puissance laser d’eau de Javel au maximum.
  5. Choisissez un cours du temps pour acquérir des images chaque seconde pour un total jusqu’à 120 s à la vitesse maximale de séjour pixel et régler le laser à l’eau de Javel après les deux premières secondes de l’acquisition d’image.
  6. Quantifier les données pour déterminer la mi-temps de la récupération de la fluorescence1.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Un flux de travail schématique de la manipulation des embryons est représenté à la figure 1,et un calendrier pour une expérience typique est présenté dans le tableau 1. Une estimation pour un bon résultat expérimental est que pour chaque 10 embryons injectés, au moins la moitié des embryons vus seront au stade de développement correct, intact, et présentent un ASR robuste avec le stress thermique à 32 °C. Cet ASR sera démontré par l’assemblage de tiges d’actine intranucléai...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L’importance de cette méthode est qu’elle utilise le protocole bien établi de microinjection chez les embryons de Drosophile 21 , 22,23,24,25,26,27pour permettre de nouvelles recherches concernant l’ASR et l’assemblage de tiges d’actine qui l’accompagnent. Un avantage majeur de l’in...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le travail de Liuliu Zheng et Zenghui Xue, qui ont contribué au pionnier de cette technique dans le laboratoire Sokac, ainsi que Hasan Seede qui a aidé à l’analyse. Les travaux de cette étude sont financés par une subvention des NIH (R01 GM115111).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adénosine triphosphate (ATP)Millipore-SigmaA23835GComposant du tampon G
Jus de pomme, Mott’s, 64 fl ozMott’s014800000344 Composant des assiettes de jus de pomme
Bacto AgarBD214010Composant des plaques de jus de pomme Eau de
Javel, germicide PureBright, hypochlorite de sodium à 6,0 %KIK International059647210020Pour les embryons déchorionnés
Chlorurede calcium Millipore-SigmaC1016500GComposant de G
tampon Passoire à cellules, 70 &mu ; mFalcon352350Pour la collecte d’embryons déchorionnés Microscope
confocal, LSM 880 34 canaux avec AiryscanZeiss0000001994956Pour l’imagerie de bâtonnets d’actine intranucléaires
Déshydratant Drierite24001Pour la dessiccation d’embryons
Microscope de dissection, Stemi 508 Stéréoscope avec zoom 8:1Zeiss4350649000000Pour disposer les embryons sur un coin de gélose
Aiguille de dissection, 5 poFisher Scientific08965APour disposer les embryons sur un coin
gélose Dithiothréitol (DTT)Fisher ScientificBP1725Composant du tampon G
Ruban adhésif double face, Scotch Permanent, 0,5 po x 250 po3M021200010323Pour fabriquer de la colle embryonnaire
Cage de collecte d’embryonsGenessee Scientific59100Pour l’hébergement des mouches adultes et la collecte d’embryons
Pince à épiler à pointe fine, pince Dumont, Style 5Microscopie électronique Sciences72701DPour disposer les embryons sur un coin de gélose
Capillaires en verre, verre borosilliqué, minces 1 mm x 0,75 mmWorld Precision Instruments, Inc.TW1004Pour micro-aiguilles
Huile d’halocarbure 27Millipore-SigmaH8773100MLPour l’hydratation des embryons
Incubateur à étage chaufféZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000Pour l’imagerie confocale
Essuie-glaces de laboratoire, KimWipesKimberly-Clark34155Essuie-glaces de laboratoire
Microscope optique, Invertoskop 40C Contraste de phase inversé microscope, remis à neufZeissDiscontinuéMicroscope à injection
Méthyl-4-hydroxybenzoateMillipore-SigmaH36471KGComposant des plaques de jus de pomme
Micro-injecteur, FemtoJet4xEppendorf5253000025Micro-injecteur
Embouts de micro-chargeur, epU.I.P.S. 20 &mu ; LEppendorf5242956003Pour le chargement de micro-aiguilles
Micromanipulateur et platine d’injection avec cadrans x,y,z pour le réglage de l’aiguilleBernard Instruments, Inc (Houston, TX)PersonnaliséPour effectuer des micro-injections
Extracteur de micropipettes, Modèle P-97, Flaming/BrownSutter InstrumentsP97Pour tirer des tubes capillaires pour fabriquer des micro-aiguilles
Verre de couverture de microscope 24x50-1.5Fisher Scientific12544EPour le montage d’embryons
Lames de microscope, Lilac Colorfrost, Prénettoyées, 25 x 75 x 1mmFisher Scientific22037081Pour le montage d’embryons pour injection
n-HeptaneFisher ScientificH3601Composant de colle embryonnaire
Objectif, 10xZeissDiscontinuedObjectif 10x pour microscope
à injectionObjectif, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCSZeiss4217679971711Objectif à eau 40x pour objectif confocal
, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 pour immersion dans l’huile, l’eau, l’huile de silicone ou la glycérine (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm à D=0,17mm)Zeiss4208529871000Objectif à immersion mixte 25x pour objectif confocal
Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Huile DIC f/ELYRAZeiss420782990079963x Objectif à huile pour confocal
Pinceau, Robert Simmons Expression E85 Pointu Rond taille 2Daler-Rowney038372016954Pour le transfert d’embryons
Essuie-tout, Mouchoirs en papier à pliage en C,Kimberly-Clark884266344845Pour passoire à cellules buvard
, pipette Pasteur, 5 3/4 poFisher Scientific1367820APour recouvrir les embryons d’huile
Boîte de Pétri, verre, 100 x 20 mmCorning3160102Pour chambre d’incubation humide
Boîte de Pétri, plastique, 60 x 15 mmVWR25384092Pour plaques de jus de pomme
Pipette, Eppendorf Référence 0.5-10 &mu ; LEppendorf2231000604Pour le chargement de la micro-aiguille
Pointe de pipette, xTIP4 250 &mu ; LBiotix63300006Pour ajouter de la colle embryonnaire à la lamelle
Lame de rasoirVWR55411050Pour couper le coin de gélose, le ruban, les pointes de pipette
Actine globulaire conjuguée à la rhodamine, plaquette humaine (non musculaire ; 4x10 &mu ; g)Cytoskeleton, Inc.APHR-AG-actin^Red
Flacon à scintillation, 20 mL Verre borosillicate avec doublure en polyéthylène et bouchons d’uréeFisher Scientific033377Pour la fabrication de colle d’embryon
Pot à vis, 16 ozNalgene000194414195Pour la dessiccation des embryons
Micromètre de stade MicroscopieSciences602104PGPour calibrer le volume de l’injection de G-actine
SaccharoseMillipore-Sigma840971KGComposant des assiettes de jus de pomme
Base TrizmaMillipore-SigmaT15031KGComposant de la levure tampon G
, Levure Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 ozLevure Lesaffre Corporation117929157002Composant de la pâte de levure
de , blanc électronique

Références

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Stress thermiquetechnique de microinjectionmicroscopie confocaleexpériences de FRAPG-actine rougeréponse au stress de l'actinemontage d'embryonsrécupération de la fluorescence
Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.