Article de méthode

Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

DOI :

10.3791/61350

⸱

21 mai 2020

 ,  ,  , 
1The Graduate Program for Neuroscience, Boston University, 2Department of Biology, Boston University, 3Neurophotonics Center, Boston University, 4Center for Systems Neuroscience, Boston University, 5Research and Early Development, Biogen, 6Department Pharmacology and Experimental Therapeutics, Boston University

Dans cet article

Résumé

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Le rôle des gènes récemment découverts associés à la maladie dans la pathogénie des désordres neuropsychiatriques demeure obscur. Une technique bilatérale modifiée d’électroporation in utero permet le transfert de gènes dans de grandes populations de neurones et l’examen des effets causatifs des changements d’expression génétique sur le comportement social.

Résumé

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Alors que les études d’association à l’échelle du génome mettent en lumière les fondements génétiques hétérogènes de nombreuses maladies neurologiques, la nécessité d’étudier la contribution de gènes spécifiques au développement et à la fonction du cerveau augmente. S’appuyer sur des modèles muraux pour étudier le rôle de manipulations génétiques spécifiques n’est pas toujours faisable puisque les lignées de souris transgéniques sont assez coûteuses et que de nombreux nouveaux gènes associés à la maladie n’ont pas encore de lignées génétiques disponibles dans le commerce. En outre, il peut prendre des années de développement et de validation pour créer une ligne de souris. L’électroporation in utero offre une méthode relativement rapide et facile pour manipuler l’expression des gènes d’une manière spécifique de type cellulaire in vivo qui nécessite seulement le développement d’un plasmide d’ADN pour réaliser une manipulation génétique particulière. L’électroporation in utero bilatérale peut être utilisée pour cibler de grandes populations de neurones pyramidaux du cortex frontal. La combinaison de cette méthode de transfert de gènes avec des approches comportementales permet d’étudier les effets des manipulations génétiques sur la fonction des réseaux préfrontaux du cortex et le comportement social des souris juvéniles et adultes.

Introduction

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Les études d’association à l’échelle du génome (GWAS) ont conduit à la découverte de nouveaux gènes candidats associés aux pathologies cérébrales1,2,3,4. Ces études ont été particulièrement bénéfiques pour comprendre les troubles neuropsychiatriques dévastateurs tels que la schizophrénie (SCZ), où l’étude de nouveaux gènes a servi de point de lancement pour de nouvelles lignes de recherche et d’interventionthérapeutique 5,6. Les gènes hébergeant le risque pour SCZ montrent l’expression biaisée dans le cortex préfrontal (PFC) pendant le développement prénatal et postnatal tôt, une région impliquée dans la pathologie de plusieurs désordres neuropsychiatriques7. En outre, les modèles de souris des désordres psychiatriques montrent l’activité anormale dans les réseauxde PFC 6,8,9. Ces résultats suggèrent que les gènes associés au SZC pourraient jouer un rôle dans le câblage développemental de cette région. Une étude plus approfondie utilisant des modèles animaux est nécessaire pour comprendre la contribution de ces gènes candidats à l’établissement de connexions dans le PFC et pour déterminer si ces gènes ont un rôle causal dans la pathogénie des troubles neuropsychiatriques. Les techniques de manipulation génétique chez la souris qui permettent l’étude des changements d’expression génétique sur des circuits neuronaux spécifiques pendant le développement prénatal et postnatal précoce sont une méthode prometteuse pour comprendre les mécanismes moléculaires qui relient les changements d’expression génétique au dysfonctionnement du PFC.

Les lignées génétiques de souris offrent une méthode pour étudier l’impact de gènes particuliers sur le développement et la fonction du cerveau. Cependant, s’appuyer sur des souris transgéniques peut être limitatif car il n’y a pas toujours de lignes disponibles dans le commerce pour examiner les effets de gènes spécifiques sur le développement de circuits neuronaux. En outre, il peut être extrêmement coûteux et long de développer des lignes de souris personnalisées. L’utilisation de stratégies intersectionnelles de manipulation génétique qui combinent des souris transgéniques avec des approches virales a révolutionnéla compréhension du cerveau 10,11,12. Malgré de nombreux progrès, les stratégies virales sont associées à certaines limitations selon le type de vecteur viral, y compris les limites de la capacité d’emballage qui peuvent restreindre l’expression virale13 et la toxicité cellulaire associée à l’expression virale14. En outre, dans la plupart des conditions expérimentales, l’expression génétique robuste utilisant le virus adéno-associé (AAV) exige approximativement 2 à 4 semaines15,rendant les stratégies virales courantes impossibles à manipuler des gènes pendant le développement postnatal tôt.

