Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

Résumé

Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

Résumé

La méthode présentée dans cet article vise à automatiser les expériences Bio-AFM et l’enregistrement des courbes de force. En utilisant cette méthode, il est possible d’enregistrer automatiquement les courbes de forces sur 1000 cellules en 4 heures. Pour maintenir un temps d’analyse de 4 heures, le nombre de courbes de force par cellule est réduit à 9 ou 16. La méthode combine un programme basé sur Jython et une stratégie d’assemblage de cellules sur des motifs définis. Le programme, mis en œuvre sur un Bio-AFM commercial, peut centrer la pointe sur la première cellule du réseau, puis se déplacer, automatiquement, de cellule en cellule tout en enregistrant les courbes de force sur chaque cellule. Grâce à cette méthodologie, il est possible d’accéder aux paramètres biophysiques des cellules tels que leur rigidité, leurs propriétés adhésives, etc. Avec l’automatisation et le grand nombre de cellules analysées, on peut accéder au comportement de la population cellulaire. Il s’agit d’une percée dans le domaine de la bio-AFM où les données n’ont, jusqu’à présent, été enregistrées que sur quelques dizaines de cellules.

Introduction

Ce travail fournit une méthodologie pour effectuer des mesures de force automatiques sur des centaines de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM). Il fournit également une méthode pour immobiliser les microbes sur un tampon microstructuré PDMS qui est compatible avec les expériences AFM menées dans un environnement liquide.

Bio-AFM est une technologie hautement spécialisée conçue pour des applications en biologie et ensuite utilisée pour étudier les cellules vivantes. Il nécessite un ingénieur qualifié qui peut analyser une cellule à la fois. Dans ces conditions, le nombre de cellules différentes pouvant être analysées est plutôt faible, typique de 5 à 10 cellules en 4-5 heures. Cependant, la quantité de mesures de force enregistrées sur une seule cellule est généralement très élevée et peut facilement atteindre 1000. Ainsi, le paradigme actuel des mesures de force AFM sur les cellules vivantes est d’enregistrer des centaines de courbes de force (FCs) mais sur un nombre limité de cellules.

Statistiquement, cette approche est discutable et soulève la question de la représentativité de l’échantillon. En effet, il est difficile, par exemple, d’évaluer l’hétérogénéité d’une population cellulaire en ne mesurant que quelques cellules, même si des centaines de mesures sont enregistrées sur ces quelques cellules. Cependant, c’est sur la base de ce paradigme que des avancées majeures ont été réalisées en biophysique, microbiologie et nanomédecine^1,2,3. En effet, l’analyse nanométrique à l’échelle des cellules individuelles a fourni de nouvelles informations sur la nanomécanique cellulaire, sur l’organisation des protéines transmembranaires, ou sur le mécanisme d’action des médicaments antimicrobiens ou anticancéreux^4,5,6,7. Récemment cependant, plusieurs tests biomécaniques à haut débit menés sur des cellules ont émergé⁸, montrant l’intérêt de la communauté scientifique à changer ce paradigme et à accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire. Ces essais s’appuient tous sur des systèmes microfluidiques pour déformer les cellules et mesurer optiquement leur déformation sous contrainte afin d’obtenir une mesure indirecte de leur élasticité globale de surface^8. Cependant, un problème important avec ces méthodes est qu’elles sont mono-paramétriques: seule l’élasticité cellulaire peut être sondée. De plus, ils ne permettent pas la mesure des paramètres mécaniques des cellules adhérentes, ce qui peut être limitatif pour les études de cellules de mammifères non circulaires ou de biofilms par exemple.

Des approches impliquant l’AFM ont été développées par les équipes de S. Scheuring⁹ et M. Favre^10. Scheuring et al. ont immobilisé des cellules sur des motifs de fibronectine^9,forçant des cellules individuelles à prendre la forme du motif^9. Ensuite, cette équipe a cartographié les propriétés mécaniques de quelques cellules pour définir des données moyennes, représentatives de 14 à 18 cellules. Le développement réalisé par Farve et al. visait à multiplexer les mesures en parallélisant les cantilevers AFM¹⁰. À notre connaissance, ce travail dans le sens du multiplexage n’a pas conduit à des mesures sur des cellules vivantes.

