Article de méthode

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

DOI :

10.3791/61298

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16 juillet 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les interactions protéine-protéine dans les systèmes membranaires cellulaires jouent un rôle crucial dans un large éventail de processus biologiques, des interactions cellule à cellule à la transduction du signal; de la détection des signaux environnementaux à la réponse biologique; de la régulation métabolique au contrôle du développement. Des informations structurelles précises sur les interactions protéine-protéine sont cruciales pour comprendre les mécanismes moléculaires des complexes protéiques membranaires et pour la conception de molécules très spécifiques pour moduler ces protéines. De nombreuses approches in vivo et in vitro ont été développées pour la détection et l’analyse des interactions protéine-protéine. Parmi eux, l’approche de biologie structurelle est unique en ce qu’elle peut fournir des informations structurelles directes sur les interactions protéines-protéines au niveau atomique. Cependant, la biologie structurale des protéines membranaires actuelles est encore largement limitée aux méthodes à base de détergent. L’inconvénient majeur des méthodes à base de détergent est qu’elles dissocient ou dnaturent souvent les complexes protéiques membranaires une fois que leur environnement de bicouche lipidique indigène est éliminé par des molécules détergentes. Nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la biologie structurale de protéine de membrane. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système dans l’analyse des interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire avec une étude de cas de l’état oligomérique de l’AcrB.

Introduction

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Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’information structurelle sur les IPP entre les protéines est cruciale pour comprendre le mécanisme par lequel les protéines effectuent leur fonction. On estime que plus de 80 % des protéines reposent sur une formation complexe pour s’acquitter de leurs rôles fonctionnels1. Étant donné le pourcentage de protéines observées comme dépendant des IPP pour un bon fonctionnement inné, leur importance en biologie est évidente, mais être en mesure d’étudier correctement les protéines qui s’engagent dans ces interactions est resté difficile en raison des limitations dans les techniques disponibles pour observer expérimentalement lorsque les protéines forment des IPP.

Il y a un degré élevé de désaccord entre les résultats pour beaucoup d’IPP expérimentalement déterminés en raison de la quantité élevée de bruit, de faux positifs, et de faux négatifs qui sont dérivés de beaucoup des techniques de détermination actuellement disponibles de PPI. C’est particulièrement le cas pour le système de levure à deux hybrides (Y2H), la spectrométrie de purification de masse d’affinité en tandem (TAP-MS) et le transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET), qui représentent trois des méthodes les plus couramment utilisées pour la détermination PPI2,3,4,5,6,7. En comparaison, les techniques de biologie structurale protéique, telles que la résonance magnétique nucléaire (RM), la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), peuvent être utilisées pour obtenir des informations structurelles à haute résolution sur les interactions protéine-protéine jusqu’au niveau atomique et permettre la confirmation visuelle directe des interactions se produisant pour une protéine cible d’intérêt. Toutes les techniques de recherche non fondées sur la structure actuellement disponibles (p. ex., Y2H, TAP-MS et FRET) n’ont pas cette capacité et souffrent en outre de la difficulté à identifier les interactions faibles et transitoires entre les protéines5. Ces lacunes sont encore améliorées lors de l’étude des protéines membranaires en raison de la complexité supplémentaire provoquée par la variable supplémentaire de l’environnement lipidique qui influence la formation d’une structure quaternaire appropriée et d’un assemblage complexe hétéromérique.

Les protéines membranaires composent une grande partie du protéome et sont connues pour jouer de nombreux rôles cruciaux dans le bon fonctionnement cellulaire dans tous les organismes vivants. Malgré le fait que les protéines membranaires représentent 27 % du génome humain et constituent environ 60 % de toutes les cibles actuelles en matière demédicaments,il existe une anomalie majeure dans le nombre de modèles résolus pour les protéines membranaires qui ne représentent que ~2,2 % de toutes les structuresprotéiques publiées 8,9,10. La principale cause de l’écart dans la disponibilité de l’information structurelle réside dans les propriétés intrinsèques des protéines membranaires elles-mêmes. En raison de leur faible solubilité, de leur dépendance à l’égard des interactions avec un environnement lipidique pour maintenir la structure et la fonction indigènes, et des diverses propriétés physicochimiques de la membrane lipidique elle-même, les protéines membranaires continuent de représenter un problème important lors de la mise en œuvre de techniques de biologie structurelle pour les étudier. De ces propriétés intrinsèques, la plus importante pour obtenir des informations structurelles précises est l’exigence d’avoir des interactions avec leur environnement lipidique naturel pour qu’ils maintiennent leur structure et leur fonction indigènes. L’environnement lipidique fait tellement partie intégrante de la structure et de la fonction des protéines membranaires que le concept de mémtéine (une combinaison des mots membrane et protéine) a été proposé comme unité fondamentale de la structure membranaire-protéique et de lafonction 11. Malgré l’importance des interactions lipidiques-protéines, les techniques de détermination de l’IPP basées sur la structure actuellement disponibles exigent souvent que les protéines étudiées soient solubles ou solubilisées avec des détergents. L’exposition à des détergents durs peut dénaturer les protéines ou causer de faux positifs et négatifs dus à la délipidation, qui peut induire l’agrégation, la dénaturation des protéines, la dissociation des interactions non covalentes et la formation d’états oligomériques artificiels. En raison de la nécessité de maintenir un environnement lipidique naturel pour la détermination précise de l’état oligomérique indigène des protéines membranaires, nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène (NCMNs)12 basé sur les particules de lipides mâles mâles (SMALP) précédemment rapportées (SMALP)13 méthode.

