Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Résumé

Ce protocole fournit une méthode pour digérer des yeux entiers dans une suspension cellulaire simple aux fins de l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres afin d’identifier des populations phagocytiques mononucléaires oculaires spécifiques, y compris les monocytes, les microglies, les macrophages et les cellules dendritiques.

Résumé

Le système immunitaire inné joue un rôle important dans la pathophysiologie oculaire, y compris l’uvéite, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les cellules immunitaires innées, en particulier les phagocytes mononucléaires, expriment des marqueurs de surface cellulaire qui se chevauchent, ce qui fait de l’identification de ces populations un défi. La cytométrie d’écoulement multi-paramètres permet l’analyse simultanée et quantitative de plusieurs marqueurs de surface cellulaire afin de différencier les monocytes, les macrophages, les microglies et les cellules dendritiques dans les yeux de souris. Ce protocole décrit l’enucleation des yeux entiers de souris, la dissection oculaire, la digestion dans une suspension de cellule simple, et la coloration de la suspension de cellule simple pour des marqueurs myéloïdes de cellules. En outre, nous expliquons les méthodes appropriées pour déterminer les tensions à l’aide de contrôles de couleur unique et pour délimité les portes positives en utilisant la fluorescence moins un contrôle. La principale limitation de la cytométrie du flux multi-paramètres est l’absence d’architecture tissulaire. Cette limitation peut être surmontée par la cytométrie d’écoulement multi-paramètres des compartiments oculaires individuels ou la coloration complémentaire d’immunofluorescence. Cependant, l’immunofluorescence est limitée par son manque d’analyse quantitative et la réduction du nombre de fluorophores sur la plupart des microscopes. Nous décrivons l’utilisation de la cytométrie multi-paramétrique de flux pour fournir l’analyse fortement quantitative des phagocytes mononucléaires dans la néovascularisation choroïdienne laser-induite. En outre, la cytométrie de flux multi-paramètres peut être utilisée pour l’identification des sous-ensembles de macrophages, la cartographie du destin et le tri cellulaire pour les études transcriptomiques ou protéomiques.

Introduction

Le système immunitaire inné comprend plusieurs types de cellules qui stimulent l’activation complète et l’inflammation. Les cellules immunitaires innées comprennent les cellules tueuses naturelles (NK), les mastocytes, les basophiles, les éosinophiles, les neutrophiles et les phagocytes mononucléaires. Les phagocytes mononucléaires, qui sont composés des monocytes, des macrophages, et des cellules dendritiques, ont été impliqués dans la pathophysiologie des conditions ophtalmiques multiples comprenant l’uvéite, la rétinopathie diabétique, et la dégénérescence maculaire relative à l’âge (AMD)¹. Dans ce protocole, nous nous concentrerons sur l’identification des phagocytes mononucléaires utilisant l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres dans un modèle de souris de AMD néovasculaire^2. Ce protocole est adaptable pour les modèles murins de rétinopathie diabétique et/ou d’uvéite, mais une dissection oculaire plus étendue est recommandée en raison de la nature systémique de ces maladies.

