Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

Résumé

Le rôle des gènes récemment découverts associés à la maladie dans la pathogénie des désordres neuropsychiatriques demeure obscur. Une technique bilatérale modifiée d’électroporation in utero permet le transfert de gènes dans de grandes populations de neurones et l’examen des effets causatifs des changements d’expression génétique sur le comportement social.

Résumé

Alors que les études d’association à l’échelle du génome mettent en lumière les fondements génétiques hétérogènes de nombreuses maladies neurologiques, la nécessité d’étudier la contribution de gènes spécifiques au développement et à la fonction du cerveau augmente. S’appuyer sur des modèles muraux pour étudier le rôle de manipulations génétiques spécifiques n’est pas toujours faisable puisque les lignées de souris transgéniques sont assez coûteuses et que de nombreux nouveaux gènes associés à la maladie n’ont pas encore de lignées génétiques disponibles dans le commerce. En outre, il peut prendre des années de développement et de validation pour créer une ligne de souris. L’électroporation in utero offre une méthode relativement rapide et facile pour manipuler l’expression des gènes d’une manière spécifique de type cellulaire in vivo qui nécessite seulement le développement d’un plasmide d’ADN pour réaliser une manipulation génétique particulière. L’électroporation in utero bilatérale peut être utilisée pour cibler de grandes populations de neurones pyramidaux du cortex frontal. La combinaison de cette méthode de transfert de gènes avec des approches comportementales permet d’étudier les effets des manipulations génétiques sur la fonction des réseaux préfrontaux du cortex et le comportement social des souris juvéniles et adultes.

Introduction

Les études d’association à l’échelle du génome (GWAS) ont conduit à la découverte de nouveaux gènes candidats associés aux pathologies cérébrales^1,2,3,4. Ces études ont été particulièrement bénéfiques pour comprendre les troubles neuropsychiatriques dévastateurs tels que la schizophrénie (SCZ), où l’étude de nouveaux gènes a servi de point de lancement pour de nouvelles lignes de recherche et d’intervention^{thérapeutique 5,6}. Les gènes hébergeant le risque pour SCZ montrent l’expressi....

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été menés conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health (NIH) pour la recherche sur les animaux et ont été approuvés par le Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Préparation de solution d’ADN

1. Achetez un plasmide commercial ou subventionnez un gène d’intérêt dans le plasmide avec le promoteur désiré. Ici, un plasmide contenant l’EGFP sous le promoteur de CAG (pCAG-EGFP) a été employé.
   REMARQUE : Déterminez le promoteur désiré en fonction du niveau d’expression requis. En général, les plasmides sous le promoteur du CAG peuvent être u....

Résultats

Développement et mise en œuvre réussis d’un électroporateur sur mesure et de trois électrodes à dents.
Pour les IUI, un électroporateur sur mesure peu coûteux a été construit sur la base d’une conception^{précédemment décrite 27} (figure 1A et figure 2). Une électrode à trois volets a été^{faite 23,24 à} l’aide de forceps en plastique avec 2 électrodes négatives atta.......

Discussion

Dans ce cas, un pipeline est décrit qui combine la manipulation de nouveaux gènes d’intérêt dans de grandes populations de neurones corticals frontaux avec des analyses comportementales chez la souris. En outre, ce pipeline permet l’étude longitudinale du comportement chez les mêmes souris à la fois au cours du développement postnatal précoce et à l’âge adulte. Cette technique contourne la nécessité de s’appuyer sur des modèles animaux génétiques qui peuvent être coûteux en termes de temps et de dépenses. La force de ce .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Suture tressée noire en soie 13mm	Havel’s	SB77D	Suture peau
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12
IUE C270 Webcam	Logitech	N/A	Comportement d’enregistrement
Électroporateur	Construit sur mesure	N/A	Voir les figures 1 et 2 et Bullmann et al, 2015
EZ-500 Colonne de spin Plasmide ADN Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Préparation Pladmid
Vert rapide FCF	Sigma	F7252-5G	Colorant pour solution d’ADN
Ciseaux fins - tranchants	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Éponges de gaze	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Chauffage/Refroidissement	Braintree	TP-700	Coussin chauffant
Extracteur de pipette en verre	Sutter Instrument,P-97		IUE
Pipettes en verre	Sutter Instrument,BF150-117-10		IUE
Lotion dépilatoire	Nair	N/A	Épilation
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Labyrinthe à champ ouvert - manège en acrylique fait maison	Construit sur mesure	N/A	50 & times ; 50 & times ; 30 cm longueur-largeur-hauteur
pCAG-GFP	Addgene	11150	Vecteur d’expression de mammifère pour l’expression de GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	Injecteur de pression
Écarteur - 2 broches Blunt	F.S.T.	17023-13	IUE
Pince à anneau	F.S.T.	11103-09
IUE Stérilisateur, perle sèche	Sigma	Z378569	stereliser les outils chirurgicaux
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET À L’USAGE VÉTÉRINAIRE UNIQUEMENT	Havel’s	HJ398	Suture muscle
Bain d’eau	Cole-Parmer	EW-12105-84	sérum physiologique chauffant