SMALP utilise le copolymère acide masculin styrène comme polymère actif membranaire pour extraire et solubiliser les protéines membranaires. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) est un polymère amphiphilique unique en raison de sa mastic styrène hydrophobe et diamétralement opposée à la moiety acide masculin hydrophilique. Il forme des nanoparticules en adsorber, déstabilisant et perturbant la membrane cellulaire dans un mécanisme dépendant du pH14. Cette activité fonctionnelle de SMA est ce qui lui permet d’être utilisé comme un système sans détergent pour l’extraction des protéines membranaires et la solubilisation. Le système NCMN est distinct du système SMALP à plusieurs égards. La caractéristique la plus unique du système NCMN est qu’il dispose d’une bibliothèque de polymères actifs membranaires avec une multitude de polymères qui ont des propriétés uniques qui les rendent adaptés à l’isolement de nombreuses protéines membranaires différentes qui nécessitent des conditions différentes pour la stabilité et le fonctionnement natif. Le système NCMN a également des protocoles différents par rapport à la méthode SMALP quand il s’agit de préparer les nanoparticules. Un tel exemple est que les NCMN utilisent une purification de colonne d’affinité de nickel en une seule étape pour la détermination de la structure à haute résolution; l’effet de ces différents protocoles peut être observé lors de la comparaison du protocole NCMNs, qui a généré 3.2 et 3.0 Å cryo-EM AcrB structures, avec une étude similaire utilisant la méthode SMALP, qui a abouti à une structure cryo-EM AcrB à une résolution 8.8 Å12,15. Ces caractéristiques uniques du système NCMN sont les améliorations apportées à la méthode SMALP précédemment établie et en font un candidat idéal pour l’étude des IPP.

Le transporteur multidrogue efflux AcrB existe en tant qu’homotrimère fonctionnel dans E. coli12. Une analyse mutagène a suggéré qu’une mutation unique de point de P223G, située sur une boucle qui est responsable de la stabilité du trimer d’AcrB, déstabilise l’état de trimer et donne un monomère d’AcrB une fois préparé avec le DDM détergent, qui pourrait être détecté avec l’électrophoresis bleu indigène de gel16. Cependant, l’analyse fret du mutant AcrB-P223G a suggéré que lorsque dans l’environnement de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire indigène, la majorité des mutants AcrB-P223G existaient encore en tant que trimer et que les niveaux d’expression pour les deux types sauvages AcrB et AcrB-P223G sont similaires. Pourtant, malgré les résultats de l’analyse fret, un essai d’activité pour le transporteur mutant a montré que l’activité a considérablement diminué par rapport au typesauvage 16. Bien que la technologie FRET ait été populairement utilisée pour l’analyse des interactions protéines-protéines, la recherche a montré qu’elle peut souvent donner de faux positifs17,18,19,20.