Les phagocytes mononucléaires expriment des marqueurs de surface cellulaire qui se chevauchent. Les macrophages et les microglies résidents de tissu de longue durée proviennent de l’ancêtre érythromyéloïde dérivé du sac^{jaune 3,}tandis que le recyclage des macrophages et des cellules dendritiques se différencient de l’ancêtre de cellules dendritiques macrophages dérivé de la^{moelle osseuse 4}. Les marqueurs de surface de cellules de souris communs aux monocytes, aux macrophages, et aux cellules dendritiques incluent CD45, CD11b^5,F4/80^6,Cx3cr1^7,et le marqueur intracellulaire Iba1^8. Afin de surmonter ce défi, l’analyse transcriptomique des macrophages, des monocytes et des cellules dendritiques de tissus multiples définit CD64 comme un marqueur de surface cellulaire spécifique au macrophage⁶. Des macrophages ont été décrits dans l’iris, le choroïde, le corps ciliaire, et le nerf optique dans les yeux sains^3. Alternativement, l’identification des cellules dendritiques est plus difficile; la méthode la plus spécifique d’identification des cellules dendritiques nécessite une cartographie du destin à l’aide de la souris reporter Zbtb46-GFP⁹. Indépendamment de cette ligne de reporter, l’expression de CD11c et MHCII en conjonction avec l’absence de CD64 peut identifier les cellules dendritiques^{potentielles 6,10}. Des cellules dendritiques ont été identifiées dans la cornée, la conjonctive, l’iris, et le choroïde dans les yeux^{normaux 11.} Les microglies sont des macrophages spécialisés situés dans la rétine, protégés par la barrière céphalo-rétinienne, et dérivés des cellules progénitrices de sac^{jaune 12.} En conséquence, les microglies rétiniennes peuvent être différenciées des macrophages monocyte-dérivés par leurs niveaux faibles de l’expression de CD45¹³ et des niveaux élevés de Tmem119, qui est disponible comme anticorps de cytométrie de flux^14. Lors de l’activation des microglies, cependant, CD45 peut être jusqu’à réglementé¹⁵ et Tmem119 peut être^{sous-réglementé 3}, démontrant la complexité de la biologie des microglies et cela est probablement pertinent à la fois dans AMD et son modèle de souris. Enfin, les monocytes peuvent être divisés en au moins deux sous-types, y compris classique et non classique. Les monocytes classiques affichent CCR2⁺Ly6C^hauteCX3CR1^faible expression, et les monocytes non classiques démontrent CCR2^-Ly6C^basmarqueurs élevés CX3CR1 ⁵.

En raison de la nécessité de l’analyse quantitative de l’expression des marqueurs, c’est-à-dire des niveaux élevés par rapport aux niveaux faibles/faibles, la cytométrie du flux multi-paramètres est la méthode idéale pour la discrimination entre les monocytes, les macrophages, les microglies et les cellules dendritiques dans l’œil et d’autres tissus. D’autres avantages incluent l’identification des sous-populations, la capacité d’utiliser le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier les populations cellulaires pour l’analyse transcriptomique ou protéomique, et la cartographie du sort. L’inconvénient majeur de la cytométrie du flux multi-paramètres est le manque d’architecture tissulaire. Ceci peut être surmonté par la dissection ophtalmique dans les divers sous-commandements oculaires : cornée, conjonctive, iris, lentille, rétine, et complexe choroïde-sclera. En outre, l’imagerie confirmatoire d’immunofluorescence peut être exécutée, mais est limitée par le nombre de marqueurs et le manque de quantitation robuste.

Les études d’association à l’échelle du génome ont établi un lien entre plusieurs gènes complémentaires et la^{D AMD 16}. L’activation de complément mène à la production d’anaphylatoxine, au recrutement de leucocyte, et à l’inflammation qui en résulte. En complément des souris déficientes en récepteurs, les lésions au laser réduisent le recrutement de phagocytes mononucléaires et la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV)^{zone 17}. De même, le récepteur de chimiokine de motif de C-C 2 (CCR2) souris de KO, qui est déficient dans le recrutement de monocyte au tissu, démontre à la fois le recrutement mononucléaire diminué de phagocyte et la zone induite par laser de CNV^18. Ces données relient le complément et les phagocytes mononucléaires avec le CNV expérimental et peut-être l’AMD néovasculaire. À l’appui de cette association, les récepteurs de complément sont dysregulated sur des monocytes périphériques de sang dans les patients présentant l’AMD^{néovasculaire 19,20.} Ces données démontrent une forte association entre amd et phagocytes mononucléaires.