L’électroporation in utero (IUE) est une approche alternative qui permet un transfert de gènes rapide et peu coûteux16,17 qui, lorsqu’il est couplé avec l’étiquetage fluorescent et des approches pharmacogénétiques ou optogénétiques, fournit une plate-forme puissante pour disséquer la fonction des circuits neuronaux. En outre, avec le développement de CRISPR-Cas9 gènes d’édition du génome peuvent être surexprimés ou précisément modifiés par type de cellule spécifique knock-down ou knock-out de gènes spécifiques ou par la modulation des promoteurs18,19. Les approches de manipulation génétique utilisant l’IUE sont particulièrement avantageuses lorsque l’effet des gènes sur les circuits neuronaux doit être testé lors de fenêtres de développementétroites 20. L’IUE est une technique polyvalente et la surexpression peut être facilement accomplie en insérant un gène dans un vecteur d’expression sous un promoteur spécifique. Un contrôle supplémentaire de l’expression des gènes peut être réalisé en conduisant l’expression en utilisant des promoteurs de différentes forces ou en utilisant des promoteurs inductibles capables de contrôler temporellement l’expressiondes gènes 21,22. En outre, l’IUE permet le ciblage des cellules dans des couches corticales spécifiques, des types de cellules et des régions du cerveau, ce qui n’est pas toujours faisable enutilisant d’autres approches 5,17. Les progrès récents de la configuration IUE basés sur l’utilisation de trois électrodes, qui génère une distribution plus efficace des champs électriques, ont élargi le répertoire fonctionnel de cette méthode et permis aux scientifiques de cibler de nouveaux types de cellules et d’augmenter l’efficacité, la précision et le nombre de cellules qui peuvent êtreciblées 23,24. Cette technique a été récemment utilisée pour déterminer le rôle causal du composant de complément 4A (C4A), un gène lié à SCZ, dans la fonction PFC et la cognition précoce5.

Présenté ici est un pipeline expérimental qui combine des approches de transfert de gènes pour cibler de grandes populations de neurones excitatoires dans le cortex frontal, y compris le PFC, avec des paradigmes comportementaux qui permet non seulement l’étude des changements cellulaires et de niveau de circuit, mais permet également de surveiller le comportement tout au long du développement postnatal précoce et l’âge adulte. D’abord décrit est une méthode pour transfecter bilatéralement de grandes populations de couches (L) 2/3 neurones pyramidaux dans les régions corticales frontales. Ensuite, les tâches d’analyse du comportement social chez les souris juvéniles et adultes sont décrites. Le nombre de cellules peut être obtenu à la fin des tâches comportementales pour quantifier l’étendue et l’emplacement de la transfection cellulaire. En outre, le nombre de cellules transfectées peut être corrélé avec des données comportementales pour déterminer si un plus grand nombre de cellules transfectées conduit à de plus grandes perturbations du comportement.

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Protocole

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Tous les protocoles expérimentaux ont été menés conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health (NIH) pour la recherche sur les animaux et ont été approuvés par le Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Préparation de solution d’ADN