Une approche intéressante proposée par l’équipe de Dujardin présente une AFM automatisée capable d’identifier les cellules et de les imager au fond de puits sur mesure. Bien que cette méthode ne permette pas l’analyse d’une grande population de cellules, elle permet de tester automatiquement différentes conditions dans chaque puits¹¹.

Notre objectif dans ce travail est plus ambitieux puisque nous voulions mesurer au moins 1000 cellules pour accéder non pas à une cellule moyenne, mais, au contraire, à l’hétérogénéité entre les cellules. La stratégie que nous avons développée ici pour accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire à l’aide de l’AFM est basée sur l’analyse de centaines de cellules sur lesquelles un nombre limité de courbes de force sont enregistrées. Par rapport à l’approche « classique » consistant à enregistrer un grand nombre de courbes de force sur un nombre limité de cellules, cette approche doit être considérée comme complémentaire car elle ne fournit pas les mêmes informations. En effet, alors que la méthode typique permet de sonder l’hétérogénéité de la surface cellulaire individuelle, en utilisant notre approche, nous sommes en mesure d’accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire entière. Pour atteindre cet objectif, nous avons combiné une méthode qui immobilise directement les microbes (ici l’espèce de levure Candida albicans)dans les puits d’un tampon microstructuré PDMS^12,et développe un programme original pour déplacer la pointe AFM, automatiquement, de cellule en cellule¹³ et mesurer les propriétés mécaniques de chaque cellule.

Protocole

1. Culture cellulaire microbienne

1. Revivifier les cellules d’un stock de glycérol.
   REMARQUE: C. albicans sont stockés à -80 °C dans des stocks de glycérol, sur des billes.
   1. Choisissez une bille dans le stock de -80 °C et frottez-la sur une gélose à la levure peptone dextrose (YPD). Faire pousser les cellules pendant 2 jours à 30 °C, avant la culture liquide.
2. Préparer des cultures liquides.
   1. Remplissez un tube de culture avec 5 mL de bouillon stérile de YPD et ajoutez une seule colonie de cellules de C. albicans, cultivées sur la plaque de gélose YPD.
   2. Cultiver la culture dans des conditions statiques à 30 °C pendant 20 h avant la récolte par centrifugation (4000 x g,5 min). Jetez le surnageant et éliminez-le comme déchet de biorisque.
   3. Laver les pastilles 2x avec 10 mL de tampon acétate (8 mM d’acétate de sodium, 1 mM de_CaCl2,1 mM de_MnCl2,pH 5,2). Centrifugeuse (4000 x g,5 min) entre les lavages.
   4. Ressusciter le culot dans 2 mL de tampon acétate et utiliser cette solution pour l’immobilisation cellulaire sur l’estampille PDMS.
      NOTA : Cette suspension ne peut pas être entreposée et doit être préparée fraîchement pour la section 3.