Dans ce manuscrit, nous utiliserons le modèle expérimental de CNV induit par laser pour caractériser les populations mononucléaires de phagocyte dans l’oeil de souris utilisant la cytométrie de flux multi-paramètres. Le CNV induit au laser est le modèle standard de souris de la DMO néovasculaire, qui a démontré l’efficacité de la thérapie néovasculaire actuelle de la DMO de première^{ligne 21}. Ce protocole décrit l’enucleation des yeux de souris, la dissection oculaire, la digestion en une seule suspension cellulaire, la coloration des anticorps, la détermination des tensions laser à l’aide de commandes de couleur unique, et la stratégie de gating utilisant la fluorescence moins un (FMO) contrôles. Pour une description détaillée du modèle CNV induit au laser, veuillez consulter une publication précédente²². En utilisant ce protocole, nous définirons les microglies, les monocytes, les cellules dendritiques et les populations de macrophages. De plus, nous utiliserons le MHCII et le CD11c pour définir davantage les sous-ensembles de macrophages dans le modèle CNV induit par laser.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. Les souris C57BL/6 ont été logées dans un centre de barrière du Center for Comparative Medicine de l’Université Northwestern (Chicago, IL). Tous les animaux ont été logés dans 12/12 h cycle lumière/obscurité avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.

1. Collection de tissus oculaires

1. Sacrifiez des souris C57BL/6J âgées de 10 à 12 semaines de l’un ou l’autre sexe en utilisant une administration réglementée de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la souris ne réponde plus et n’inspire plus. Effectuer une dislocation cervicale ou une autre méthode secondaire approuvée pour assurer l’euthanasie.
   REMARQUE : La perfusion transcardique peut être exécutée pour enlever les leucocytes circulants qui ne sont pas dans les tissus oculaires. Dans cette expérience, la perfusion systémique ne réduit pas le nombre de microglies, de monocytes, de macrophages ou de cellules dendritiques détectées dans des yeux entiers non traités ou traités au laser. Par conséquent, la majorité de ces types de cellules sont situés dans les tissus ophtalmiques et cette étape est facultative.
2. Pour enucleate yeux, poussez vers le bas près de la prise d’oeil tout en plaçant une paire de forceps incurvés doucement sous l’oeil pendant qu’il se tient hors de la prise. Pincer les pincements fermés sous l’œil sans presser l’œil réel. Déloger l’œil de la conjonctive environnante (veuillez consulter la publication antérieure)²³.
3. Tirez l’œil latéralement jusqu’à ce que le nerf optique soit la seule connexion restante pour détacher l’œil. Le nerf optique se coupe souvent avec tension, mais un petit ciseaux est parfois nécessaire pour couper le nerf optique. Placez l’œil dans la solution saline tamponnée (HBSS) froide de Hank avec du calcium et du magnésium dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL.