  1. Achetez un plasmide commercial ou subventionnez un gène d’intérêt dans le plasmide avec le promoteur désiré. Ici, un plasmide contenant l’EGFP sous le promoteur de CAG (pCAG-EGFP) a été employé.
    REMARQUE : Déterminez le promoteur désiré en fonction du niveau d’expression requis. En général, les plasmides sous le promoteur du CAG peuvent être utilisés pour atteindre des niveaux élevés du transgène, tandis que les promoteurs spécifiques aux types cellulaires (p. ex., la synapsine pour les neurones) ont tendance à être moins actifs. L’expérimentateur doit déterminer empiriquement les niveaux d’expression appropriés pour chaque plasmide.
  2. Transformez les bactéries et cultivez les stocks dans les médias bactériens avec l’antibiotique approprié.
    1. Retirer les cellules compétentes (cellules DH5α) de -80 °C et décongeler sur la glace pendant 20 min.
    2. Mélanger 100 pg -100 ng de l’ADN plasmide avec 30 μL de cellules compétentes. Incuber le mélange sur la glace pendant 20 min.
    3. Effectuez un choc thermique en couveant dans un bain d’eau de 42 °C pendant 45 s, puis en retournant le tube sur la glace pendant 2 min.
    4. Ajouter de 200 à 1 000 μL de lb de médias aux cellules compétentes transformées et les cultiver pendant 45 min à 37 °C sur un incubateur qui tremble.
    5. Plaque 200 μL des cellules transformées en une plaque d’agar LB contenant l’antibiotique approprié et incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C.
    6. Le lendemain, incuber une colonie bactérienne dans 200 mL de bouillon LB avec l’antibiotique approprié à 37 °C sur un incubateur secouant pendant la nuit.
  3. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit maxiprep.
    1. Suivez les instructions fournies dans le kit maxiprep obtenu. Pour l’étape d’élitution, n’élisez pas l’ADN dans le tampon d’élitution. Au lieu de cela, l’ADN éduute en utilisant soit 200 μL d’eau stérile 1x PBS ou de qualité moléculaire.
    2. Assurez-vous que la concentration finale de l’ADN est supérieure à 1 μg/μL. Si le plasmide contenant le gène d’intérêt ne contient pas de gène reporter, préparez également un plasmide à co-transfecter avec une molécule reporter, comme la protéine fluorescente verte (GFP), pour permettre la visualisation des cellules transfectées.
  4. Préparez la solution d’ADN pour la chirurgie en diluant l’ADN plasmide en 1x PBS à 1 μg/μL de concentration finale de chaque plasmide. Ajouter du colorant vert rapide à la solution d’ADN à une concentration finale de 0,1 %. Pour les injections bilatérales, préparer 60 μL de solution par barrage (pour environ 10 petits).
    REMARQUE : Si le plasmide ne contient pas de gène reporter, co-électroporate avec GFP. Les taux de co-électroporation sont généralement de 95 % ou plus. Dans nos mains, l’efficacité de transfection n’a pas été affectée par la co-transfection. Tous les plasmides électroporés doivent être dilués à 1 μg/μL.

2. Commander ou élever des souris enceintes à temps

  1. Si vous commandez des souris enceintes à temps, ordonnez aux souris d’arriver le jour embryonnaire (E) 13 ou plus tôt pour laisser aux mères suffisamment de temps pour s’acclimater au logement des animaux.  Dans ce protocole, les souris de race CD-1 sont utilisées pour toutes les expériences.
    REMARQUE : Commander quelques jours à l’avance permettra de réduire le stress animal et d’augmenter le taux de survie des chiots.
  2. Si vous reproduisez des souris enceintes à temps, associez des souris femelles à un mâle pendant la nuit, une fois par semaine. Vérifiez la présence d’une prise vaginale le lendemain matin (E0,5). Déterminer la grossesse en surveillant le poids des souris femelles.
    REMARQUE: Différentes souches de souris ont différentes augmentations de poids pendant la grossesse, afin de déterminer le gain de poids typique pour la souche de souris utilisée.
  3. Qu’il s’agisse de commander ou d’élever les souris, de réduire le stress des barrages, placez une aire de nidification et une maison de souris dans la cage. Réduire le stress peut aider à augmenter le taux de survie des chiots.

3. Conception et assemblage de trois électrodes à dents

  1. Utilisez des feuilles de titane de grade 2 d’une épaisseur de 0,063 comme matériau de stock pour les contacts avec les électrodes.
  2. À l’aide de techniques d’usinage standard ou d’outils manuels de précision, fabriquer des électrodes avec les dimensions suivantes : 20 mm x 5 mm avec une pointe arrondie et un dos rainuré. Retirer les bords rugueux ou les bavures à l’aide de papier de verre à grain fin.
  3. Pour brancher les contacts d’électrode, enroulez 22 G de fil de cuivre échoué autour des rainures de l’électrode et fixez-les par soudure. Protégez cette articulation à l’aide d’un tube de rétrécissement de chaleur.
  4. Ensuite, fixez l’électrode connectée à des forceps autoclavables et non conductrices à l’aide d’un tube de retrait de chaleur supplémentaire pour fabriquer les deux électrodes négatives. Attachez l’électrode positive unique à un matériau autoclavable et non conductrice (comme une poignée de brosse à dents avec une tête sciée). Adapter l’extrémité ouverte du fil avec un bouchon de banane standard.

