Article de méthode

Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins

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DOI :

10.3791/61325

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30 juillet 2020

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

Dans cet article

Résumé

Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.

Résumé

En biologie de la reproduction, la révolution biotechnologique qui a commencé avec l’insémination artificielle et la technologie de transfert d’embryons a conduit au développement de techniques de procréation assistée telles que la maturation in vitro des ovocytes (IVM), la fécondation in vitro (FIV) et le clonage d’animaux domestiques par transfert nucléaire de cellules somatiques. IVM est la méthode particulièrement importante. C’est la technologie de plate-forme pour la fourniture d’ovocytes matures et de bonne qualité pour des applications telles que la réduction de l’intervalle de génération chez les espèces commercialement importantes ou en voie de disparition, la recherche sur la reproduction humaine in vitro, et la production d’animaux transgéniques pour les thérapies cellulaires. Le terme qualité des ovocytes inclut sa compétence pour compléter la maturation, être fécondé, ce qui entraîne une progéniture en bonne santé. Cela signifie que les ovocytes de bonne qualité sont primordiaux pour la fécondation réussie, y compris les procédures de FIV. Cela pose de nombreuses difficultés pour développer une méthode de culture fiable qui soutiendrait la croissance non seulement des ovocytes humains, mais aussi d’autres espèces de grands mammifères. La première étape de l’IVM est la culture in vitro des ovocytes. Ce travail décrit deux protocoles pour la culture 3D des ovocytes porcins. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes de modèle 3D (COC) sont encapsulés dans un réseau d’interpénétration de perles fibrine-alginate, dans lequel un mélange de fibrin et d’alginate sont gélifiés simultanément. Dans le second, les COC sont suspendus dans une goutte de particules moyennes et encapsulées avec du propylène fluoré (FEP; un copolymère d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène) pour former des microbioréacteurs définis sous le nom de marbres liquides (LM). Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant ainsi la relation fonctionnelle entre les ovocytes, et les cellules folliculaires environnantes.

Introduction

Le développement de divers systèmes culturels, y compris les systèmes tridimensionnels (3D), vise à fournir des conditions optimales pour la croissance et la maturation des ovocytes isolés des follicules, même aux premiers stades de développement. Ceci est d’une grande importance pour les techniques de procréation assistée (TAR), en particulier compte tenu du nombre croissant de femmes qui sont aux prises avec l’infertilité après le traitement du cancer1. La maturation des ovocytes dans des affections in vitro (IVM) est déjà une technique bien établie principalement utilisée pour la génération d’embryons in vitro aux fins de la reproduction du bétail2. Toutefois, chez la plupart des espèces de mammifères, même si des taux élevés de maturation des complexes cumulus-ovocytes (COC) peuvent être atteints (gamme 60 à 90 %)3, leur compétence en développement est encore insuffisante pour répondre aux besoins. C’est parce que le développement des zygotes obtenus de telle manière même jusqu’au stade blastocyste est faible et après le transfert dans les animaux de substitution leur viabilité à terme est réduite. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître la compétence développementale des embryons obtenus à partir d’ovocytes soumis à la procédure IVM4. Par conséquent, de nouveaux supports de maturation5 sont en cours d’élaboration et diverses périodes de culture in vitro sont testées6,7 avec la supplémentation des médias de culture avec divers facteurs de croissance et molécules8,9.

