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Article de méthode

Mesure de l’œdème cérébral post-AVC, de la zone infarctus et de la dégradation de la barrière céphalo-cérébrale dans un seul ensemble d’échantillons de cerveaux de rongeurs

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DOI :

10.3791/61309

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23 octobre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle technique de mesure des trois paramètres les plus importants des lésions cérébrales ischémiques sur le même ensemble d’échantillons de cerveau de rongeurs. L’utilisation d’un seul échantillon de cerveau est très avantageuse en termes de coûts éthiques et économiques.

Résumé

L’une des causes les plus courantes de morbidité et de mortalité dans le monde est l’AVC ischémique. Historiquement, un modèle animal utilisé pour stimuler l’AVC ischémique implique l’occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO). La zone infarctus, l’oedème cérébral et la dégradation de la barrière céphalo-cérébrale (BBB) sont mesurés comme paramètres qui reflètent l’étendue des lésions cérébrales après mcao. Une limitation significative à cette méthode est que ces mesures sont normalement obtenues dans différents échantillons de cerveau de rat, menant aux fardeaux éthiques et financiers dus au grand nombre de rats qui doivent être euthanasiés pour une taille appropriée d’échantillon. Ici nous présentons une méthode pour évaluer avec précision des dommages de cerveau suivant MCAO en mesurant la zone d’infarctus, l’oedème de cerveau et la perméabilité de BBB dans le même ensemble de cerveaux de rat. Cette nouvelle technique fournit un moyen plus efficace d’évaluer la pathophysiologie de l’AVC.

Introduction

L’une des causes les plus courantes de morbidité et de mortalité dans le monde est l’AVC. À l’échelle mondiale, l’AVC ischémique représente 68 % de tous les cas d’AVC, tandis qu’aux États-Unis, l’AVC ischémique représente 87 %des cas d’AVC 1,2. On estime que la charge économique de l’AVC atteint 34 milliards de dollars aux États-Unis2 et 45 milliards d’euros dans l’Union européenne3. Des modèles animaux d’AVC sont nécessaires pour étudier sa pathophysiologie, développer de nouvelles méthodes d’évaluation et proposer de nouvelles options thérapeutiques4.

La course ischémique se produit avec l’occlusion d’une artère cérébrale principale, habituellement l’artère cérébrale moyenne ou une de ses branches5. Ainsi, les modèles de course ischémique ont historiquement impliqué l’occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Après mcao, les dommages neurologiques sont le plus généralement évalués en mesurant la zone infarctus (IZ) utilisant une méthode de coloration de chlorure de chlorure de 2,3,5 triphenyltetrazolium (TTC)13,oedème cérébral (BE) utilisant séchage ou calcul des volumes hémisphériques14,15,16, et la perméabilité de la barrière hémique du sang (BBB) par une technique de spectrométrie utilisant la coloration bleue Evans17,18,19.

La méthode MCAO traditionnelle utilise des ensembles distincts de cerveaux pour chacune des trois mesures du cerveau. Pour un échantillon de grande taille, il en résulte un nombre important d’animaux euthanasiés, avec des considérations éthiques et financières supplémentaires. Une autre méthode pour atténuer ces coûts impliquerait des mesures des trois paramètres dans un seul ensemble de cerveaux rongeurs post-MCAO.

Des tentatives antérieures ont été faites pour mesurer les combinaisons de paramètres dans le même échantillon de cerveau. Des méthodes de coloration immunofluorescentessimultanées 20 ainsi que d’autres analyses moléculaires etbiochimiques 21 ont été décrites après coloration de TTC dans le même échantillon de cerveau. Nous avons précédemment calculé des volumes d’hémisphère de cerveau pour évaluer l’oedème de cerveau et avons exécuté la coloration de TTC pour calculer la zone infarctus dans le même ensemblede cerveau 15.

Dans le présent protocole, nous présentons une technique modifiée de MCAO qui mesure des dommages ischémiques de cerveau en déterminant la perméabilité d’IZ, de BE, et de BBB dans le même ensemble de cerveaux de rongeur. IZ est mesurée par coloration TTC, BE est déterminé par le calcul du volume hémisphérique, et la perméabilité BBB est obtenue par des méthodes de spectrométrie19. Dans ce protocole, nous avons employé un modèle modifié de MCAO, basé sur l’insertion directe et la fixation du cathéter monofilament dans l’artère carotide interne (ICA) et le blocage supplémentaire du flux sanguin à l’artère cérébrale moyenne (MCA)22. Cette méthode modifiée montre une diminution du taux de mortalité et de morbidité par rapport à la méthode mcaotraditionnelle 16,22.

Cette nouvelle approche fournit un modèle financièrement sain et éthique pour mesurer les lésions neurologiques après l’AMC. Cette évaluation des principaux paramètres des lésions cérébrales ischémiques aidera à étudier en profondeur sa pathophysiologie.