4. Préparation à la chirurgie

  1. Apportez les mères enceintes à la zone de chirurgie au moins 30 minutes avant la chirurgie pour permettre la réduction des niveaux de stress après le transport de l’établissement pour animaux.
  2. Stériliser l’ensemble du site de la chirurgie à l’aide de lingettes germicides stérilisantes, puis 70% d’éthanol. Changez de gants avant de commencer la chirurgie.
  3. Stériliser les outils autoclavés dans un stérilisateur de perles de verre.
  4. Transférer 1x PBS stérile (environ 50 mL par barrage) à 50 mL de tubes coniques et placer dans une grille à tubes dans le bain d’eau chauffé à 38-40 °C. Vérifiez la température saline stérile à l’insuffleur d’un thermomètre.
  5. Allumez la pompe de circulation de chauffage de l’eau de sorte qu’elle soit réchauffée à 37 °C avant le début de la chirurgie. Cela maintiendra la température corporelle de la souris pendant toute la durée de la chirurgie.
  6. Allumez l’injecteur de pression et l’électroporateur et assurez-vous qu’il fonctionne correctement avant la chirurgie.
  7. Faites tourner brièvement la solution d’ADN plasmide (obtenue à l’étape 1.4) sur une centrifugeuse de table et placez-la sur la glace.
  8. Tirez des pipettes en verre sur un puller pipette de sorte que la pointe de la pipette en verre tiré est d’environ 50 μm de diamètre.
  9. Remplissez la pipette de 20 à 40 μL de solution d’ADN (obtenue à l’étape 1.4).
  10. Mettre en place tous les éléments nécessaires à la chirurgie, y compris la lotion enlever les cheveux, iode, 70% éthanol, swaps de coton, pommade pour les yeux, sutures, gaze, etc.
  11. Préparez une feuille de chirurgie et remplissez les informations nécessaires, telles que l’identification et le poids de la souris, la date de la chirurgie, le nom du chirurgien, etc.