2. Préparation du timbre PDMS

1. Préparation de moule maître de silicium
   1. Dessinez les microstructures souhaitées à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
      REMARQUE : Les puits conçus doivent être de taille similaire au microbe à piéger. La conception devrait fournir une grande matrice de puits de 100 x 100 à la liste. Il est préférable de faire plusieurs tableaux avec des tailles légèrement différentes autour de la taille moyenne du microbe.
   2. Si une salle blanche est disponible, suivez les étapes 2 à 12 du protocole¹²précédemment publié. Sinon, le moule maître en silicium peut être acquis auprès d’installations commerciales de salle blanche.
2. Moulage de tampon PDMS
   1. Préparer 55 g de solution de prépolymère PDMS contenant un mélange de 10 à 1, rapport massique, d’oligomères PDMS et d’agent de durcissement(Table des matériaux).
   2. Mélanger et dégazer cette solution sous vide (de l’ordre de 10^{-1 -10-2} bars) jusqu’à ce que toutes les bulles piégées soient retirées de la solution PDMS (5−10 min).
   3. Versez 20 g de la solution dégazée sur le moule maître en silicium et dégazez à nouveau (dans la gamme de 10^-1-10^-2 bars).
      REMARQUE: L’épaisseur du timbre doit être d’environ 2−3 mm.
   4. Lorsque toutes les bulles sont enlevées, réticulez le PDMS à 80 °C pendant 1 h.
   5. Coupez le tampon microstructuré PDMS avec un scalpel (0,5 x 1,5 cm²⁾dans une direction parallèle aux réseaux de microstructures visibles.
   6. Décollez le tampon du moule maître en silicium.
   7. Retournez le timbre pour exposer les microstructures sur sa face supérieure et déposez-le sur une lame de verre. Assurez-vous d’avoir les microstructures tournées vers le haut loin de la lame de verre. Alignez les microstructures visibles sur le tampon avec le côté de la lame de verre, qui servira plus tard de référence pour la procédure d’automatisation AFM.
      Remarque : à ce stade, le tampon PDMS est prêt pour l’immobilisation cellulaire. Les tampons PDMS peuvent être stockés sur le moule maître en silicium pendant plusieurs mois. Lorsque tous les PDMS sont retirés du moule maître, un nouveau tampon PDMS peut être re coulé sur le moule maître (pour garder le moule maître en sécurité, il est possible de le reproduire en polyuréthane)^14.

3. Préparation de l’échantillon

1. Immobilisation cellulaire
   1. Centrifuger (500 x g,5 min) 600 μL de la solution cellulaire remise en suspension pour séparer le tampon des cellules.
   2. Pipet 200 μL du surnageant de l’étape 3.1.1 sur le tampon PDMS, et dégaz sous vide (dans la gamme de 10^-1-10^-2 bars) pendant environ 40 min.
      REMARQUE: Cette étape est importante pour améliorer l’immobilisation cellulaire à l’intérieur des puits. Les molécules de la paroi cellulaire de la levure, présentes dans le surnageant, sont probablement déposées sur la surface pdms au cours de cette étape de pré-mouillage. Ces molécules, très probablement, améliorent l’adhérence des cellules et contribuent à l’augmentation du taux de remplissage des timbres.
   3. Après 40 min, avec une pipette, retirer le tampon de la surface PDMS et déposer, avec une pipette, 200 μL de la solution cellulaire de l’étape 1.2.4 pendant 15 min à température ambiante.
   4. Placer les cellules dans les microstructures de l’estampe par assemblage convectif/capillaire. Pour cela, étalez manuellement 200 μL de suspension de cellules sur le timbre à l’aide d’une lame de verre dans les deux sens avec un angle compris entre 30 et 50 °. Il peut être nécessaire de passer la lame de verre plusieurs fois sur le timbre pour obtenir un taux de remplissage élevé.
      Remarque : une description complète de cette méthode est disponible¹³.
   5. Retirez la suspension cellulaire avec une pipette. Laver le tampon 3x avec 1 mL de tampon acétate, pH 5,2 pour éliminer les cellules qui n’ont pas été piégées.
   6. Séchez le dos du timbre à l’aide d’un flux d’azote, afin de vous assurer que le timbre adhérera à la boîte de Pétri sèche.
   7. Enfin, déposez le tampon PDMS rempli de cellules dans une boîte de Pétri(Table des matériaux)et remplissez-le avec 2 mL de tampon acétate pour maintenir les cellules en milieu liquide.
2. Apposer le cachet sur l’étage AFM
   1. Centrez la scène à 0:0 lors du démarrage des opérations AFM.
   2. Étalonner la sensibilité et la constante printanière du porte-à-faux sur le verre et dans l’eau, comme décrit dans Unsay et al.¹⁵
   3. Prenez la boîte de Pétri avec le timbre et placez-la dans le porte-boîte de Petri AFM.
   4. Aligner le bord de l’estampage perpendiculairement à l’axe Y du porte-boîte de Petri.
      NOTA : Un angle d’inclinaison acceptable est de moins de 5°, comme illustré à la figure 1.
   5. Placez la tête de l’AFM sur la scène et veillez à ce que les moteurs pas à pas soient suffisamment étendus pour éviter que la pointe ne s’écrase sur le tampon.

