Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.
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Article de méthode
Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins
Dans cet article
Résumé
Résumé
En biologie de la reproduction, la révolution biotechnologique qui a commencé avec l’insémination artificielle et la technologie de transfert d’embryons a conduit au développement de techniques de procréation assistée telles que la maturation in vitro des ovocytes (IVM), la fécondation in vitro (FIV) et le clonage d’animaux domestiques par transfert nucléaire de cellules somatiques. IVM est la méthode particulièrement importante. C’est la technologie de plate-forme pour la fourniture d’ovocytes matures et de bonne qualité pour des applications telles que la réduction de l’intervalle de génération chez les espèces commercialement importantes ou en voie de disparition, la recherche sur la reproduction humaine in vitro, et la production d’animaux transgéniques pour les thérapies cellulaires. Le terme qualité des ovocytes inclut sa compétence pour compléter la maturation, être fécondé, ce qui entraîne une progéniture en bonne santé. Cela signifie que les ovocytes de bonne qualité sont primordiaux pour la fécondation réussie, y compris les procédures de FIV. Cela pose de nombreuses difficultés pour développer une méthode de culture fiable qui soutiendrait la croissance non seulement des ovocytes humains, mais aussi d’autres espèces de grands mammifères. La première étape de l’IVM est la culture in vitro des ovocytes. Ce travail décrit deux protocoles pour la culture 3D des ovocytes porcins. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes de modèle 3D (COC) sont encapsulés dans un réseau d’interpénétration de perles fibrine-alginate, dans lequel un mélange de fibrin et d’alginate sont gélifiés simultanément. Dans le second, les COC sont suspendus dans une goutte de particules moyennes et encapsulées avec du propylène fluoré (FEP; un copolymère d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène) pour former des microbioréacteurs définis sous le nom de marbres liquides (LM). Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant ainsi la relation fonctionnelle entre les ovocytes, et les cellules folliculaires environnantes.
Introduction
Le développement de divers systèmes culturels, y compris les systèmes tridimensionnels (3D), vise à fournir des conditions optimales pour la croissance et la maturation des ovocytes isolés des follicules, même aux premiers stades de développement. Ceci est d’une grande importance pour les techniques de procréation assistée (TAR), en particulier compte tenu du nombre croissant de femmes qui sont aux prises avec l’infertilité après le traitement du cancer1. La maturation des ovocytes dans des affections in vitro (IVM) est déjà une technique bien établie principalement utilisée pour la génération d’embryons in vitro aux fins de la reproduction du ....
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Protocole
Les procédures suivantes ont été approuvées par le Comité du bien-être animal de l’Institut de zoologie et de recherche biomédicale de l’Université Jagiellonian.
1. Isolement des complexes de cumulus-ovocytes porcins
- Pour recueillir du matériel pour l’isolement des follicules ovariens, exciser les ovaires porcins des dorures prépubères (environ 6-7 mois, pesant 70 à 80 kg) dans un abattoir local. Choisissez environ 20 ovaires de porc de 10 animaux pour l’isolement des COC dans chaque expérience.
REMARQUE : En supposant que chaque ovaire donne 3 à 5 follicules, le nombre total de follicules varie de 60 à 100. - Placer le....
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Résultats
Dans les COC utilisant les deux systèmes ivm, les cellules granulosas ont adhéré étroitement les unes aux autres, et la plupart des COC récupérés avaient des couches intactes de cellules cumulus (Figure 1A,B). En outre, une proportion importante de cellules cumulus ont été conservées.
Les résultats obtenus à partir de l’analyse de viabilité des COC ont confirmé que les deux systèmes appliqués pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans des cond.......
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Discussion
La capacité de maintenir la croissance in vitro non seulement des ovocytes, mais aussi des cellules cumulus qui l’entourent et en même temps soutenir sa maturation est extrêmement essentielle pour les technologies de reproduction assistée réussies et pour promouvoir la compréhension des interactions cellules somatiques/ovocytes, en particulier chez les espèces qui subissent une croissance folliculaire prolongée comme les êtres humains ou les porcs. Les techniques d’IVM continuellement améliorées deviennent l’outil utile .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs sont très reconnaissants à : dr Waclaw Tworzydlo (Département de biologie du développement et morphologie des invertébrés, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université jagiellonne) pour les installations techniques en TEM; à Mme Beata Snakowska (Département d’endocrinologie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian) pour l’assistance technique; au Département de biologie cellulaire et d’imagerie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japon). Ces travaux ont été soutenus par une subvention 2018/29/N/NZ9/00983 du Centre national des sciences po....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| General | |||
| Antibiotique Antimycosique (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | Concentration finale de 2,5 % pour le milieu de manipulation. 1 % dans PBS (étape 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Manipulation et maturation Medium |
| DPBS (sans Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | une concentration finale de 10 % pour le milieu de manipulation et le milieu de maturation. (étapes : 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7,4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Solution mère (10x, pH 7,4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x concentration finale. D’autres marques peuvent être utilisées |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 flacon de 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Étape 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN( | Étape 2.1) |
| Chlorure de calcium | Sigma-Aldrich | C5670 | (Étape 2.1) |
| Fibrinogène (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Étape 2.2) |
| Alginate de sodium | Sigma-Aldrich | W201502 | (Étape 2.3) à utiliser pour la solution d’alginate |
| marbre liquide | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Examen morphologique | |||
| LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité, pour cellules de mammifères | Thermo Fisher | L3224 | (Étape 4.1.) Fluorescence émise : 494 nm pour la calcéine, 528 nm pour l’EthD-1 ; mesure : 517 nm pour la calcéine, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Montage Medium | Vector Laboratories | H-1000 | montage moyen |
| Examen de l’ultrastructure | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2,5 % de concentration finale (étape 4.2.1.) |
| LR Résine blanche | Sigma-Aldrich | L9774 | (étape 4.2.4.) |
| Bleu de méthylène | Sigma-Aldrich | M9140 | (Étape 4.2.5.) |
| Tétroxyde d’osmium | Sigma-Aldrich | O5500 | (étape 4.2.3.) |
| Cacodylate de sodium trihydraté | Sigma-Aldrich | C0250 | Utilisation pour la préparation d’un tampon de cacodylate de sodium 0,1M (pH 7,2) |
| Acétate d’uranyle | POCH | 868540111 | (Étape 4.2.4.) |
| Specific instruments, outils | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Boîte de Petri | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Table chauffante | SEMIC | D’autres marques peuvent être utilisées | |
| Incubateur | Panasonic | MCO-170AIC-PE | D’autres marques peuvent être utilisées |
| Boîte de Pétri stérile (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Filtres à seringue stériles avec 0,2 & micro ; m | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | D’autres marques peuvent être utilisées |
Références
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in....
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Réimpressions et autorisations