Récemment, des structures cryo-EM à haute résolution du trimer AcrB ont été déterminées qui ont montré l’interaction de l’AcrB avec sa bicouche lipidique de membrane cellulaire indigène associée par l’utilisation des NCMNs12. En principe, les NCMN peuvent facilement être utilisés pour l’analyse des interactions protéine-protéine trouvées sur la membrane cellulaire indigène. Lors d’un test de ce système, des expériences ont été menées pour observer directement l’état oligomérique de l’AcrB-P223G avec l’utilisation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène et de microscopie électronique colorante négative. Afin de comparer avec les nanoparticules sauvages de type AcrB, nous avons utilisé le même polymère actif membranaire (SMA2000 fabriqué dans notre laboratoire, qui est indexé comme NCMNP1-1 dans la bibliothèque NCMN) utilisé pour la détermination de la structure cryo-EM à haute résolution de l’AcrB et des polymères alternatifs trouvés dans la bibliothèquenCMNs 12. D’après les résultats précédemment rapportés, on s’attendait à ce que la majorité du mutant AcrB-P223G existe sous forme de nanoparticules de membrane cellulaire indigène trimeric21. Cependant, aucun trimers AcrB n’a été trouvé présent dans l’échantillon, comme ceux qui ont été observés avec le type sauvage AcrB. Ceci suggère que la majorité d’AcrB-P223G ne forme pas de garnitures sur la membrane cellulaire indigène comme précédemment suggéré.

Ici, nous rapportons une analyse détaillée du mutant E. coli AcrB-P223G dans une comparaison avec le type sauvage E. coli AcrB en utilisant les NCMN. Cette étude de cas de l’AcrB suggère que les NCMN sont un bon système pour l’analyse d’interaction protéine-protéine.

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Protocole

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1. Expression protéique

  1. Inoculer 15 mL de bouillon formidable (TB) médias avec des antibiotiques spécifiques aux plasmides avec BL21 (DE3) cellules pLysS contenant l’AcrB exprimant des plasmides dans des tubes de 50 mL pendant la nuit à 37 °C avec secousse à 250 rpm.
  2. Vérifiez la densité optique de la culture nocturne à 600 nm (OD600) et assurez-vous qu’elle est de plus de 2,0.
  3. Diluer 5 mL de culture cellulaire en 1 L de médias antituberculeux contenant des antibiotiques spécifiques aux plasmides et incuber à 37 °C en secouantjusqu’à 600OD =0,8, puis induire avec iPTG qui a une concentration finale de 1 mM.
  4. Effectuer l’induction à 20 °C en secouant pendant 20 h.
  5. Pelleter les cellules à l’aide de centrifugation pendant 15 min à 4 °C et 4 000 x g.

2. Lyse cellulaire et isolement membranaire

  1. Resuspendez la pastille cellulaire dans le tampon A(tableau 1, utilisez le tampon A du DDM A ou le tampon A des NCMNs selon le schéma de purification qui doit suivre) en utilisant 80 mL pour chaque 20 g de granulés cellulaires.
  2. Homogénéisez les granulés de cellules résuspendus à l’aide d’un homogénéiseur Dounce en verre à 4 °C ou si, à température ambiante, assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.
  3. Transférer l’échantillon dans un bécher métallique sur la glace et lyser les cellules en les chargeant dans un homogénéiseur haute pression à 4 °C et 1 500 barres.
    1. Répétez le processus de chargement des cellules dans l’homogénéisant et leur permettant de passer à travers l’homogénéiseur pendant 3-4 cycles ou jusqu’à ce que le lysate commence à clarifier.
  4. Centrifugeuse le lysate à 15.000 x g pendant 30 min à 4 °C.
  5. Recueillir le supernatant et charger dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse à 215 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
  6. Jetez le supernatant et recueillez les granulés membranaires des tubes d’ultracentrifugeuse. Conserver tout excès de granulés membranaires à -80 °C.

3. Préparation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène

  1. Resuspendez 1 g de granulés membranaires dans le tampon A de 10 mL NCMNs (tableau 1).
  2. Homogénéiser l’échantillon de membrane cellulaire résuspendée à l’homogénéiseur dounce en verre à 20 °C.
  3. Transférer l’échantillon de membrane en suspension dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter une solution de stock de polymères actifs membranaires et d’autres NCMN Tampon A pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2,5 % (w/v) de polymère actif membranaire (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2).
    REMARQUE : Les solutions de stock de polymères actifs membranaires doivent être faites dans de l’eau distillée double et peuvent être conservées à des concentrations variables, mais généralement à 10 % (w/v).
  4. Agiter l’échantillon pendant 2 h à 20 °C.
  5. Chargez l’échantillon dans une ultracentrifugeuse et tournez à 150 000 x g pendant 1 h à 20 °C.
  6. Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencent à équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 mL avec 25 mL de NCMNs Tampon A.
  7. Recueillir le supernatant après l’ultracentrifugation est terminé et le charger sur 5 mL de colonne Ni-NTA à température ambiante avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.
  8. Lavez les lignes de chromatographie liquide à protéine rapide (FPLC) avec suffisamment de NCMNs Buffer B (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis connectez la colonne à la machine FPLC.
  9. Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer B avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.
  10. Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer C (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.
  11. Elutez la protéine avec 20 mL de NCMNs Buffer D (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et recueillez l’échantillon à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant chacune réglées à 1,0 mL.
  12. Conserver les échantillons de protéines à 4 °C.
  13. Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE afin de vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.