5. Chirurgie d’électroporation in utero

  1. Pesez la souris avant la chirurgie et notez-la sur la feuille de chirurgie.
  2. Anesthésier une souris enceinte (E16) par inhalation dans une chambre d’induction avec 4% (v/v) mélange oxygène-isoflurane. Une fois que la souris a été induite, passer à l’inhalation d’un masque et maintenir l’isoflurane à 1-1,5% (v/v) et surveiller la respiration tout au long de la chirurgie. Vérifiez que la souris est entièrement anesthésiée, le taux d’haleine devrait être ~ 55-65 respirations par min.
  3. Administrer des analgésiques préopératoires : buprénorphine (3,25 mg/kg; SC) et méloxicam (1-5 mg/kg; SC) à un volume maximum de 10-30 ml/kg.
  4. Utilisez de la crème d’épilation ou utilisez soigneusement un rasoir pour enlever la fourrure de l’abdomen. Stériliser l’abdomen en tamponnant avec de la povidone-iode et 70% d’éthanol et répéter au moins 3 fois. Créer un champ stérile autour de l’abdomen à l’aide d’une gaze stérile, drapage stérile peut également être utilisé.
  5. Faire une incision à mi-ligne (3-4 cm) dans la peau abdominale, en étant sûr de soulever la peau avec des forceps pour éviter de couper à travers le muscle. Ensuite, couper à travers le muscle, à nouveau en prenant soin de soulever le muscle pour éviter de couper les organes vitaux.
  6. Tirez soigneusement les cornes utérinnes hors du barrage à l’aide de forceps anneau et placez-les doucement sur le champ stérile, en s’assurant que la corne utérine est soutenue par rembourrage et n’est pas tirer trop loin du barrage. À partir de ce moment, gardez la corne utérine humidifié tout au long du reste de la chirurgie avec le 1x PBS stérile préchauffé.
  7. Placez un embryon à l’aide de forceps ou de doigts. Insérez soigneusement la pipette en verre tiré à un angle de 45 degrés par rapport au plan horizontal de la tête et inséré dans le ventricule latéral, qui peut être identifié visuellement entre la ligne médiane du cerveau et l’œil. Injecter environ 2-3 μL dans chaque ventricule latéral en insérant la pipette dans l’un, puis l’autre ventricule (recommandé) ou en injectant la solution d’ADN dans un ventricule jusqu’à ce qu’il passe dans les deux ventricules latéraux. Le ventricule a été ciblé avec succès si une forme de croissant est présente après injection.
    REMARQUE : Le bout de la pipette en verre pourrait se briser pendant la chirurgie. Si cela se produit, remplacez la pipette en verre, en veillant à ce que les cornes utérine soient humidifiés pendant qu’une nouvelle pipette est préparée et remplie de la solution d’ADN.
  8. Pour transfecter les cellules bilatéralement dans le cortex frontal, placez les deux électrodes négatives sur les côtés de la tête des embryons juste latérales et légèrement caudales aux ventricules latéraux et placez l’électrode positive entre les yeux, juste en face du museau en développement.
  9. Assurez-vous que l’embryon est généreusement humidifié. Appliquer quatre impulsions carrées (durée de l’impulsion = durée de 50 ms, amplitude des impulsions = 36 V, intervalle interpulsé = 500 ms).
  10. Injecter et électroporer tous les embryons, en allant un par un afin que chaque embryon soit électroporé immédiatement après l’injection de solution d’ADN. Une fois que tous les embryons ont été électroporés, insérez soigneusement les cornes utériines dans la cavité abdominale. Au cours de cette étape, enduire la cavité abdominale en PBS stérile (1x) pour faciliter le placement de la corne utérine.
  11. Remplissez la cavité abdominale avec 1x PBS stérile de sorte qu’il ne reste plus de poches d’air après la suture. Suture du muscle avec sutures absorbables et la peau avec des sutures de soie non absorbables.
  12. Laisser le barrage se rétablir complètement dans une chambre chauffée pendant au moins 1 h. Dans les 48 prochaines heures, vérifiez régulièrement les barrages. Comme le barrage se remet de l’anesthésie et reprend conscience, il va commencer à bouger et à fouetter.
  13. Administrer des analgésiques postopératoires si les barrages présentent des signes de douleur, comme la balle de leur corps et la respiration rapide. N’administrer que s’il y a des signes de douleur puisque les injections de SC pourraient stresser les barrages, mais si elles sont administrées au groupe expérimental également administrer au groupe témoin, ou vice versa.

6. Analyse du comportement social précoce dans une tâche d’interaction maternelle

REMARQUE : Ce protocole est adapté des publicationsprécédentes 5,25. Effectuez cette tâche après la naissance de souris du jour postnatal (P) 18-21.