4. Exécution du programme AFM

REMARQUE: Le programme AFM est fourni en tant que matériel supplémentaire (AutomatipSoftware2019.pdf). Il nécessite un JPK-Bruker AFM Nanowizard II ou III équipé d’un étage motorisé et d’un logiciel de bureau JPK version 4.3. Le programme a été développé sous Jython (version basée sur python 2.7)

1. Acquisition de données
   1. Centrez la pointe AFM sur le coin gauche des puits de 4,5 x 4,5 μm² (correspondant à la taille de la cellule) à l’aide du microscope optique AFM. Si une autre taille de puits est nécessaire, centrez sur le coin supérieur gauche des puits souhaités.
   2. Effectuer une carte de force de 64 x 64 (plage Z = 4 μm, vitesse de pointe = 90 μm·s^-1,force appliquée 3 à 5 nN) sur une surface de 100 x 100 μm². Sélectionnez Forcer le mode de mappage dans la zone de liste déroulante Mode de mesure. Dans le panneau de mappage de contrôle de force, entrez les paramètres suivants: Rel. Setpoint = 3 à 5 nN; longueur z 4 μm; Mouvement Z: durée constante; temps de prolongation: 0.01s; délai ex. :0; Retard de retr: 0, mode de retard: Force constante, Fréquence d’échantillonnage 2048 Hz; Z boucle fermée décochez; Grille: cochez Image carrée, Rapide 100 μm, lent: 100μm, Décalage X: 0 μm; Décalage Y : 0 μm; angle de grille: 0 degré; Pixels: 64x64; rapport de pixels : 1:1
      Remarque : un résultat typique est illustré à la figure 2. Cette image aidera à mesurer et à vérifier le pas entre deux puits.
   3. Notez les coordonnées du centre du puits en haut à gauche (W1) et du puits en bas à gauche (appelé W2 sur la figure 2). Pour ce faire, faites une boîte carrée autour du puits. La coordonnée du centre de la boîte apparaît sur le panneau gauche du logiciel AFM dans les zones de coordonnées x,y.
   4. Pour ouvrir le logiciel d’automatisation(Automatip_scan.py):dans le logiciel de bureau JPK, cliquez sur avancer dans le menu supérieur et sélectionnez ouvrir le script. Dans la fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez le chemin d’accès vers le fichier de script fourni dans Données supplémentaires (Automatip_scan.py).
   5. Implémentez les valeurs de coordonnées W1 et W2 dans la section Entrées du script Jython (Figure 3). Entrez les coordonnées W1 dans la variable P1 ligne 239 du script et les coordonnées W2 dans la variable P2 ligne 241.
      Remarque : les puits sélectionnés comme coordonnées initiales (W1 et W2) ne doivent pas être trop proches du bord de la zone de balayage. Sinon, l’algorithme de centrage ne s’exécuterait pas correctement car il doit mesurer la hauteur sur la surface PDMS de chaque côté du puits. Pour obtenir un exemple, reportez-vousà la figure 4 .
   6. Attribuez la valeur de hauteur à la variable de hauteur ligne 245 du script.
   7. Entrez la dimension du puits dans la ligne de variable Ws 248. Ceci est connu par la conception des motifs de puits et peut être vérifié sur la même image que celle utilisée pour vérifier le pas(Figure 2).
   8. Écrivez le chemin d’accès au répertoire d’enregistrement à la ligne 251 pour enregistrer les données à l’emplacement souhaité.
   9. Réglez la ligne de la variable totalArea 254 sur le multiple desire "n" de 100 μm (c’est-à-dire la zone de balayage maximale de l’AFM utilisé). Le nombre total de puits qui seront sondés peut être calculé en utilisant cette valeur et le pas : surface de balayage maximale/pas*n².
      REMARQUE : Dans l’exemple de la figure 3,9 zones de 100 x 100 μm2 seront analysées.
   10. Définissez la matrice, la ligne et la colonne des courbes de force (3, 3 ou 4, 4), enregistrées par puits dans la ligne 257 de la variable numScans.
       REMARQUE : Dans l’exemple de la figure 3,une matrice de 3 x 3 = 9 FCs sera enregistrée pour chaque puits.
   11. Exécutez le programme. Cliquez sur le bouton Démarrer.