4. Électrophoresis gel SDS-PAGE

  1. Préparer la chambre de coulée en serrant le verre à l’appareil de coulée.
  2. Préparez le gel de séparation de 12 % selon la recette énumérée dans le tableau 1.
    REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.
  3. Verser le gel, en laissant 2 cm sous le fond du peigne pour le gel d’empilage.
  4. Enlevez les bulles en superposant le dessus du gel avec 100% isopropanol et attendez que le gel de séparation polymérise.
  5. Retirer l’isopropanol et laver toute trace de l’isopropanol avec de l’eau distillée.
  6. Préparer le gel d’empilage selon la recette énumérée dans le tableau 1.
    REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.
  7. Verser le gel d’empilage sur le gel de séparation.
  8. Ajouter un peigne à la chambre pour former les puits et attendre que le gel empilage soit complètement polymérisé.
  9. Placer 1 μL de 1 M de TNT dans un tube de microcentrifugeuse pour chaque échantillon de fraction qui doit être exécuté sur le gel.
  10. Ajoutez également 7 μL de tampon de chargement 4x à chaque tube.
  11. Ajouter 20 μL d’échantillon à partir des fractions qui doivent être exécutés sur le gel à chaque tube de microcentrifugeuse.
  12. Vortex les tubes contenant les échantillons.
  13. Faites tourner les tubes de l’échantillon à l’aide d’une microcentrifugeuse de table de 3 s et assurez-vous que tout l’échantillon est retourné au fond des tubes.
  14. Préparer la cellule d’électrophoresis gel en sécurisant une cassette de gel polyacrylamide de 12% en place et en remplissant les chambres intérieures et externes de la cellule avec Tris-acétate-EDTA (TAE) Buffer (Tableau 1).
  15. Chargez le marqueur de poids moléculaire dans la première voie du gel avec le volume approprié requis par ses instructions.
  16. Chargez 28 μL de l’échantillon de chaque tube mélangé à la TNT et au tampon de chargement.
  17. Placez le couvercle de la cellule électrophoresis sur le dessus de la boîte et branchez le couvercle dans l’alimentation électrique.
  18. Allumez l’alimentation électrique et réglez-la à 100 V et laissez-la fonctionner pendant 20 min.
  19. Après 20 min, augmenter le courant d’alimentation à 140 V et continuer à l’exécuter pendant encore 30-40 min ou jusqu’à ce que la bande de colorant tampon de chargement atteint le fond de la cassette de gel.
  20. Après avoir complété la tache d’électrophorésie et de détenir le gel pour visualiser les bandes protéiques contenues dans le gel.

5. Purification des protéines à l’aide de DDM

REMARQUE : Le but de ce processus de purification est de servir de contrôle pour les expériences utilisant les polymères actifs membranaires.

  1. Resuspendez 6-10 g de granulés membranaires, à partir de l’étape 2.6, dans le tampon A du DDM (tableau 1) à l’aide de 5 mL/g de granulés membranaires.
  2. Homogénéisez l’échantillon resuspendi avec un homogénéiseur dounce en verre à 4 °C ou si à température ambiante assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.
  3. Transférer l’échantillon dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter le DDM et le tampon A additionnel de DDM pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2 % de DDM.
  4. Agiter l’échantillon pendant 2 h à 4 °C.
  5. Charger l’échantillon dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse de 1 h à 4 °C et 150 000 x g.
  6. Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencer à préparer les 5 mL de colonne Ni-NTA en se lavant avec 25 mL de tampon DDM A (tableau 1).
  7. Une fois l’ultracentrifugation terminée, recueillez le supernatant et chargez-le sur la colonne Ni-NTA de 5 mL à 4 °C avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.
  8. Lavez les lignes FPLC avec suffisamment de DDM Buffer B + 0,05% DDM (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis fixez la colonne à la machine FPLC.
  9. Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon B DDM + 0,05% DDM avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.
  10. Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon DDM C + 0,05% DDM (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.
  11. Elute la protéine avec 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir le flux à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant ensemble à 1,0 mL.
  12. Sélectionnez les fractions contenant le pic d’élitution pour la mise en commun et la concentration à l’aide d’un concentrateur centrifuge et d’une centrifugeuse à 4 000 x g et 4 °C jusqu’à atteindre 500 μL.
  13. À l’aide d’une boucle de 500 μL, chargez l’échantillon dans la machine FPLC, puis sur la colonne d’exclusion de taille de 25 mL à 4 °C. Elute utilisant 30 mL de Tampon DDM E + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir en fractions avec les tailles de fraction s’est fixé à être de 0,5 mL par fraction.
  14. Prenez les fractions et mesurez la concentration en protéines à l’aide de l’absorption de 280 nm pour confirmer la courbe UV-Vis à partir du graphique d’élitution FPLC.
  15. Recueillir 20 μL à partir de chaque fraction d’échantillon qui correspond aux pics observés sur le graphique d’élitution fplc et ont été confirmés pour être précis avec le test d’absorption.
  16. Congeler le reste de ces fractions d’échantillon à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche dans les aliquots désirés et conserver les échantillons de protéines à -80 °C.
  17. Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE tel que décrit précédemment pour vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.

