Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.
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Article de méthode
Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les interactions protéine-protéine dans les systèmes membranaires cellulaires jouent un rôle crucial dans un large éventail de processus biologiques, des interactions cellule à cellule à la transduction du signal; de la détection des signaux environnementaux à la réponse biologique; de la régulation métabolique au contrôle du développement. Des informations structurelles précises sur les interactions protéine-protéine sont cruciales pour comprendre les mécanismes moléculaires des complexes protéiques membranaires et pour la conception de molécules très spécifiques pour moduler ces protéines. De nombreuses approches in vivo et in vitro ont été développées pour la détection et l’analyse des interactions protéine-protéine. Parmi eux, l’approche de biologie structurelle est unique en ce qu’elle peut fournir des informations structurelles directes sur les interactions protéines-protéines au niveau atomique. Cependant, la biologie structurale des protéines membranaires actuelles est encore largement limitée aux méthodes à base de détergent. L’inconvénient majeur des méthodes à base de détergent est qu’elles dissocient ou dnaturent souvent les complexes protéiques membranaires une fois que leur environnement de bicouche lipidique indigène est éliminé par des molécules détergentes. Nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la biologie structurale de protéine de membrane. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système dans l’analyse des interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire avec une étude de cas de l’état oligomérique de l’AcrB.
Introduction
Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’....
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Protocole
1. Expression protéique
- Inoculer 15 mL de bouillon formidable (TB) médias avec des antibiotiques spécifiques aux plasmides avec BL21 (DE3) cellules pLysS contenant l’AcrB exprimant des plasmides dans des tubes de 50 mL pendant la nuit à 37 °C avec secousse à 250 rpm.
- Vérifiez la densité optique de la culture nocturne à 600 nm (OD600) et assurez-vous qu’elle est de plus de 2,0.
- Diluer 5 mL de culture cellulaire en 1 L de médias antituberculeux contenant des antibiotiques spécifiques aux plasmides et incuber à 37 °C en secouantjusqu’à 600OD =0,8, puis induire avec iPTG qui a une concentration finale de 1 mM.
- ....
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Résultats
À l’aide des procédures présentées ici, des échantillons de type sauvage E. coli AcrB et de mutant e. coli AcrB-P223G ont été purifiés. Les échantillons ont ensuite été adsorbés à des grilles de microscopie électronique tache négative de carbone et tachés à l’aide d’acétate d’uranyle avec la méthode de ballonnementlatéral 22. Des images négatives de tache ont été rassemblées utilisant la microscopie électronique de transmission. L’image de tache négative pour l’échantillon de typ.......
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Discussion
Les interactions protéine-protéine sont importantes pour l’intégrité de la structure et de la fonction des protéines membranaires. De nombreuses approches ont été développées pour étudier les interactions protéines-protéines. Par rapport aux protéines solubles, les protéines membranaires et leurs IPP sont plus difficiles à étudier en raison des propriétés intrinsèques uniques des protéines membranaires. Cette difficulté provient principalement de l’exigence de protéines membranaires à intégrer dans un environnement de bi.......
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Déclarations de divulgation
Y.G est répertorié comme inventeur du polymère actif membranaire NCMNP5-2 et du système NCMN.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage VCU (à Y.G.) et l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01GM132329 (à Y.G.) Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Montserrat Samso et Kevin McRoberts pour leur généreux soutien à l’enregistrement vidéo.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Produits chimiques | |||
| 30 % Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (tampon de chargement) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Persulfate d’ammonium (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphénicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 poudre colorante protéique | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99 % pur) Sans protéase | Goldbio | DTT10 | |
| Glycérol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycine | Goldbio | K-120-25 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Méthanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-diméthyléthylènediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Pas encore disponible dans le commerce | Envoyer la demande d’obtention à l’auteur | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Envoyer la demande d’obtention à l’auteur | |
| Chlorure de sodium | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Acétate d’uranyle | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Grilles de microscope électronique en carbone (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Homogénéisateur de tissus | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifugeuse | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorèse Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomètre | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Mouchoir à moudre Wheaton | 358013 | ||
| PowerPac Alimentation de base | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Pompe | à seringue à vitesse variableRazel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Rotor à angle fixe | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Tube à centrifuger conique | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Colonne | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
Références
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).<....
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Réimpressions et autorisations
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