2. Digestion des tissus oculaires

1. Préparez le tampon de digestion contenant 0,1 mg/mL d’enzyme de digestion et 0,2 mg/mL de DNase dans le HBSS froid. Reconstituer 5 mg d’enzyme de digestion dans 2 mL d’eau stérile au départ. Préparer une dilution initiale de 10 mg/mL de DNase dans HBSS. Pour chaque 10 mL du tampon de digestion (suffisant pour 3 animaux) mélanger 9,4 mL de HBSS froid avec 0,4 mL d’enzyme de digestion reconstituée et 0,2 mL de DNase I dilué.
   REMARQUE : Ces concentrations ont été empiriquement déterminées au cours de multiples expériences afin de fournir des niveaux optimaux de coloration des anticorps des cellules individuelles, tout en réduisant la mort cellulaire. Collagène D a été essayé comme une alternative à l’enzyme de digestion avec une viabilité cellulaire réduite et diminué CD45⁺ cellules. S’il vous plaît voir discussion pour plus de détails concernant le processus itératif pour optimiser la digestion.
2. Sous un microscope disséquant au grossissement total de 10x, enlevez la conjonctive restante et le nerf optique utilisant les forceps fins et les ciseaux de ressort dans le HBSS froid.
3. Déplacez les yeux propres vers un plat sec disséquant ou un petit bateau de pesage. Injecter 0,15-0,20 mL/œil de tampon de digestion via une seringue munie d’une aiguille de 30 G dans la cavité vitreuse après que deux plaies perforantes ont été faites dans l’œil par l’axe visuel et à 90° de cette première blessure pour l’évacuation tampon de digestion.
4. Hacher les yeux entiers à l’aide de ciseaux à ressort et de forceps fins avec tous les morceaux de moins de 0,5 mm x 0,5 mm. Dissocier le tissu de lentille avec la perturbation mécanique émoussée par des forceps pour empêcher des bouts obstruants de pipette dans les étapes suivantes. Pour chaque échantillon, rincer les forceps et les ciseaux chacun avec 0,75 mL de tampon de digestion dans un petit plat. Utilisez un nouveau plat pour chaque échantillon.
5. Transférer le contenu du plat dans un tube de dissociation sur la glace à l’aide de la pipette P1000 en prenant soin de ne pas perdre de matière dans le transfert de pipette. Rincer le plat avec 1,5 mL supplémentaire de tampon de digestion, ce qui porte le volume total dans le tube de dissociation à 3,25-3,50 mL.
6. Placez le tube de dissociation inversé sur le dissociateur électronique et exécutez le cycle « m_brain_03_01 », composé d’une rotation unidirectionnelle de 1 min à 200 rpm à température ambiante, qui est un programme préchargé. Assurez-vous que tous les tissus sont au fond du tube de dissociation en contact avec le tampon de digestion et le rotor pour cela et toutes les étapes restantes.
7. Placer le tube de dissociation dans l’incubateur de secousses pendant 30 min à 200 rpm à 37 °C.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 une fois de plus. Après la deuxième incubation de 30 min effectuer une digestion mécanique finale en utilisant dissociateur électronique comme dans l’étape 2.6.
9. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de tampon d’écoulement froid et placez les tubes sur la glace.

3. Préparation de la suspension cellulaire

1. Pour créer une suspension à cellules simples, versez la réaction de digestion oculaire interrompue à travers un filtre de 40 μm placé sur le dessus d’un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. À l’aide du piston d’une seringue de 2,5 mL, poussez les morceaux restants de tissu oculaire non digéré à travers le filtre.
2. Lavez le tube de dissociation avec 10 mL de tampon flow et rincez le filtre avant d’utiliser le même piston pour passer à nouveau des morceaux de tissu oculaire non digérés à travers le filtre.
3. Répétez l’étape 3.2 à l’aide de 5 mL de tampon flow.
4. Laver le tube de dissociation et filtrer avec un dernier tampon de 10 mL de flow.
   REMARQUE : Le volume total de tampon de digestion et de débit est d’environ 38-40 mL pour chaque échantillon.
5. Centrifugeuse du tube conique à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
6. Préparez une solution de lysage 1x en ajoutant une solution de lysage 10x à l’eau stérile. Casser la pastille en faisant glisser le tube contre un autre tube. Pour lyse globules rouges, ajouter 1 mL de solution de lysage 1x pour 30 s avec tourbillonnant à température ambiante (RT).
7. Arrêtez la réaction avec 20 mL de tampon flow.
8. Centrifugeuse du tube conique à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
9. Dissocier la pastille en faisant glisser le tube contre un autre tube. Ajouter 5 mL de 1x HBSS froid par tube.
10. Tubes de centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer supernatant.