  1. Comportement maternel d’homing dans l’interaction maternelle I (MI1) tâche.
    1. Assurez-vous que la literie en cage n’est pas changée dans la semaine précédant l’exécutée.
    2. Obtenir ou construire une arène en plein champ (OF) qui peut être facilement nettoyée (acrylique est recommandé) avec les dimensions suivantes: 50 x 50 x 30 cm (longueur largeur-hauteur). Les conditions d’éclairage pendant l’exécution des comportements peuvent varier selon la question expérimentale et peuvent influencer des niveaux d’excitation et de comportement anxieux. Enregistrez des expériences comportementales sous une faible lumière (environ 20 lux) placée au-dessus du centre de l’arène.
    3. Pendant deux jours avant l’essai de comportement, acclimatez le barrage à l’arène en le plaçant sous une tasse de fil de maille (telle qu’une tasse de crayon) dans un coin de l’arène pendant cinq minutes par jour.
    4. Le jour de l’essai, qui peut être de P18-21, avant que les souris ont été sevrées, nettoyer l’arène à fond avec des lingettes désinfectante et 70% d’éthanol.
    5. Installez l’arène avec deux coins opposés contenant à la fois de la literie propre et un coin contenant de la literie de nid souillée de la cage du chiot.
    6. Permettez à chaque chiot d’explorer l’arène pendant 3 min, en plaçant chaque chiot dans le coin neutre et vide au début.
      REMARQUE: Enregistrez le comportement avec une caméra vidéo à 30 fps. Nettoyez soigneusement l’arène entre chaque chiot et remplacez la literie fraîche. Alternez quel coin est la literie fraîche par rapport à la literie de nid comme un contrôle pour éviter la préférence de coin pour d’autres raisons (c.-à-d., bruit ambiant ou lumière). Si vous exécutez plusieurs portées à travers la fenêtre de développement P18-21, exécutez des expériences comportementales en même temps entre les jours. Assurez-vous également qu’au cours d’une journée donnée, les groupes de contrôle et expérimentaux sont exécutés en parallèle.
  2. Interaction sociale maternelle dans la tâche de l’interaction maternelle II (MI2)
    1. Effectuez cette tâche immédiatement après la tâche MI1.
    2. Installez l’arène de sorte qu’un coin contient une tasse en maille de fil vide et le coin opposé contient le barrage sous une tasse en fil de maille. Si les souris sont capables de déplacer la tasse, peser la tasse avec un poids qui peut être scotché au sommet de la tasse pour empêcher le mouvement. Mettez la literie souillée de nid de la cage à la maison dans un autre coin.
    3. Exécutez la tâche MI2. Placez le chiot dans le coin vide et enregistrez le comportement pendant cinq minutes à 30 fps, permettant au chiot d’explorer. Exécutez chaque chiot séparément et nettoyez soigneusement toute l’arène et les tasses en maille métallique entre chaque chiot.

7. Analyse de la tâche de comportement social des adultes

  1. Exécutez le comportement social des adultes chez les mêmes souris qui ont été exécutés dans la tâche MI1 et MI2 une fois qu’ils sont adultes (P60-P70 ou plus). Les données recueillies ici ont été faites dans une cohorte distincte.
  2. Manipuler les souris adultes pendant 3 jours consécutifs pour permettre l’accoutumabilité à l’expérimentateur. Assurez-vous que seuls les expérimentateurs qui ont été familiarisés avec les souris exécutent des expériences de comportement, idéalement avoir la même personne exécuter toutes les tâches.
  3. Habituate souris à l’of arena pendant 3 jours pendant 5 min chaque jour.
  4. Analysez le comportement dans une nouvelle tâche de reconnaissance d’objets pour mesurer la locomotion générale et l’intérêt pour un objet nouveau. Cela permettra une interprétation plus significative du comportement social si les souris ont un déficit spécifique dans les interactions sociales.
    1. Placez les souris dans l’arène pendant 5 min avec un objet nouveau (petit jouet en plastique avec des surfaces lisses et nettoyables) dans un coin de l’arène. Nettoyez soigneusement l’arène entre les souris avec 70% d’éthanol.
    2. Pour la reconnaissance d’objets nouveaux, placez l'«objet nouveau » précédemment exposé, qui est maintenant familier, dans un coin et placez un nouvel objet nouveau dans le coin opposé. Pour toutes les tâches, changez les coins entre les essais comme un contrôle.
    3. Pour une nouvelle interaction sociale, assurez-vous que les souris nouvelles sont âgées, souches et sex-matched et sont acclimatés à la tasse de fil de maille pendant 2 jours consécutifs pendant 5 min chaque jour. Pour chaque essai, placez une nouvelle souris sous une tasse en fil de maille et, dans le coin opposé, placez une tasse en fil de maille vide. Laissez les souris explorer l’arène pendant 5 min tout en enregistrant le comportement. Nettoyez soigneusement l’arène et les tasses métalliques en maille entre chaque essai.