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Protocole

Les procédures suivantes ont été menées conformément aux recommandations de la Déclaration d’Helsinki et de Tokyo et aux Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont également été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben Gourion du Néguev.

1. Préparation des rats à la procédure expérimentale

  1. Sélectionnez des rats sprague-dawley mâles adultes sans pathologie générale, pesant chacun entre 300 et 350 g.
  2. Maintenir tous les rats à température ambiante à 22 °C, avec 12 heures de cycles lumineux et sombres avant l’expérience.
  3. Assurez-vous que la nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum.
  4. Effectuez toutes les interventions entre 6 h .m et 14 h.m.

2. Préparation des rats à la chirurgie

  1. Anesthésier les rats pendant 30 min avec de l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour l’entretien) et 24% d’oxygène (1,5 L/min).
    1. Testez le niveau d’anesthésie chez les rats en vous assurant qu’ils n’ont pas de réflexe de retrait de pédale.
  2. Insérez le cathéter de calibre 24 dans la veine de la queue.
    REMARQUE : Le réchauffement de la queue pour la vasodilatation n’est pas effectué.
    1. Placez les rats sur la table dans une position supine. Utilisez du ruban médical pour apposer les quatre membres des rats.
  3. Placez la sonde pour la mesure de la température dans le rectum du rat avant la chirurgie.
  4. Pendant la procédure, maintenir une plaque chauffante pour soutenir une température corporelle centrale de 37 °C.
  5. Ajouter de l’onguent dans les deux yeux du rat pour se protéger.
  6. Raser la zone chirurgicale et désinfecter avec trois applications de 10% povidone-iode suivi de 70% d’alcool isopropylique.

3. Occlusion cérébrale moyenne droite d’artère

REMARQUE : Le MCAO est exécuté par une technique modifiée, commedécrit précédemment 16,22,23, avec l’utilisation d’instruments décrits par McGarry et coll.24 et Uluç et coll.25.

  1. Disséquer la peau et le fascia superficiel à la ligne médiane ventrale du cou avec des pinces chirurgicales et des ciseaux avec des lames incurvées.
  2. Identifier le triangle musculaire, composé de l’ICA, de l’artère carotide externe (ECA) et de l’artère carotide commune (CCA).
  3. Séparez soigneusement le CCA droit et l’ICA du nerf vague avec des microforceps pour la chirurgie vasculaire.
  4. Exposez la bonne CCA et l’ICA. Bloquez le flux sanguin provenant de la CCA à l’ICA en utilisant soit des micro-clips ou des tourniquets spéciaux pour la chirurgie vasculaire. Faire une incision (environ 1 mm) sur l’ICA à l’aide de microscisseurs pour la chirurgie vasculaire.
  5. Insérer un cathéter monofilament (nylon 4-0) directement à travers l’ICA, environ 18,5-19 mm du point de bifurcation de la CCA droite dans le cercle de Willis jusqu’à atteindre une résistance légère, pour occluser le MCA26.
  6. Ligate autour de l’ICA au-dessus de la bifurcation de la CCA.
  7. Pour le groupe de contrôle à feinte, effectuer une insertion de fil de nylon au lieu des étapes 3.5 et 3.616,22.
  8. Administrer 5 mL de chlorure de sodium à 0,9 % par injection intrapénitale.
  9. Fermez la plaie par suture et emmenez le rat dans une zone de récupération.
    REMARQUE : Quelques minutes après la fin de l’anesthésie, le rat se réveillera et se déplacera indépendamment autour de la cage.
  10. À 23 h après mcao, injecter 2% evans bleu en saline (4 mL/kg)23,26 dans la veine de la queue pour les deux groupes opérés via une canule27.
    REMARQUE : Ceci est utilisé comme traceur de perméabilité du cerveau sanguin. Laisser circuler pendant 60 minutes.