4. Coloration de la suspension cellulaire pour les phagocytes mononucléaires

1. Préparez 0,5 mL de tache vivante/morte par échantillon en diluant le colorant vivant/mort 1:5 000 dans le HBSS froid.
2. Ajouter la tache Live/Dead à chaque échantillon à l’aide d’une pipette P1000 en vous assurant de dissocier complètement la pastille. Transférer les échantillons dans des tubes de micro-litre de 1,2 mL.
3. Prenez un petit aliquot (10 μL) pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques (voir 4.4). Incuber des échantillons avec des taches vivantes/mortes pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité.
4. Comptez les cellules à l’aide du bleu Trypan pour déterminer le nombre de cellules vivantes par échantillon.
   REMARQUE : En règle générale, 2 yeux d’une souris C57BL/6J de 10 à 12 semaines contiennent moins de 2 x 10⁶ cellules vivantes.
5. Lavez les échantillons en ajoutant 400 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
6. Resuspendez complètement les cellules dans 500 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
7. Bloquer jusqu’à 5 x 10^{6 cellules} vivantes dans 50 μL de bloc F_c (1:50 dilution dans le tampon flow froid de rat purifié anti-souris CD16/CD32). Si plus de 5 x 10^{6 cellules vivantes,} augmenter les volumes de manière appropriée.
8. Ajouter le bloc_{F c} à la pastille en s’assurant de dissocier complètement l’échantillon. Incuber pendant 20 min à 4 °C.
9. Ajouter 50 μL de solution de coloration des anticorps (voir le tableau 1 pour le choix et la quantité de chaque anticorps inclus dans la solution) par 5 x 10^{6 cellules} vivantes directement aux cellules du bloc F_c et mélanger complètement. Incuber pendant 30 min à 4 °C.
   REMARQUE : Les quantités d’anticorps dépendent de la configuration du cytomètre d’écoulement et doivent être titrées indépendamment pour chaque laboratoire et instrument. Voir tableau 2 pour la configuration des instruments des filtres et des miroirs. Pour titrer les anticorps, commencez par la recommandation du fabricant et calculez l’indice de coloration. Effectuez un essai de différentes concentrations d’anticorps (au-dessus et en dessous de la recommandation du fabricant) et choisissez la plus faible concentration d’anticorps où l’indice de coloration est maintenu. En outre, assurez-vous que la coloration positive qui est moins lumineux que le contrôle d’une seule couleur. Utilisez des cellules non tachées pour vous assurer que les cellules tachées négativement sont à l’échelle et ont un pic à ou moins de 1 x 10². Utilisez une fluorescence moins un contrôle pour définir les cellules tachées positivement.
10. Lavez les échantillons en ajoutant 700 μL de tampon d’écoulement froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
11. En option, après coloration d’anticorps, les échantillons peuvent être fixés avec 500 μL de 2% de paraformaldéhyde dans le tampon flow. Fixer les échantillons pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, effectuez un lavage tel que décrit dans 4.10. Conserver les échantillons fixes à 4 °C. Les perles de compt compte doivent être ajoutées le jour de la collecte des données de cytométrie du débit. Les échantillons fixes doivent être exécutés sur le cytomètre d’écoulement en 1-2 jours.
    MISE EN GARDE : Le paraformaldéhyde est corrosif et dangereux pour la santé.
12. Lavez à nouveau les échantillons à l’aide de 500 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer la moitié du supernatant sans déranger la pastille cellulaire.
13. Resuspendez les granulés et transférez-les dans une plaque d’analyse à fond U de 96 puits. Plaque de centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Pour décanter le surnatant, retournez la plaque et, en une seule secousse forte, déloger le liquide dans un bassin d’évier, sans déranger les granulés.
14. Dans un nouveau tube de micro-litre de 1,2 mL, placer 50 μL de perles de comptage bien vortexées.
15. Resuspendez les granulés dans 96 plaques de puits dans 200 μL de tampon flow froid. Ajouter le mélange cellulaire sur le dessus des perles de l’étape précédente. Exécutez sur le cytomètre d’écoulement dans le volume total de 250 μL / tube de micro-litre.