8. Analyse des données comportementales

  1. Utilisez DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) pour effectuer le suivi des parties du corps de base). Des notes détaillées sur la façon d’installer et d’utiliser DeepLabCut peuvent être trouvées sur sa page GitHub. Une bibliothèque personnalisée basée sur python 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) est également disponible pour une analyse plus approfondie des données une fois le suivi des parties du corps de base terminé. Plus de détails sur la façon d’utiliser cette bibliothèque peuvent être trouvés dans la page GitHub.
    1. Installez DeepLabCut à l’aide du processus d’installation anaconda. Installez une version compatible CPU de DeepLabCut ainsi que la version GPU pour la formation du réseau.
    2. Suivez les instructions disponibles dans le lien ci-dessous pour créer un projet de suivi des parties du corps. Breifly, choisissez un échantillon d’images de votre ensemble de données et marquez manuellement les parties pertinentes du corps dans ces cadres échantillonnés. Former le réseau DeepLabCut pour prédire les parties du corps et vérifier que le réseau formé fonctionne correctement.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Aux fins du suivi de la position du corps et de l’identification d’interactions simples dans un champ ouvert, identifier le centroïde de l’animal, la tête (définie opérationnellement comme le point médian entre les oreilles), les oreilles gauche et droite ainsi que le museau et la base de la queue. Avoir plusieurs parties du corps suivies permet la substitution appropriée lorsque certaines parties du corps sont manquantes dans le cadre en raison de l’occlusion.
    4. En dehors des parties du corps animal, suivre une variété de points liés à l’environnement: tels que les bords des boîtes de comportement. Ceux-ci permettent une estimation reproductible de ces points sur plusieurs sessions - même si la position de la configuration comportementale change légèrement par rapport à la caméra entre les sessions.
    5. Après avoir suivi les parties du corps à partir des données de comportement, prenez soin de filtrer les emplacements prévus des parties du corps en fonction de la confiance associée à la prédiction sur chaque image de la vidéo. Les prédictions de faible confiance sont habituellement associées à des parties occluses du corps. Pour de telles prédictions, remplacez une partie du corps donnée par une autre (si une telle substitution est appropriée) ou utilisez l’emplacement d’autres parties du corps pour prédire où la partie du corps pertinente est susceptible d’être. Pour la plupart des applications en plein champ, le centroïde du corps des rongeurs est rarement occlus et peut être prédit avec une grande précision et précision.
    6. Utilisez l’emplacement prévu du centroïde ainsi que l’emplacement des points suivis dans l’environnement pour estimer un certain nombre de caractéristiques du comportement de l’animal. Par exemple, dans les données en plein champ, le dérivé du temps de la position peut être utilisé pour calculer la vitesse de l’animal.
  2. Pour éviter les biais, effectuez toutes les expériences « aveugles » à l’égard du groupe expérimental lorsque c’est possible, en particulier lorsqu’il y a un élément subjectif dans l’évaluation des résultats. Test pour l’effet des différences entre les sexes sur les principaux résultats expérimentaux par la mise en commun des données en groupes masculins et féminins. Tous les tests statistiques sont conçus pour tester un nombre égal d’animaux entre les groupes.

9. Comptage cellulaire post-hoc pour caractériser l’étendue de la transfection cellulaire

  1. Déterminer le nombre de cellules transfectées par souris puisque toutes les souris n’auront pas une transfection réussie et qu’il y aura des variations dans le nombre de cellules transfectées. Une méthode pour y parvenir consiste à compter le nombre de neurones transfectés dans les sections coronales alternées suivies d’une interpolation pour estimer le nombre total de cellules transfectées. Pour cela, l’image et compter toutes les autres sections coronaires (50 μm).
    1. Utilisez des perfusions transcardiques avec 4% de PFA pour fixer les tissus, puis disséquer le cerveau. Après cryoprotection, section du cerveau en sections coronaires à 50 μm.
    2. Pour le cortex frontal, comptez les cellules à +2,75 et + 1,35 mm de Bregma. Ces coordonnées contiennent des zones corticales frontales et comprennent une partie du cortex somatosensory (S1).  Utilisant cette méthode, il n’y avait aucune cellule transfected observée dans les régions corticales plus caudales ou les secteurs subcortical.
    3. Assurez-vous de désigner la gauche à partir de l’hémisphère droit, comme marquer un hémisphère avec un trou d’aiguille pendant la section, et compter les cellules bilatéralement. Utilisez un logiciel automatisé de comptage cellulaire ou comptez manuellement les cellules, confirmant la présence d’un corps cellulaire à l’aide de DAPI.
  2. Une fois que le nombre de cellules est obtenu, fixez un seuil d’inclusion. Par exemple, n’incluez que les souris qui sont électroporées bilatéralement dans l’analyse. Pour une analyse plus approfondie, corréler le nombre de cellules transfectées avec des réponses comportementales pour voir s’il existe une association. Cette technique ciblera plusieurs zones cérébrales, il est donc nécessaire de fournir des informations sur les régions du cerveau qui ont été génétiquement manipulées.
    REMARQUE : Il est possible que la manipulation de certains gènes puisse modifier la migration neuronale, la spécification et/ou la mort. Assurez-vous pendant le comptage cellulaire que l’anatomie cérébrale est examinée et que chaque neurone transfecté se trouve dans la couche qui aurait été transfectée (c.-à-d. L2/3). Des mesures anatomiques brutes telles que l’épaisseur corticale peuvent également être quantifiées en mesurant la distance entre le pia et le cortical L6.

