Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.
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Article de méthode
Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.
Introduction
Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain1. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)2,3
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Protocole
1. Préparation des réactifs
- Diluer le supplément de milieux de culture cellulaire (CCM) 5x hiPS décongelé dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de CCM hiPS.
REMARQUE: Le supplément de CCM surgelé 5x hiPS nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 ° C pour la nuit. Les aliquotes du CCM 1x hiPS peuvent être conservées jusqu’à 6 mois à -20 °C. - Préparation de plaques à membrane basale (BM) matricielle 1 pour la culture cellulaire hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparer les aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme ....
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Résultats
L’objectif de ce protocole était de démontrer que les podocytes humains matures peuvent être dérivés de cellules hiPS dans des conditions chimiquement définies. Les données présentées dans ce manuscrit ont été générées en utilisant la lignée cellulaire DU11 hiPS17, qui a d’abord été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes. Une analyse chromosomique a également été effectuée et les cellules se sont avérées normales sur le plan caryotypique. En commençant par les cellules hiPS DU11 indifférenc.......
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype13du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cell.......
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Déclarations de divulgation
S.M. est l’auteur d’un brevet en instance pour des méthodes de génération de podocytes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes (demande de brevet américain 14/950859). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’école d’ingénierie Pratt de l’Université Duke, la Division de néphrologie de la Duke Medical School, un prix de recherche de chaire du département de médecine de l’Université Duke et un prix spécial de transition de carrière PDEP du Burroughs Wellcome Fund à S.M.. M.B a été soutenu par le programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation. Nous remercions le laboratoire Bursac de nous avoir généreusement fourni la lignée de cellules souches DU11 et le laboratoire Varghese de l’Université Duke d’avoir temporairement partagé leur installation de culture tissulaire avec notre groupe. Cette publication....
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Matériaux
Cells
humaines La lignée cellulaire iPS DU11 (clone #11 de l’Université Duke) a été générée à la plateforme iPSC de l’Université Duke et nous a été fournie par le laboratoire Bursac de l’Université Duke. thermiquement à centrifuger conique Corning Pipette sérologique sérologique Corning sérologique Corning
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellules | |||
| DU11 | Cette lignée a été testée pour le mycoplasme et a été caryotypée pour la dernière fois en juillet 2019 par notre laboratoire, et s’est avérée être caryotypiquement normale. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoïque (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 supplément sans sérum | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show variation d’un lot à l’autre |
| Kit complet de milieu avec CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Milieux d’entretien des podocytes |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 avec supplément GlutaMAX | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 avec supplément de glutamine |
| FBS inactivé | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Activine humaine A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Humain BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Humain VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 milieu | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS milieux de culture cellulaire (CCM) |
| Pénicilline&ndash ; streptomycine liquide (100× ;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 Inhibiteur de ROCK | 1254 | Anticorps Tocris | |
| Alexa Fluor 488&ndash ; et Alexa Fluor 594&ndash ; anticorps secondaires conjugués | A32744 ; A32754 ; A-11076 ; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Fragment de laminine-E8 (LM-E8) | N-892012 | Iwai Amérique du Nord | Matrice de membrane basale (BM) 2 |
| Matrigel hESC Matrix, flacon de 5 mL | 354277 | BD Biosciences | Matrice de membrane basale (BM) 1. Peut présenter une variation d’un lot à l’autre |
| < Enzymes et autres réactifs > | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Solution de détachement cellulaire |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO est toxique. Doit être manipulé dans une cagoule de sécurité chimique |
| Tampon de dissociation cellulaire sans enzyme, Hank' sel équilibré 13150016 | Thermo/Life Technologies | ||
| Solution d’éthanol, 70 % (vol/vol), qualité biotechnologique | 97065-058 | L’éthanol VWR | est inflammable et toxique |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | Le PFA doit être manipulé dans une hotte chimique avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Évitez l’inhalation et le contact avec la peau. |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Eau distillée stérile | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsine-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Pipettes aspirantes, emballées individuellement | 29442-462 | Centrifugeuse Corning | |
| Avanti J-15R | B99516 | Beckman Coulter | |
| Tube à centrifuger conique, 15 mL | 352097 | Tube | |
| , 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | Pour le stockage congelé aliquotes |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Microscope fluorescent utilisé pour l’acquisition d’images de cellules iPS fixes et colorées et de leurs dérivés |
| Hémocytomètre | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i Incubateur CO2 | 51030403 | Thermo/Life Technologies | Pour la culture et l’entretien de routine des cellules iPS et de leurs dérivés |
| Zeiss Axio Observer inversé équipé d’une caméra AxioCam 503 | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(caméra) | Microscopie Carl Zeiss | Utilisé pour acquérir des images en contraste de phase de cellules iPS vivantes et de leurs dérivés à chaque étape de la différenciation des podocytes |
| Gants en nitrile Kimberly-Clark | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, grand | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, petit | 21905-026 | VWR | |
| P10 pointes de pipette barrière de précision | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 pointes de pipette barrière | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 pointes de pipette barrière | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 pointes de pipette barrière | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 pointes | de pipette barrièreP1122 | Denville Scientific | |
| , 10 mL, emballée individuellement | 356551 | Pipette | |
| , 25 mL, emballée individuellement | 356525 | Pipette | |
| , 5 mL, emballée individuellement | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 &mu ; m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Tubes de microcentrifugation stériles | 1138W14 | Thomas Scientific | Pour l’aliquotage des facteurs de croissance |
| Culture tissulaire&ndash ; plaques traitées à 12 puits | 353043 | Corning | |
| Culture tissulaire&ndash ; plaques à six puits traitées | 353046 | Corning | |
| VWR blouse de laboratoire blanche | 10141-342 | VWR | |
| Élévateur de cellules à large biseau | 3008 | Corning |
Références
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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Réimpressions et autorisations