5. Collecte de données de cytométrie de flux

1. Allumez et préparez le cytomètre d’écoulement. Instructions énumérées ici sont pour un cytomètre laser modifié quatre (Tableau 2).
2. Exécutez un échantillon d’essai, qui comprend un petit aliquot de chaque échantillon, pour vous assurer que toutes les cellules sont à l’échelle pour chaque détecteur. Ajustez les tensions de sorte que toutes les cellules soient à l’échelle.
3. Exécutez des commandes de couleur unique (CSC) pour chaque fluorophore utilisé dans le cocktail de coloration (Tableau 3). Placez le tube de micro-titer dans un plus grand tube de polystyrène de 5 mL pour le placer sur le stade de cytomètre d’écoulement.
   REMARQUE : Les fluorophores racines comme BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) et Alexa700 ne nécessitent pas le même anticorps que le cocktail (c.-à-d. CD19 PE pour CD64 PE). Cependant, les fluorophores tandem comme PE-CF594, PE-Cy7, ou APC-Cy7 nécessitent le même anticorps pour le CSC que le cocktail en raison de la dissociation potentielle des fluorophores conjugués.
   1. Créez le CSC pour BV421 en ajoutant 2 gouttes de perles de compensation à un tube de 1,2 litre de litre ainsi que 1 μL de hamster anti-souris CD11c BV421. Les perles de compensation sont utilisées parce que le CD11c BV421 est un sous-type IgG lambda plutôt que kappa tel que décrit dans 5.3.3. Incuber pendant 15 minutes à 4 °C. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
   2. Créez le CSC pour le colorant vivant/mort en ajoutant une goutte de perles de coloration positives (capuchon vert) à partir des perles réactives d’amine, suivies de 1 μL de colorant vivant/mort. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter une goutte des perles négatives (capuchon blanc) des perles réactives à l’amine. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
   3. Créez les CSC restants en ajoutant une goutte de perles de coloration positives (capuchon vert) de l’ensemble de perles anti-rat et anti-hamster Ig kappa, suivie de la quantité d’anticorps répertoriée (tableau 3) dans un tube de 1,2 mL de litre. Incuber pendant 15 min à 4 °C. Ajouter une goutte des perles négatives (bonnet blanc) de l’ensemble de perles anti-rat et anti-hamster Ig kappa. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
   4. Vortex tous les mélanges de perles complètement. Conserver les CSC à 4 °C jusqu’à 3 jours.
      REMARQUE : Le CSC pour les souris fluorescentes de reporter est cellules non souillées.
   5. Lors de l’exécution des CSC, réglez des tensions de telle sorte que l’échantillon de CSC ait un pic supérieur à toute fluorescence pour un échantillon de cellules dans le même canal de détecteur. De plus, les tensions doivent être réglées de façon à ce que tout CSC ait au moins une différence de 0,5 log entre le pic d’histogramme dans le canal d’intérêt et tout autre canal (figure 1).
4. Exécutez des échantillons sur les événements de maintien « faible » /seconde en dessous de 4 000. Si le débit ne peut pas être abaissé de façon appropriée, diluer les échantillons avec un tampon de débit froid supplémentaire. Enregistrez le volume ajouté car cela sera nécessaire pour le calcul du décompte (voir résultats représentatifs).
5. Recueillir au moins 3 x 10⁶ événements par échantillon. Ceci peut être plus élevé que le nombre de cellules en raison des granules pigmentaires et des débris comptant comme événements sur votre cytomètre.
6. Enregistrez une fluorescence moins un (FMO) pour chaque fluorophore autre que Live/Dead pour une stratégie de gation appropriée à la section 6.4. Un FMO est un échantillon qui a été taché avec tous les fluorophores sauf un.
7. Nettoyez et éte coupez le cytomètre d’écoulement selon les instructions du fabricant ou de l’installation.

6. Annotation des données de cytométrie de flux

1. Ouvrez une nouvelle feuille de travail à l’aide d’un logiciel d’analyse. Importez les fichiers FCS à partir du cytomètre pour tous les échantillons et les contrôles monocolores.
2. Utilisez les CSC pour créer une matrice de rémunération.
3. Appliquez la matrice de compensation à vos échantillons tachés et fmos.
4. Utilisez les OFO pour déterminer les taches positives pour dessiner des barrières.

Résultats

La figure 1 a montré des histogrammes de fréquence non compensés pour les CSC et les cellules pour le laser rouge : Alexa647, Alexa700, et APC-Cy7. Dans la figure 1A, la ligne magenta représentait le sommet de la CSC pour Alexa647, tandis que la ligne cyan montrait la différence prévue de 0,5 log. Notez que le pic d’Alexa700 et d’APC-Cy7 était à gauche (moins lumineux) de la ligne cyan. Notez également que les cellules étaient toutes à gauche de la ligne magenta...