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Résultats

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Développement et mise en œuvre réussis d’un électroporateur sur mesure et de trois électrodes à dents.
Pour les IUI, un électroporateur sur mesure peu coûteux a été construit sur la base d’une conceptionprécédemment décrite 27 (figure 1A et figure 2). Une électrode à trois volets a étéfaite 23,24 à l’aide de forceps en plastique avec 2 électrodes négatives atta...

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Discussion

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Dans ce cas, un pipeline est décrit qui combine la manipulation de nouveaux gènes d’intérêt dans de grandes populations de neurones corticals frontaux avec des analyses comportementales chez la souris. En outre, ce pipeline permet l’étude longitudinale du comportement chez les mêmes souris à la fois au cours du développement postnatal précoce et à l’âge adulte. Cette technique contourne la nécessité de s’appuyer sur des modèles animaux génétiques qui peuvent être coûteux en termes de temps et de dépenses. La force de ce ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Nous remercions Lisa Kretsge pour les commentaires critiques et l’édition du manuscrit. Nous remercions tous les assistants de recherche du laboratoire Cruz-Martín qui ont été précieux pour aider aux perfusions et au comptage cellulaire des cerveaux comportementaux. Nous remercions Andrzej Cwetsch pour son apport sur la conception de l’électrode tripolar, et Todd Blute et le centre d’imagerie en biologie de l’Université de Boston pour l’utilisation du microscope confocal. Ces travaux ont été appuyés par une subvention pour les jeunes chercheurs de la NARSAD (AC-M, #27202), le Prix Brenton R. Lutz (ALC), le Prix I. Alden Macchi (ALC), le NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) et le Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Suture tressée noire en soie 13mmHavel’sSB77DSuture peau
Adson ForcepsF.S.T.11006-12
IUE C270 WebcamLogitechN/AComportement d’enregistrement
ÉlectroporateurConstruit sur mesureN/AVoir les figures 1 et 2 et Bullmann et al, 2015
EZ-500 Colonne de spin Plasmide ADN Maxi-preps Kit, 20prepsBio Basic Inc.BS466Préparation Pladmid
Vert rapide FCFSigmaF7252-5GColorant pour solution d’ADN
Ciseaux fins - tranchantsF.S.T.14060-09IUE
Fisherbrand Éponges de gazeFisher Scientific1376152IUE
Gaymar Chauffage/RefroidissementBraintreeTP-700Coussin chauffant
Extracteur de pipette en verreSutter Instrument,P-97IUE
Pipettes en verreSutter Instrument,BF150-117-10IUE
Lotion dépilatoireNairN/AÉpilation
Hartman HemostatsF.S.T.13002-10IUE
Labyrinthe à champ ouvert - manège en acrylique fait maisonConstruit sur mesureN/A50 & times ; 50 & times ; 30 cm longueur-largeur-hauteur
pCAG-GFPAddgene11150Vecteur d’expression de mammifère pour l’expression de GFP
Picospritzer IIIParker HannifinN/AInjecteur de pression
Écarteur - 2 broches BluntF.S.T.17023-13IUE
Pince à anneauF.S.T.11103-09
IUE Stérilisateur, perle sècheSigmaZ378569stereliser les outils chirurgicaux
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET À L’USAGE VÉTÉRINAIRE UNIQUEMENTHavel’sHJ398Suture muscle
Bain d’eauCole-ParmerEW-12105-84sérum physiologique chauffant

Références

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Mots-clés

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