La première étape de tout système ivm complet est de créer des conditions optimales pour une croissance durable des ovocytes pendant la culture in vitro. La croissance des ovocytes est l’un des indicateurs spécifiques de la capacité de l’ovocyte à reprendre la méiose10,11. En outre, un système de culture in vitro approprié d’ovocytes doit être capable de soutenir sa maturation nucléaire et sa différenciation cytoplasmique12. La morphologie du complexe cumulus-oocytes est un autre indicateur important utilisé dans les cliniques de TAR pour sélectionner le meilleur ovocyte pour les étapes suivantes de la fécondation in vitro (FIV) procédure chez l’homme et le bétail12,13. Parmi les caractéristiques morphologiques des COC considérées sont: le diamètre des ovocytes, sa granulation de cytoplasme et la première intégrité du corps polaire14,15. En outre, le potentiel de développement des ovocytes est corrélé à l’apparence et au compactage des cellules cumulus et au nombre de leurs couches entourant les ovocytes. Très important pour le système approprié de culture in vitro d’ovocytes est également le maintien des cellules d’ovocyte-cumulus interactions appropriées et la stabilité de cytosquelette16,17,18,19. Jusqu’à présent, la croissance in vitro des ovocytes au sein des COC humains a été démontrée20. L’utilisation de COC de vache a également entraîné des naissances vivantes. Ceux-ci ont été isolés des follicules ovariens immatures et ensuite cultivés pendant 14 jours jusqu’à ce que l’ovocyte était suffisamment grand pour subir la procédure de FIV21. De même, les COC isolés des follicules antrals de babouin, soumis à l’IVM après la culture in vitro ont produit des ovocytes capables de réinitier la méiose au stade de la métaphase II avec une structure normale de fuseau apparaissant22. Cependant, dans cette étude, les auteurs n’ont pas essayé de les fertiliser. Néanmoins, de tels résultats indiquent qu’une procédure similaire pourrait être appliquée non seulement à ces espèces particulières de mammifères, mais aussi aux cumulus-oocytes humains obtenus à partir de follicules ce qui devrait permettre d’obtenir des ovocytes de bonne qualité adaptés à une technique de FIV réussie.

Les résultats décrits ci-dessus ont été obtenus avec l’application des protocoles conventionnels d’IVM pendant lesquels les ovocytes ont été cultivés dans les systèmes bidimensionnels (2D). La procédure de routine dans les systèmes de culture 2D couvre les ovocytes, immergés dans une goutte d’un milieu de culture approprié, avec de l’huile minérale23,24. On suppose qu’une superposition d’huile pendant la culture in vitro des ovocytes sert à prévenir l’évaporation des liquides, assurant ainsi le maintien d’un pH approprié et d’une pression osmotique dans la culture. Bien qu’un tel système de culture 2D permette d’obtenir, même jusqu’à 87% des ovocytes de porc matures25, il a été prouvé que la superposition d’huile minérale provoque une diffusion substantielle de matières liposolubles qui sont nécessaires pour le développement approprié des ovocytes26. En outre, en raison des stéroïdes (progestérone et oestrogènes) la diffusion dans l’huile minérale pendant la culture d’ovocytes, un retard de maturation nucléaire et la réduction de la réalisation de compétence développementale des ovocytes de porc a été observée. Cela peut entraîner l’obtention d’un petit nombre de zygotes, qui sont en outre caractérisés par une faible capacité de développement au stade du blastocyste et par une faible viabilité après transfert dans les animaux receveurs27. Par conséquent, des tentatives sont faites pour accroître la compétence développementale des embryons dérivés des ovocytes reçus après la procédure ivm, en créant des conditions optimales pour atteindre la maturité cytoplasmique et nucléaire des ovocytes cultivés avec des CC comme complexes, en particulier en utilisant des systèmes tridimensionnels (3D). Divers systèmes innovants de culture in vitro 3D ont été développés au cours des deux dernières décennies28,29. Ceux-ci ont été conçus pour maintenir l’organisation spatiale naturelle des cellules et pour éviter leur aplatissement dans les plats de culture ce qui ne peut pas être réalisé dans les cultures 2D traditionnelles. L’activité structurelle et fonctionnelle des COC cultivés peut être assurée par le maintien de leur architecture appropriée et la communication non perturbée par des jonctions d’écart entre les différents compartiments30. La pertinence des bio-échafaudages pour la culture in vitro 3D des complexes cumulus–oocytes a été évaluée à l’aide de biomatériaux naturels tels que divers composants de la matrice extracellulaire (ECM; collagène et acide hyaluronique)31 ou polymères inertes (alginate)32. Ces tentatives testées chez plusieurs espèces ont apporté des résultats prometteurs en termes de reprise de la méiose oocyte et la réalisation de leur pleine compétence33,34,35. Toutefois, jusqu’à présent, aucun système 3D adapté à la maturation des COC isolés des grands animaux domestiques, y compris les porcs, n’a été mis au point.