6. Préparation négative de grille de tache

  1. Placez les grilles qui vont être utilisées pour la préparation de l’échantillon sur une glissière en verre enveloppée dans du papier filtre avec le côté carbone face vers le haut.
  2. Placez la glissière de verre avec les grilles de microscope électronique dans la chambre d’un déchargeur de lueur entre les deux électrodes et remplacez le couvercle en verre en s’assurant qu’il est centré et bien scellé.
  3. Exécutez la machine de déchargement de lueur et assurez-vous que la lumière pourpre générée par le plasma est visible.
  4. Lorsque la machine est terminée en marche, attendez que la chambre ait atteint la pression atmosphérique pour enlever le couvercle en verre, puis retournez la glissière avec les grilles sur le banc où les échantillons seront chargés sur eux.
  5. Ajuster la concentration des échantillons de protéines purifiées à environ 0,1 mg/mL en diluant l’échantillon avec le tampon approprié ou en se concentrant à l’aide d’un concentrateur centrifuge.
  6. Chargez 3,5 μL d’échantillon de protéines sur la grille de carbone de 10 nm d’épaisseur et attendez 1 min.
  7. Retirez le liquide de la surface de la grille EM à l’aide d’un papier filtre.
  8. Lavez la surface de la grille 3x en ramassant 3 gouttelettes d’eau de μL avec la grille et en enlevant l’eau de la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.
  9. Lavez la surface de la grille 2x en ramassant 3 gouttelettes de μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % et enlevez les solutions de lavage sur la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.
  10. Tacher la grille avec une gouttelette de 3 μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % pendant 1 min.
  11. Retirez la solution d’acétate d’uranium à la surface du réseau EM avec du papier filtre et séchez la grille pendant au moins 1 min.
  12. Conservez la grille dans une boîte de grille pour une utilisation ultérieure.