       Remarque : Le programme exécute d’abord automatiquement un algorithme de centrage pour mieux déterminer le centre des puits W1 et W2 (étape 1). Il acquiert ensuite automatiquement la matrice des courbes de force (FCs) sur chaque puits de la première zone de balayage (étape 2). Lorsque tous les puits de cette zone sont sondés, le script déplace automatiquement la pointe AFM vers le premier puits de la zone de balayage suivante. La pointe est rétractée, l’étage du microscope se déplace vers la zone suivante, la pointe est à nouveau approchée sur le timbre et l’algorithme de centrage est exécuté à nouveau pour se recentre automatiquement sur le premier puits (1') de cette zone (étape 3). La première zone est définie par l’utilisateur, la seconde, est à droite, etc. jusqu’à ce que n soit atteint. La zone n+1 est sous n, n+2 à gauche de n+1, etc. jusqu’à ce que 2n soit atteint. 2n+1 est sous 2n, et 2n+2 est à droite sur 2n, etc. Globalement, la pointe serpentine à travers la superficie totale. Les étapes 2 et 3 sont répétées automatiquement jusqu’à ce que le nombre total "n²" de zones de balayage ait été sondé. La figure 5 présente l’organigramme du programme. Il faut ~ 4 h pour terminer le programme.
2. Analyse des données
   1. Exécutez le script python « Copier les fichiers »(Copy_files_L.py, fourni dans Données supplémentaires) pour organiser les fichiers FCs dans un dossier. Ce script a été développé avec Python 2.7 et le module SciPy. Utilisez le logiciel Visual Studio Code pour ouvrir le script python. Chemin d’entrée dans le dossier général (ligne 67 du script fourni dans les données supplémentaires) et où il sera stocké (ligne 73).
   2. Ouvrez le logiciel de traitement des données du fabricant de l’AFM pour analyser les courbes de force. Dans le menu supérieur Fichier, sélectionnez ouvrir 'lot de courbes de spectroscopie.
   3. Dans la fenêtre de traitement par lots, sélectionnez le processus fourni dans Données supplémentaires (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Sélectionnez la dernière étape du processus et cliquez sur Conserver et appliquer à tous. Toutes les courbes de force recevront le même traitement.
      NOTA : Le procédé utilise l’étalonnage des fichiers FCs pour convertir les courbes de déviation en courbes de force calibrées à Newton; un algorithme de lissage des données est appliqué (moyenne de 3 points consécutifs); la ligne de base est traduite pour reposer sur l’axe zéro; le point de contact est extrapolé et le FC est décalé pour placer le point de contact à la coordonnée (0,0); la flexion du porte-à-faux est soustraite aux FCs, la pente de retrait est ajustée. A la fin du traitement des données, le logiciel génère un fichier qui contient un tableau donnant pour chaque FCs : son nom, Young Modulus, point de contact, force d’adhésion, pentes, etc.
   4. Répéter les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour toutes les expériences. Veillez à enregistrer les données dans différents dossiers (c’est-à-dire : « ...\TREATED\ » et « ...\UNTREATED\ »)
   5. Utilisez le script R fourni dans Données supplémentaires pour tracer des histogrammes et des boîtes à moustaches et effectuer des traitements statistiques ANOVA.
      1. Pour ouvrir le script R (DataAnalisys.R), utilisez le logiciel R studio et chargez les fichiers contenant les informations extraites avec le logiciel de traitement des données (.tsv).
      2. Dans la fenêtre de l’environnement, utilisez le bouton Importer le jeu de données, dans la liste affichée, sélectionnez à partir du texte (readr) et dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez le bouton Navigateur et recherchez le fichier .tsv.
      3. Une fois le fichier chargé, sélectionnez les colonnes (rigidité et adhérence) à inclure pour l’analyse. Pour exécuter tout le code, appuyez sur Ctrl+Alt+R.
         Remarque : le script fonctionne avec 4 jeux de données, considérez deux expériences ayant des cellules non traitées et traitées. Il est possible d’exécuter des blocs du script et de voir comment les variables changent en fonction des fonctions exécutées.