Ce travail décrit deux protocoles qui peuvent être utilisés pour la culture 3D des COC porcins. Le premier protocole décrit l’encapsulation dans les perles fibrine-alginate (FAB). FAB peut être formé par mélange simultané d’une solution d’alginate et de fibrine, qui subissent un processus synchrone de gelation. Cette combinaison offre un environnement mécanique dynamique car les deux composants contribuent à la rigidité de la matrice. Une solution similaire a été utilisée précédemment pour la culture des follicules ovariens de souris et la maturation36. Dans le cas du protocole présenté, pour éviter la dégradation prématurée du réseau alginate-fibrine, des concentrations appropriées plus élevées de solution de chlorure de calcium sont utilisées, assurant un processus de gelation rapide et stable. L’environnement mécanique dynamique crée des conditions similaires à celles-ci dans l’environnement intra-folliculaire naturel dans lequel les COC résident et augmentent en taille. En outre, les travaux montrent les résultats représentatifs des systèmes de culture 3D des COC, dans lesquels ceux-ci sont suspendus dans une goutte de milieu et encapsulés avec du propylène d’éthylène fluoré (FEP; un copolymère de particules en poudre d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène), pour former des microbioréacteurs (Billes liquides, LM). LM sont une forme de bioréacteur 3D qui ont été précédemment montrés pour soutenir, entre autres, la croissance des micro-organismes vivants37, sphéroïdes tumorales38 et cellules souches embryonnaires39. LMs ont également été utilisés avec succès pour la culture ooccytes demoutons 40. Dans la plupart des expériences utilisant des LM, les bioréacteurs ont été préparés à l’aide de polytétrafluoroéthylène (PTFE) lit en poudre avec une taille de particules de 1 μm41. Le protocole présenté utilise fep, qui est très similaire dans la composition et les propriétés aux fluoropolymères PTFE. Mais fep est plus facilement formable et plus doux que PTFE et ce qui est particulièrement important, il est très transparent.

Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant leur relation fonctionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires environnantes.

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Protocole

Les procédures suivantes ont été approuvées par le Comité du bien-être animal de l’Institut de zoologie et de recherche biomédicale de l’Université Jagiellonian.

1. Isolement des complexes de cumulus-ovocytes porcins

  1. Pour recueillir du matériel pour l’isolement des follicules ovariens, exciser les ovaires porcins des dorures prépubères (environ 6-7 mois, pesant 70 à 80 kg) dans un abattoir local. Choisissez environ 20 ovaires de porc de 10 animaux pour l’isolement des COC dans chaque expérience.
    REMARQUE : En supposant que chaque ovaire donne 3 à 5 follicules, le nombre total de follicules varie de 60 à 100.
  2. Placer les ovaires dans un thermos avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4; 38 °C) contenant 1% d’AAS. Assurez-vous que le matériel expérimental est transporté au laboratoire dans un délai de 1 h où il est rincé deux fois avec des PBS stériles contenant des antibiotiques.
  3. Après le rinçage des ovaires, transférez-les dans le bécher rempli de milieu HM et rangez-les dans un incubateur à 38 °C pour le temps de toutes les manipulations.
    REMARQUE : Pour obtenir des résultats optimaux lors de la manipulation des ovocytes, effectuer toutes les procédures en milieu DMEM/F12 (support de manutention, HM) avec l’ajout d’une solution antibiotique/antimycotique (AAS) de 2,5 % et de sérum bovin foetal (FBS) et contrôler le pH au niveau co2 dans l’environnement, sur une table chauffante avec contrôle de la température (38 °C) et sous le capot de débit laminaire pour minimiser la contamination bactérienne.
  4. À partir de grands follicules porcins (6-8 mm de diamètre) recueillir le liquide folliculaire (FF) par aspiration et centrifugation à 100 x g pendant 10 min à température ambiante. Après cela, filtrer le supernatant à l’aide de seringues stériles fixées à 0,2 μm de filtres à membrane et casser le gel à -80 ° C.
    REMARQUE : Utilisez une seringue à insuline (u- 40) à l’aspiration du liquide folliculaire.
  5. Assurez-vous que seuls les follicules sains de taille moyenne (4-6 mm de diamètre) sont sélectionnés pour l’isolement des COC42.
    NOTE : Les COC de grade I, possédant un ovocyte intact et rond avec ooplasme homogène et cumulus compacts multicouches (au moins 3-4) sont considérés comme appropriés pour d’autres procédures 3D IVM43.
  6. Pour isoler les COC, transférer 2 à 3 ovaires dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm de diamètre remplie de HM. Isoler les COC des follicules de taille moyenne en suivant l’une des procédures ci-dessous.
    1. Coupez doucement la surface des follicules ovariens saillants à l’aide d’une lame chirurgicale stérile 15C. Cela provoquera le liquide folliculaire avec COC à s’écouler dans la boîte de Pétri.
    2. Apirate le contenu folliculaire à l’aide de l’aiguille de 28 G ayant une taille de 5/8 " attaché à une seringue jetable et le transférer dans la boîte de Pétri.
      REMARQUE : Jetez les restes de tissu ovarien. Les étapes ultérieures de l’isolement sont effectuées sous un stéréomicroscope.
  7. Préparer des boîtes de Pétri fiv de 3 à 5 60 mm.
    1. Ajouter 1 mL de HM aux puits centraux et placer 3 à 4 gouttes de HM (50 μL par goutte) dans leurs anneaux extérieurs.
    2. Puis, à l’aide d’une micropipette en polycarbonate, déplacez les COC intacts vers des gouttes de HM dans les anneaux extérieurs pour les rincer brièvement pendant 3-4 fois.
    3. À la fin, les transférer individuellement dans le puits central. Conservez ces plaques de FIV dans un incubateur pour d’autres procédures.
  8. Une fois les COC collectés, effectuez l’étape finale de sélection en les attribuant au hasard dans deux protocoles d’encapsulation IVM différents énumérés ci-dessous.