7. Imagerie EM

  1. Chargez la grille préparée dans le support du réseau à un établi sécuritaire.
  2. Préparer le microscope en plaçant les microscopes dewar dans une boîte en polystyrène et remplir la dewar 3/4e pleine d’azote liquide.
  3. Confirmez que le couvercle en caoutchouc de la fenêtre du microscope le recouvre, puis chargez la dewar sur le microscope en plaçant les fils de cuivre dans la dewar jusqu’à ce qu’il s’adapte sur la plate-forme.
  4. Remplissez le reste de la dewar d’azote liquide et placez un bouchon sur le dessus de la dewar pour le couvrir.
  5. Allumez la haute tension, conditionner le microscope, et attendre que le microscope se réchauffe et d’établir un niveau de vide sûr pour une utilisation.
  6. Une fois que le microscope est prêt, ouvrez la valve de la colonne et confirmez que le faisceau est présent en enlevant le couvercle en caoutchouc sur la fenêtre du microscope.
  7. Vérifiez la stigmatisation du faisceau en vous répandant dans et hors en ajustant l’intensité du faisceau. Si l’astigmatisme est présent, le faisceau aura une forme elliptique que l’on s’éloigne de cross-over et le faisceau doit être la même forme ovale des deux côtés.
  8. Ajustez les jumelles au microscope pour qu’ils soient de la bonne hauteur et de la bonne distance selon les yeux de l’observateur.
  9. Vérifiez le positionnement du faisceau pour les modes Recherche, Focuset Exposition en parcyclant les trois modes jusqu’à ce que le faisceau soit centré dans chacun d’eux.
  10. Fermez la valve de la colonne et chargez le support de grille dans le microscope électronique.
  11. Réglez le microscope à la hauteur eucentrique en utilisant la fonction wobbler microscopes et en ajustant le mouvement de la scène en utilisant l’axe Z jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement d’un côté à l’autre de l’échantillon au centre.
  12. En utilisant le mode de recherche à faible dose sur le microscope rechercher la grille pour une zone souhaitable de contraste raisonnable avec les molécules échantillon présentes pour se concentrer sur l’échantillon.
  13. Concentrez-vous sur l’échantillon en mode Focus en utilisant une taille d’étape élevée jusqu’à ce que l’échantillon soit vu, puis diminuez les étapes pour trouver le niveau de mise au point correct.
  14. Zéro et vider le faisceau, puis assurez-vous que le tampon en caoutchouc couvre la fenêtre du microscope.
  15. En utilisant le mode Exposition prendre l’image de la zone de grille désirée pour une exposition de 1 s à 62.000x grossissement et vérifier l’image obtenue.
  16. Une fois l’imagerie effectuée, une grille ferme les vannes de colonne et retire le support de grille de la colonne.
  17. Une fois terminé l’imagerie de toutes les grilles d’intérêt arrêter le microscope en éteignent la puissance de filament et en enlevant la dewar d’azote liquide du microscope.
  18. Placez quelque chose pour absorber l’humidité sur le stand où la dewar s’est assise pour attraper la condensation des bobines de cuivre du microscope.
  19. Activez le mode Cryo Cycle et assurez-vous que la pompe turbo est éteinte.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’aide des procédures présentées ici, des échantillons de type sauvage E. coli AcrB et de mutant e. coli AcrB-P223G ont été purifiés. Les échantillons ont ensuite été adsorbés à des grilles de microscopie électronique tache négative de carbone et tachés à l’aide d’acétate d’uranyle avec la méthode de ballonnementlatéral 22. Des images négatives de tache ont été rassemblées utilisant la microscopie électronique de transmission. L’image de tache négative pour l’échantillon de typ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour l’intégrité de la structure et de la fonction des protéines membranaires. De nombreuses approches ont été développées pour étudier les interactions protéines-protéines. Par rapport aux protéines solubles, les protéines membranaires et leurs IPP sont plus difficiles à étudier en raison des propriétés intrinsèques uniques des protéines membranaires. Cette difficulté provient principalement de l’exigence de protéines membranaires à intégrer dans un environnement de bi...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.G est répertorié comme inventeur du polymère actif membranaire NCMNP5-2 et du système NCMN.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage VCU (à Y.G.) et l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01GM132329 (à Y.G.) Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Montserrat Samso et Kevin McRoberts pour leur généreux soutien à l’enregistrement vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Produits chimiques
30 % Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (tampon de chargement)Bio-Rad1610747
Acetic Acid GlacialThermoFisher ScientificA38S-212
Persulfate d’ammonium (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramphénicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 poudre colorante protéiqueBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99 % pur) Sans protéaseGoldbioDTT10
GlycérolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazoleAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycineGoldbioK-120-25
Chlorure de magnésium hexahydratéThermoFisher ScientificAA3622636
MéthanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-diméthyléthylènediamine (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Pas encore disponible dans le commerceEnvoyer la demande d’obtention à l’auteur
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyEnvoyer la demande d’obtention à l’auteur
Chlorure de sodiumThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Acétate d’uranyleAmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Grilles de microscope électronique en carbone (10 nm)Electron Microscopy SciencesCF300-Cu-TH
Con-Torque Homogénéisateur de tissusEberbachE7265
Corning LSE Mini MicrocentrifugeuseThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
Fraction Collector F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorèse CellBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpectrophotomètreThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltracentrifugeuseBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Mouchoir à moudre Wheaton358013
PowerPac Alimentation de baseBio-Rad164-5050
Razel R99-E Pompeà seringue à vitesse variableRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti Rotor à angle fixeBeckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Tube à centrifuger coniqueThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml ColonneGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
correspondant correspondant

Références

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Interactions des prot ines membranairesanalyse par microscopie lectroniqued termination de l tat oligom riquepolym re actif sur membranechromatographie NTA au nickelgrilles de coloration n gativechromatographie d exclusion st riqueanalyse par SDS PAGEcryo microscopie lectronique

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