4. Détermination de la zone infarctus

  1. Mesure IZ à 24 h après MCAO comme décrit précédemment9,15,18,19,26.
    REMARQUE : Les rats qui ont perdu plus de 20 % de leur poids ou qui ont développé des crises ou de l’hémiplégie sont exclus de l’expérience.
  2. Euthanasier le rat en remplaçant le mélange de gaz inspiré par 20% d’oxygène et 80% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que le rat cesse de respirer spontanément.
  3. Ouvrez la poitrine avec une incision latérale de 5-6 cm à travers la paroi abdominale sous la cage thoracique à l’aide de ciseaux et de forceps chirurgicaux.
  4. Effectuer une incision diaphragmatique sur toute la longueur de la cage thoracique avec des ciseaux et des forceps chirurgicaux.
  5. Déplacer soigneusement les poumons, couper à travers la cage thoracique jusqu’à la clavicule sur les côtés droit et gauche28.
  6. Perfuser avec 200 mL de solution saline normale à travers le ventricule gauche du cœur.
  7. Perforer ou incise l’atrium droit du cœur avec des ciseaux.
  8. Effectuer la décapitation à l’aide d’une guillotine et recueillir les tissus cérébraux.
  9. À l’aide de ciseaux d’iris, coupés du magnum foramen jusqu’au bord distal de la surface postérieure du crâne des deux côtés.
  10. Séparez les bulbes olfactifs, les connexions nerveuses le long de la surface ventrale et la surface dorsale du crâne du cerveau.
  11. Retirez le cerveau de la tête.
  12. Produisez 6 tranches de cerveau en créant des sections horizontales de 2 mm d’épaisseur avec une lame de rasoir à bord unique de 0,009 po.
  13. Incuber pendant 30 min à 37 °C en TTC de 0,05 %.
  14. Placez le tissu cérébral sur les diapositives du microscope et effectuez le balayage optique de ces 6 tranches de cerveau avec une résolution de 1600x1600 dpi (voir supplément 1 par exemple).
  15. Ajoutez un filtre bleu avec un éditeur photo (par exemple, Adobe Photoshop CS2) en utilisant la fonction Channel Mixer (Image > Ajustements > Channel Mixer) et enregistrer l’image comme un format de fichier JPEG.
    REMARQUE : Après l’application du filtre bleu, l’image apparaîtra à l’échelle grise.
  16. Ouvrez l’image enregistrée dans ImageJ 1.37v29,30.
    REMARQUE : Ce programme informatique utilise une fonction de seuil pour isoler et calculer les pixels qui sont en noir ou blanc (voir la figure 1).
  17. Pour chacune des 6 tranches cérébrales de l’image, sélectionnez et enregistrez chaque hémisphère (droit blessé ipsilateral et gauche non blessé contralatéral) comme un fichier d’image distinct en utilisant l’outil « sélection polygone » du menu principal.
  18. Définissez le seuil pour déterminer iz en utilisant une fonction de seuil automatique à partir du menu principal du logiciel ImageJ en sélectionnant Image > Ajuster > Seuil, et mesurer le nombre de pixels dans chaque hémisphère d’un seul ensemble de cerveaux.
    REMARQUE : Les macros peuvent être utilisées pour cette étape du logiciel ImageJ (voir Supplément 2 pour le code). La coupure est un paramètre critique pour déterminer quels pixels convertir en blanc et lesquels convertir en noir selon l’ombre du gris (voir supplément 3 et supplément 4 à titre d’exemples). ImageJ compare ensuite les pixels blancs et noirs pour déterminer l’IZ. Sur la base du protocole de coloration et des paramètres du scanner, nous avons utilisé une valeur de coupure constante de 0,220.
  19. Effectuer la mesure de la correction iz pour l’enflure des tissus en utilisant les ratios de l’hémisphère cérébral ipsilateral et contralatéral (RICH)méthode 13,23 (voir l’exemple dans le supplément 5).
    figure-protocol-1
    REMARQUE : La taille de l’infarctus est évaluée en pourcentage de l’hémisphère contralatéral.

5. Détermination de l’œdèmecérébral 31

NOTE: Utilisez ImageJ 1.37v pour la mesure de BE32,33.

  1. Mesurez BE 24 h après MCAO. Pour le calcul de BE, utilisez les données du volume de l’hémisphère gauche et droit (en unités).
  2. Effectuez la numérisation optique avec une résolution de 1600x1600 dpi (voir supplément 1 par exemple).
  3. Sélectionnez les hémisphères cérébraux et définissez le cut-off pour déterminer BE avec ImageJ 1.37v, tel que décrit ci-dessus dans les sections 4.17-4.19.
  4. Exprimer la zone BE en pourcentage des zones standard de l’hémisphère contralatéral non affecté, calculées par la méthode RICH à l’aide de l’équation suivante (voir exemple dans le supplément 5)23,34.
    figure-protocol-2
    REMARQUE : L’étendue de l’BE est évaluée en pourcentage de l’hémisphère contralatéral.