2. Encapsulation dans les perles d’hydrogel fibrine-alginate

  1. Préparer 1 ml de thrombine de 50 UI/mL dans une solution saline tamponnée par tris (SCT; pH 7,4) avec 100 mM CaCl2 dans un tube de microcentrifuge stérile de 2,0 m L.
  2. Préparer la solution de stock de fibrinogène (50 mg/mL dans le SCT) et la garder congelée.
    REMARQUE : Pour éviter l’agglutination lors de la dissolution du fibrinogène dans le SCT, chauffer le SCT à 37 °C.
    1. Le jour de la procédure, décongeler lentement sur la glace et juste avant que l’utilisation apporte à la température ambiante.
  3. Juste avant l’utilisation mix à un rapport 1:1 0,5% solution alginate et 50 mg/mL fibrinogène solution pour obtenir enfin 2 mL (FA). Dans un tube stérile de microcentrifuge vortex doucement le mélange. Évitez de faire des bulles.
  4. Pour préparer des « chambres d’incubation », appliquez de fines bandes de films de paraffine sur les lames de microscope en verre.
    REMARQUE : Essuyez les diapositives avec 70 % d’EtOH avant utilisation. Une chambre d’incubation est formée de deux diapositives. Pour les séparer, placez des espaceurs de 3 mm sur l’un d’eux.
  5. Pipette 7,5 μL gouttes du mélange FA sur ce film de paraffine enduit toboggan en verre, qui a également des espaceurs de séparation. Sur un point de diapositive 8-10 gouttes, disposés en deux rangées.
  6. Transférer, à l’aide d’une micropipette, 3-5 COCs avec un volume minimum (jusqu’à 5 μL) de milieu de maturation (MM), et les placer précisément au centre de la baisse FA. Cette procédure exige de bonnes compétences manuelles et de précision.
    REMARQUE : Le milieu de maturation (MM) se compose de DMEM/F12, complété par 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10 % FBS et 50 % de liquide folliculaire porcin (FF) recueillis à l’étape 1.4.
  7. Ajouter 7,5 μL de thrombine/Ca2+ sur chaque goutte FA, juste pour les couvrir. Il n’est pas nécessaire de les mélanger parce que le gel se forme presque instantanément.
  8. Couvrez la chambre d’incubation en appliquant la deuxième diapositive en verre préalablement préparée aux capsules FA. Avec un mouvement très prudent mais ferme, retourner la chambre à l’envers et la placer dans une boîte de Pétri de 100 mm doublée de papier filtre humide pour éviter le séchage.
  9. Ensuite, transférer la boîte de Pétri à l’incubateur de CO2 à 5 % (38 °C) pendant environ 5 à 7 min. Après cela, les capsules de FA deviendront nuageuses en raison de la gelation simultanée de fibrine et d’alginate.
  10. Transférer les capsules FA dans 96 plaques de puits (une capsule par puits) contenant 100 μL MM par puits.
    NOTE : Pour ne pas endommager les capsules formées de FA, exécutez cette étape soigneusement avec l’utilisation des forceps chirurgicaux.
  11. Tous les 2 jours, remplacer la moitié du MM (50 μL) par un mm frais prééquilibré. Image COC à l’aide d’un microscope lumineux inversé (à grossissement 10x).
    NOTE: Conditions culturelles pour les COC CULTURE FA: 38 °C, sous une atmosphère de CO2 de 5% et une humidité relative 95%. Après 4 jours d’IVM, les hydrogels apparaissent presque clairs en raison de la dégradation progressive du composant de fibrine. L’alginate restant doit être dégradé enzymatiquement - par l’alginate-lyase, une enzyme d’origine végétale qui dégrade spécifiquement l’alginate et n’affecte pas les cellules animales.
    1. Retirer le MM des puits contenant les capsules et ajouter 100 μL de 10 lyase d’alginate d’UI/mL dans DMEM. Laissez la plaque de culture dans l’incubateur pendant 25-30 min.
    2. Retirer les COC des capsules dissoutes.
      REMARQUE : Ceci peut être fait avec une pointe de pipette coupée.
    3. Après plusieurs lavages dans un DMEM frais, transférer les COC dans l’anneau intérieur d’un plat de FIV (5-10 COC par plat) contenant pbs. Maintenant, utilisez-les pour d’autres analyses morphologiques ou biochimiques.

