Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

Résumé

Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

Résumé

La méthode présentée dans cet article vise à automatiser les expériences Bio-AFM et l’enregistrement des courbes de force. En utilisant cette méthode, il est possible d’enregistrer automatiquement les courbes de forces sur 1000 cellules en 4 heures. Pour maintenir un temps d’analyse de 4 heures, le nombre de courbes de force par cellule est réduit à 9 ou 16. La méthode combine un programme basé sur Jython et une stratégie d’assemblage de cellules sur des motifs définis. Le programme, mis en œuvre sur un Bio-AFM commercial, peut centrer la pointe sur la première cellule du réseau, puis se déplacer, automatiquement, de cellule en cellule tout en enregistrant les courbes de force sur chaque cellule. Grâce à cette méthodologie, il est possible d’accéder aux paramètres biophysiques des cellules tels que leur rigidité, leurs propriétés adhésives, etc. Avec l’automatisation et le grand nombre de cellules analysées, on peut accéder au comportement de la population cellulaire. Il s’agit d’une percée dans le domaine de la bio-AFM où les données n’ont, jusqu’à présent, été enregistrées que sur quelques dizaines de cellules.

Introduction

Ce travail fournit une méthodologie pour effectuer des mesures de force automatiques sur des centaines de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM). Il fournit également une méthode pour immobiliser les microbes sur un tampon microstructuré PDMS qui est compatible avec les expériences AFM menées dans un environnement liquide.

Bio-AFM est une technologie hautement spécialisée conçue pour des applications en biologie et ensuite utilisée pour étudier les cellules vivantes. Il nécessite un ingénieur qualifié qui peut analyser une cellule à la fois. Dans ces conditions, le nombre de cellules différentes pouvant être analy....

Protocole

1. Culture cellulaire microbienne

1. Revivifier les cellules d’un stock de glycérol.
   REMARQUE: C. albicans sont stockés à -80 °C dans des stocks de glycérol, sur des billes.
   1. Choisissez une bille dans le stock de -80 °C et frottez-la sur une gélose à la levure peptone dextrose (YPD). Faire pousser les cellules pendant 2 jours à 30 °C, avant la culture liquide.
2. Préparer des cultures liquides.
   1. Remplissez un tube de culture avec 5 mL de bouillon stérile de YPD et ajoutez une seule colonie de cellules de C. albicans, cultivées sur la plaque de gélose YPD.
   2. Cultiver la culture dans des conditions s....

Résultats

Nous avons employé le protocole décrit pour analyser l’effet du caspofungin sur les propriétés biophysiques des albicans opportunistes du microbe pathogène humain opportuniste C. sous sa forme de levure. La caspofungine est une molécule antifongique de dernière chance utilisée lorsque d’autres médicaments sont inefficaces en raison des mécanismes de résistance que les cellules développent vers les antifongiques. Son mécanisme d’action est basé sur l’inhibition de la sous-unité Fks2 du complexe fks1/Fks2 responsa.......

Discussion

La principale amélioration apportée par cette méthodologie est une augmentation significative du nombre de cellules mesurées dans un laps de temps déterminé. La contrepartie est une réduction du nombre de points mesurés par cellule. Cela signifie que cette méthode n’est pas conçue pour fournir une analyse détaillée d’une seule cellule. La méthode s’applique uniquement aux cellules qui peuvent tenir dans les puits du tampon PDMS. Le timbre est assez polyvalent, alors qu’il contient des puits de 1,5 x 1,5 μm² ju.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cantilever AFM	Bruker Sondes AFM	MLCT	Les porte-à-faux utilisés étaient étiquetés « C” avec une fréquence de résonance de 7 à 10 kHz et k : 0,01 N/m
Analyse des données AFM	JPK-Bruker	JPK Version de traitement des données minimum 5.1.8	Peut être téléchargé à partir d’un utilisateur JPK-Bruker Boîtes de
Pétri AFM	WPI	FluoroDish FD35-100	Le chauffage a été utilisé pour surveiller les changements de température pendant l’expérience
Microscope à force atomique (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II ou III	l’AFM doit être monté sur un microscope optique inversé avec une platine motorisée
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin a été utilisé avec une concentration de 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Editeur de code	Microsoft	Visual Studio Code version 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassing chambre	Fisherbrand	15594635	L’équipement est utilisé pour dégazer les tampons PDMS pendant environ 50 minutes n’importe quel dessiccateur couplé à une pompe à vide fera l’affaire.
Chauffage de boîte de Pétri	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Il s’agit d’un add-on au JPK/Bruker AFM. Le réchauffeur a été utilisé pour surveiller les changements de température pendant l’expérience
Tampon d’acétate de sodium pH 5,2	Sigma-Aldrich	S7899	La solution contient 18 mM d’acétate de sodium, 1 mM de CaCl2 et 1 mM de MnCl2. Ajustez le pH avec de l’acide acétique glacial. La solution peut être stockée à 4 ° ; C depuis 2 mois
Langage d’analyse statistique	https://www.r-project.org	R version 3.6.1	R est un langage et un environnement pour le calcul statistique et graphique. Il s’agit d’un projet GNU qui est similaire au langage et à l’environnement S
du logiciel d’analyse statistique	https://rstudio.com	R studio version 1.1.463	collaboration entre la Fondation R, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP et d’autres. RStudio et Shiny sont des projets affiliés à la Fondation pour les statistiques en libre accès
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissement dans un ensemble
Yeast Peptone D Broth	Difco	242820
YPD	Agar Difco	DF0427-17-6