Discussion

La cytométrie de flux multi-paramètres permet l’analyse quantitative de plusieurs types de cellules dans un tissu complexe. Dans ce rapport, nous décrivons la détection cytométrique de flux des populations mononucléaires de phagocyte, y compris des monocytes, des cellules dendritiques, et des sous-ensembles de macrophage, après blessure de laser dans l’oeil de souris. Liyanage et autres ont récemment rapporté une stratégie semblable de gating pour détecter des neutrophiles, des éosinophiles, des lymphocytes, des DCs, des...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger de 0,6 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Tubes à centrifuger de 1,7 ml Pipettes	Costar	3620
Pipettes de 10 ml	Fisher Scientific
coniques de 15 ml	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
Seringue de 2,5 ml	Henke Sass Wolf	7886-1
Solution de paraformaldéhyde à 20 %	Microscopie électronique Sciences	15713-S
Pipettes de 25 ml	Fisher Scientific	431032
aiguille de 30 g	Exel	26437
seringue Luer lock de 3 ml	Fisher Scientific	14955457
parachute en polystyrène 41 x 41 x 8 mm	Fisher Scientific	08-732-112
50 ml coniques	Falcon	352070
96 puits, Plaque de dosage à fond en U sans couvercle	Falcon	353910
Perles réactives aux amines	ThermoFisher	A10628
Logiciel d’analyse	FlowJo	v 10
Set de perles Ig kappa anti-rat et anti-hamster	BD Biosciences	552845
C57BL/6J souris	Jackson Laboratory	664
Compteur de cellules	Invitrogen	AMQAX1000
Lames de compteur de cellules	Invitrogen	C10283
Perles de compensation	ThermoFisher	01-1111-42
Perles de comptage	ThermoFisher	01-1234-42
Pince courbe	Fisher Scientific	16-100-123
Enzyme de digestion	Sigma Aldrich	5401020001
Microscope à dissection	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
Tubes de dissociation	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
Dissociateur électronique	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva software	BD Biosciences
Fc block, anti-souris rat CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Pince fine	Integra	Miltex 17035X
Tampon d’écoulement	Miltenyi Biotec	130-091-221
Cytomètre	en flux BD Biosciences
Tubes d’écoulement	Falcon	352008
Hamster anti-souris CD11c BV421	BD Biosciences	562782
Seau à glace	Fisher Scientific	07-210-123
Colorant vivant/mort	ThermoFisher	65-0866-14
Solution de lyse, solution 10x	BD Biosciences	555899
Tube et support de micro-titrage	Fisher Scientific	02-681-380
Souris anti-souris CD64 PE	BioLegend	139304
Souris anti-souris NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
Pointes de pipette P1000	Denville Scientific	P2404
Pipette P1000	Gilson	FA10006M
P2 pointes de pipette	eppendorf	22491806
P2 Pipette	Gilson	FA10001M
P200 pointes de pipette	Denville Scientific	P2401
Pipette P200	Gilson	FA10005M
Pipet homme	Fisher Scientific	FB14955202
Rat anti-souris B220 PECF594	BD Biosciences	562313
Rat anti-souris CD11B APC-Cy7	BD Biosciences	557657
Rat anti-souris CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
Rat anti-souris CD19 PE	BD Biosciences	553786
Rat anti-souris CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
Rat anti-souris CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
Rat anti-souris CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
Rat anti-souris CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
Rat anti-souris Ly6C	BD Biosciences
Rat anti-souris Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
Rat anti-souris MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
Rat anti-souris Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
Rat anti-souris Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
Incubateur secouant	Labnet	311DS
Ciseaux à ressort	Fine Science Tools	15024-10
Filtre à cellules stériles, maille de nylon 40 mm	Fisher Scientific	22363547
Eau stérile, 500 ml	Gibco	A12873-01
Centrifugeuse à godet oscillant	eppendorf	5910 R
Trypan bleu, solution à 0,4	Gibco	15250061