3. Encapsulation dans les microbioréacteurs d’éthylène fluoré (FEP) super-hydrophobes.

REMARQUE : Assurez-vous que toutes les procédures de M IVM sont effectuées sur une table contrôlée par thermostat et que les COC sont maintenus à 38 °C tout au long de leur manipulation.

  1. Préparer une boîte de Pétri de 30 mm contenant 5 g de poudre fep taille moyenne des particules de 1 μm.
    REMARQUE : Il est important d’utiliser de la poudre fep fraîche. Le FEP réutilisé a tendance à s’agréger et forme des amas.
  2. Distribuer une seule gouttelette de MM (~30 μL en volume) contenant 3-5 COC isolés à l’étape 1.6 sur le lit de la poudre FEP. Faites pivoter la plaque doucement dans un mouvement circulaire pour s’assurer que ces particules couvraient complètement la surface de la goutte liquide et des billes liquides formées (LM).
  3. Ramasser formé LM à l’aide d’une pipette avec 1 000 μL pointe.
    REMARQUE : Coupez la pointe de la pipette au bord, pour l’accommoder au diamètre du LM (4-5 mm). Le diamètre approximatif d’une telle pointe préparée doit être légèrement supérieur à celui de la LM.
  4. Préparer plusieurs boîtes de Pétri FIV de 60 mm. Ajouter 3 à 4 mL d’eau stérile aux anneaux extérieurs pour préparer la chambre d’humidité. Ensuite, placez un LM dans le puits central.
    NOTE: Cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision - si le marbre est placé négligemment ou tombe même d’une hauteur basse, il sera détruit.
  5. Incuber les billes pendant 4 jours à 38 °C dans un incubateur de CO2 de 5 %.
    1. Modifier le milieu quotidiennement suivant la procédure : appliquer 30 μL de MM sur chaque LM, ce qui provoquera leur propagation car le contact liquide direct perturbe l’hydrophobicité des poudres fep enduites. Lorsque la teneur en marbre se dissout, transférez les COC libérés du bioréacteur à une goutte de MM frais dans la boîte de Pétri.
      REMARQUE : Pour transférer précisément les COC libérés, utilisez une micropiplette en polycarbonate.
    2. Après plusieurs lavages en MM (3-4 fois) pour enlever les particules FEP, les transférer avec 30 μL de MM frais sur le lit en poudre FEP. Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour s’assurer que les particules de poudre recouvrent complètement la surface de la goutte liquide et forment un nouveau LM.
    3. Suivez ensuite la procédure des étapes 3.3-3.4.
      REMARQUE : Le revêtement transparent de la poudre FEP permet de surveiller la teneur en LM à l’aide du microscope léger.