Résultats

Nous avons employé le protocole décrit pour analyser l’effet du caspofungin sur les propriétés biophysiques des albicans opportunistes du microbe pathogène humain opportuniste C. sous sa forme de levure. La caspofungine est une molécule antifongique de dernière chance utilisée lorsque d’autres médicaments sont inefficaces en raison des mécanismes de résistance que les cellules développent vers les antifongiques. Son mécanisme d’action est basé sur l’inhibition de la sous-unité Fks2 du complexe fks1/Fks2 responsa...

Discussion

La principale amélioration apportée par cette méthodologie est une augmentation significative du nombre de cellules mesurées dans un laps de temps déterminé. La contrepartie est une réduction du nombre de points mesurés par cellule. Cela signifie que cette méthode n’est pas conçue pour fournir une analyse détaillée d’une seule cellule. La méthode s’applique uniquement aux cellules qui peuvent tenir dans les puits du tampon PDMS. Le timbre est assez polyvalent, alors qu’il contient des puits de 1,5 x 1,5 μm² ju...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cantilever AFM	Bruker Sondes AFM	MLCT	Les porte-à-faux utilisés étaient étiquetés « C” avec une fréquence de résonance de 7 à 10 kHz et k : 0,01 N/m
Analyse des données AFM	JPK-Bruker	JPK Version de traitement des données minimum 5.1.8	Peut être téléchargé à partir d’un utilisateur JPK-Bruker Boîtes de
Pétri AFM	WPI	FluoroDish FD35-100	Le chauffage a été utilisé pour surveiller les changements de température pendant l’expérience
Microscope à force atomique (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II ou III	l’AFM doit être monté sur un microscope optique inversé avec une platine motorisée
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin a été utilisé avec une concentration de 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Editeur de code	Microsoft	Visual Studio Code version 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassing chambre	Fisherbrand	15594635	L’équipement est utilisé pour dégazer les tampons PDMS pendant environ 50 minutes n’importe quel dessiccateur couplé à une pompe à vide fera l’affaire.
Chauffage de boîte de Pétri	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Il s’agit d’un add-on au JPK/Bruker AFM. Le réchauffeur a été utilisé pour surveiller les changements de température pendant l’expérience
Tampon d’acétate de sodium pH 5,2	Sigma-Aldrich	S7899	La solution contient 18 mM d’acétate de sodium, 1 mM de CaCl2 et 1 mM de MnCl2. Ajustez le pH avec de l’acide acétique glacial. La solution peut être stockée à 4 ° ; C depuis 2 mois
Langage d’analyse statistique	https://www.r-project.org	R version 3.6.1	R est un langage et un environnement pour le calcul statistique et graphique. Il s’agit d’un projet GNU qui est similaire au langage et à l’environnement S
du logiciel d’analyse statistique	https://rstudio.com	R studio version 1.1.463	collaboration entre la Fondation R, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP et d’autres. RStudio et Shiny sont des projets affiliés à la Fondation pour les statistiques en libre accès
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissement dans un ensemble
Yeast Peptone D Broth	Difco	242820
YPD	Agar Difco	DF0427-17-6