6. Détermination des perturbations de la BBB

  1. Mesurez la perturbation BBB 24 h après MCAO.
  2. Divisez les hémisphères droit et gauche en six tranches et mettez-les dans un tube de microcentrifugeuse.
  3. Homogénéiser chaque tranche du tissu cérébral en acide trichloroacetic, basé sur le calcul de 1 g de tissu cérébral dans 4 mL d’acide trichloroacetic de 50%.
  4. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 20 min.
  5. Diluer le liquide supernatant 1:3 avec 96 % d’éthanol.
  6. Effectuer la spectrophotométrie de luminescence en utilisant un logiciel de spectrophotométrie, en installant la plaque et en effectuant une lecture d’échantillon en utilisant les paramètres suivants : longueur d’onde d’excitation d’intensité de fluorescence de 620 nm (bande passante 10 nm) et longueur d’onde d’émission de 680 nm (bande passante 10 nm)23,35 ; Haut mod; Numéro Chair 25; Manuel 100; Secouant 1 sec, 1 mm.
    REMARQUE : Utilisez une longueur d’onde d’excitation de 620 nm (bande passante de 10 nm) et une longueur d’onde d’émission de 680 nm (bande passante 10 nm). 23,35 ans

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Résultats

Mesure de la zone infarctus

Un t-test indépendant a indiqué que 19 rats qui ont subi mcao permanent ont démontré une augmentation significative du volume d’infarctus de cerveau comparé aux 16 rats sham-operated (MCAO=7.49% ± 3.57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (voir figure 2A)). Les données sont exprimées en pourcentage moyen de l’hémisphère contralatéral ± SD.

Mesure de l...

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Discussion

L’objectif principal du présent protocole était de démontrer des mesures cohérentes de trois paramètres principaux des lésions ischémiques : la perméabilité de l’IZ, du BE et du BBB. Des études antérieures dans ce domaine ont démontré la possibilité d’effectuer un ou deux de ces paramètres ensemble dans le même échantillon. Outre la réduction des coûts que cette méthode en trois parties offre, elle fournit également un modèle bioéthique plus souhaitable qui limite le nombre d’animaux qui doivent être exploités et par la ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko et Evgenia Goncharyk du Département de physiologie, faculté de biologie, d’écologie et de médecine, Oles Honchar, Université Dnipro, Dnipro, Ukraine pour leur soutien et leurs contributions utiles à nos discussions. Les données obtenues font partie de la thèse de doctorat de Ruslan Kuts.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 2 mLBraun4606027V
Chlorhexidine à 2 % dans une solution d’alcool à 70 %Sigma-Aldrich500 ccFournit une antisepsie générale de la peau dans le champ opératoire
27 G Aiguille avec seringueBraun305620
3-0 Sutures en soieHenry Schein1007842
4-0 Suture en nylon4-00
Cerveau & Matrices tissulairesSigma-Aldrich15013
Canule Venflon 22 GKD-FIX
Centrifugeuse Sigma 2-16PSigma-AldrichSigma 2-16P
Balances analytiques compactesSigma-AldrichHR-AZ/HR-A
Balance numériqueSigma-AldrichRs 4,000
Ciseauxde dissectionPipette Sigma-AldrichZ265969
EppendorfSigma-AldrichZ683884
tube EppendorfSigma-AldrichEP0030119460
Détecteur de fluorescenceTecan, Mä ; nnedorf SuisseModèle : Infinite 200 PRO lecteur multimodeEn option.
Détecteur de fluorescenceMolecular Devices LLCVWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optionnel.
Éponges de gazeFisher22-362-178
Chauffage avec thermomètreCoussin chauffant-1Modèle : HEATINGPAD-1/2
Microclips hémostatiquesSigma-Aldrich
Horizon-XLMennen Medical Ltd
Brassard de perfusionABNIC-500
Micro pinceSigma-Aldrich
Micro-ciseauxSigma-Aldrich
MultisetTeva Medical998702
Olympus Microscope BX 40Olympus
Pince opératoireSigma-Aldrich
Scanner optiqueCanonCano Scan 4200FRésolution 3200 x 6400 dpi
Boîtes de PétriSigma-AldrichP5606
Purina ChowPurina5001Rongeurs de laboratoire chow donné aux rats, souris et hamster est une nutrition du cycle de vie qui est utilisée dans la recherche biomédicale depuis plus de 5 décennies. Fourni aux rats ad libitum dans cette expérience.
Cagesà rats Techniplast2000PBoîtier conventionnel pour rongeurs. Des cages ont été utilisées pour loger les rats tout au long de l’expérience
Lames de scalpel #11Sigma-AldrichS2771
Software
Adobe Photoshop CS2 pour WindowsAdobe
ImageJ 1.37vNIHLe code source est disponible gratuitement. L’auteur, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), travaille à la Direction des services de recherche, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, États-Unis
SPSS Statistics 22IBM
Office 365 ProPlusMicrosoft-MicrosoftOffice
Excel Windows 10Microsoft
Reagents
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazoliumSigma-Aldrich298-96-4
50 % Acide trichloracétiqueSigma-Aldrich76-03-9
Éthanol 96 %RomicalLiquide inflammable
Evans blue 2 %Sigma-Aldrich314-13-6
Isoflurane, USP 100 %Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017
183603985447 Ciseaux opératoires Sigma-Aldrich

Références

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