4. Caractérisation des COC après la procédure IVM 96-h à l’aide de deux systèmes 3D

REMARQUE : Pour déterminer l’efficacité des systèmes IVM utilisés, marquez les COC morphologiquement au microscope léger. En outre, utilisez l’étiquetage fluorescent double avec calcéine AM et homodimer d’éthidium (EthD-1) colorants pour l’analyse de la viabilité des COC44.

  1. Examen morphologique des ovocytes après l’IVM par microscopie légère et fluorescence.
    1. Laver les COC (ceux qui proviennent de la culture utilisant FAB et ceux de LM) avec 38 °C 1x PBS.
      REMARQUE : Pour faciliter la manipulation des COC et non pour les endommager pendant la procédure de coloration, utilisez une plaque de puits 96 ou 48 et effectuez chaque étape de coloration en transférant les COC vers des puits ultérieurs.
    2. Incuber en 100 μL de 1,6 m M de calcein AM et 5,5 mM EthD-1 pendant 30–45 min à 37 °C. Diluer les deux substances dans 1x PBS.
      REMARQUE : Étant donné qu’il s’agit d’un test de fluorescence bicolore, effectuez cette étape dans l’obscurité.
    3. Après l’incubation, laver le COC deux fois en PBS, puis l’immerger dans un support de montage antifade conçu pour empêcher le photobleaching rapide des protéines fluorescentes et des colorants fluorescents (Table des matériaux).
      REMARQUE : Protégez les bords du verre de couverture contre le séchage avec n’importe quel vernis à ongles.
    4. Visualiser des échantillons tachés sous un microscope à balayage laser confocal.
      REMARQUE : Pour exciter la fluorescence des deux sondes (c.-à-d. la calcéine et l’homodimmer-1 d’ethidium, EthD-1) accordent un laser à argon à 488nm. La fluorescence émise est séparée par un triple filtre dichroique 488/561/633, puis mesurée à 505−570 nm pour le filtre vert (calcéine), et à 630−750 nm pour le rouge (EthD-1).
    5. Classez les COC en quatre catégories, en utilisant la classification modifiée qui est appliquée aux follicules ovariens en culture basée sur l’imagerie confocale de fluorescence en fonction du pourcentage de cellules granulosa mortes35.  V1 : COC dont les C. sont 100 % viables; V2: COC avec 10% des CC morts; V3 : COC avec 10 à 50 % des CC morts; V4: COC avec 50% des CC morts.
      REMARQUE : Techniquement, il est difficile d’évaluer la viabilité de l’ovocyte avec l’essai mort-vivant; par conséquent, il faut l’estimer, par exemple, en analysant l’ultrastructure ou l’activité mitochondriale.
  2. Examen de l’ultrastructure des ovocytes après l’IVM par microscopie électronique de transmission.
    1. Fixer les COC dans 100 μL 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,2, température ambiante) pendant 2 h.
    2. Immerger les COC dans un tampon de cacodylate de sodium de 100 μL de 0,1 M (nuit à 4 °C) et rincer dans le même tampon.
    3. COC postfixe avec 1% de tétroxide d’osmium dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (température ambiante) pendant 1 h.
    4. Après coloration dans l’acétate d’uranyl (1 %), déshydratent les COC dans une série croissante de dilutions d’éthanol (50 %, 60 %, 70 %, 90 % et 100 %), les infiltrent toute la nuit à température ambiante, suivies de deux brefs changements de résine et, enfin, les incorporent dans LR White.
    5. Ensuite, pour orienter et évaluer les échantillons, tachez les sections semi-minces (1 μm) avec le bleu de méthylène/azur II.
    6. Enfin, examinez les sections ultrathin, doublement tachées au niveau ultrastructural avec le TEM.

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Résultats

Dans les COC utilisant les deux systèmes ivm, les cellules granulosas ont adhéré étroitement les unes aux autres, et la plupart des COC récupérés avaient des couches intactes de cellules cumulus (Figure 1A,B). En outre, une proportion importante de cellules cumulus ont été conservées.

Les résultats obtenus à partir de l’analyse de viabilité des COC ont confirmé que les deux systèmes appliqués pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans des cond...

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Discussion

La capacité de maintenir la croissance in vitro non seulement des ovocytes, mais aussi des cellules cumulus qui l’entourent et en même temps soutenir sa maturation est extrêmement essentielle pour les technologies de reproduction assistée réussies et pour promouvoir la compréhension des interactions cellules somatiques/ovocytes, en particulier chez les espèces qui subissent une croissance folliculaire prolongée comme les êtres humains ou les porcs. Les techniques d’IVM continuellement améliorées deviennent l’outil utile ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs sont très reconnaissants à : dr Waclaw Tworzydlo (Département de biologie du développement et morphologie des invertébrés, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université jagiellonne) pour les installations techniques en TEM; à Mme Beata Snakowska (Département d’endocrinologie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian) pour l’assistance technique; au Département de biologie cellulaire et d’imagerie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japon). Ces travaux ont été soutenus par une subvention 2018/29/N/NZ9/00983 du Centre national des sciences pologne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
General
Antibiotique Antimycosique (100x) 100mlThermo Fisher15240062Concentration finale de 2,5 % pour le milieu de manipulation. 1 % dans PBS (étape 1.2)
DMEM/F12 (500ml)Sigma-AldrichD8062Manipulation et maturation Medium
DPBS (sans Ca, Mg), 1x, 500mlThermo Fisher14190144
FCS (100 ml)Thermo Fisher16140063une concentration finale de 10 % pour le milieu de manipulation et le milieu de maturation. (étapes : 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7,4) 500mlThermo Fisher10010023
TBS Solution mère (10x, pH 7,4) 500 mlCayman Chemicals6002321x concentration finale. D’autres marques peuvent être utilisées
Maturation Medium
hCG (1 flacon de 10 000 U)Sigma-AldrichCG10
PMSGBioVendorRP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate LyaseSigma-AldrichA1603(Étape 2.11.1)
ThrombinSigma-AldrichT9326-150UN(Étape 2.1)
Chlorure de calciumSigma-AldrichC5670(Étape 2.1)
Fibrinogène (250mg)Sigma-AldrichF3879(Étape 2.2)
Alginate de sodiumSigma-AldrichW201502(Étape 2.3) à utiliser pour la solution d’alginate
marbre liquide
FEPDyneon GmbH 3M AdMDA-66670
Examen morphologique
LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité, pour cellules de mammifèresThermo FisherL3224(Étape 4.1.) Fluorescence émise : 494 nm pour la calcéine, 528 nm pour l’EthD-1 ; mesure : 517 nm pour la calcéine, 617 nm - EthD-1
VECTASHIELD Antifade Montage MediumVector LaboratoriesH-1000montage moyen
Examen de l’ultrastructure
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG58822,5 % de concentration finale (étape 4.2.1.)
LR Résine blancheSigma-AldrichL9774(étape 4.2.4.)
Bleu de méthylèneSigma-AldrichM9140(Étape 4.2.5.)
Tétroxyde d’osmiumSigma-AldrichO5500(étape 4.2.3.)
Cacodylate de sodium trihydratéSigma-AldrichC0250Utilisation pour la préparation d’un tampon de cacodylate de sodium 0,1M (pH 7,2)
Acétate d’uranylePOCH868540111(Étape 4.2.4.)
Specific instruments, outils
30 mm Pteri dishTPP93040
60 mm IVF Boîte de PetriFalcon353653
Ez-Grid Premium Cell Handling PipettorRI Life Sciences8-72-288
Ez-TipRI Life Sciences8-72-4155/20
Table chauffanteSEMICD’autres marques peuvent être utilisées
IncubateurPanasonicMCO-170AIC-PED’autres marques peuvent être utilisées
Boîte de Pétri stérile (10 cm)NEST Biotechnology704002
Filtres à seringue stériles avec 0,2 & micro ; mGOOGLAB SCIENTIFICGB-30-022PES
ThermosQuechua5602589D’autres marques peuvent être utilisées

Références

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