Outils ARNi spécifiques aux tissus pour identifier les composants de la signalisation du stress systémique

Résumé

Le maintien de la protéostasie de l’organisme nécessite la coordination des réponses de contrôle de la qualité des protéines, telles que l’expression du chaperon d’un tissu à un autre. Ici, nous fournissons des outils utilisés chez C. elegans qui permettent de surveiller la capacité de protéostasie dans des tissus spécifiques et de déterminer les réponses de signalisation intercellulaires.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une augmentation transformatrice des connaissances autour de la régulation des processus de contrôle de la qualité des protéines, dévoilant l’importance des processus de signalisation intercellulaires dans la régulation de la protéostasie cellulaire non autonome. Des études récentes commencent maintenant à découvrir des composants de signalisation et des voies qui coordonnent le contrôle de la qualité des protéines d’un tissu à l’autre. Il est donc important d’identifier les mécanismes et les composants du réseau de protéostasie (PN) cellulaire non autonome et sa pertinence pour le vieillissement, les réponses au stress et les maladies de mauvais repliement des protéines. En laboratoire, nous utilisons l’inhibition génétique par l’ARNi spécifique des tissus en combinaison avec des rapporteurs de stress et des capteurs de protéostasie spécifiques aux tissus pour étudier cela. Nous décrivons des méthodologies pour examiner et identifier les composants de la PN non autonome cellulaire qui peuvent agir dans les tissus percevant une condition de stress et dans les cellules répondantes pour activer une réponse protectrice. Nous décrivons d’abord comment générer des constructions d’ARNi en épingle à cheveux pour l’inactivation génétique constitutive dans des tissus spécifiques et comment effectuer une inactivation génétique spécifique à un tissu en nourrissant l’ARNi à différents stades de la vie. Les rapporteurs de stress et les tests comportementaux fonctionnent comme des lectures précieuses qui permettent le dépistage rapide des gènes et des conditions modifiant les processus de signalisation systémique du stress. Enfin, les capteurs de protéostasie exprimés dans différents tissus sont utilisés pour déterminer les changements dans la capacité spécifique tissulaire de la PN à différents stades de développement et de vieillissement. Ainsi, ces outils devraient aider à clarifier et à permettre de surveiller la capacité de la NP dans des tissus spécifiques, tout en aidant à identifier les composants qui fonctionnent dans différents tissus pour médier la NP non autonome dans un organisme.

Introduction

La protéostasie cellulaire est surveillée par un réseau complexe de composants de contrôle de la qualité des protéines tels que les chaperons moléculaires, les réponses au stress et les mécanismes de dégradation, y compris le système ubiquitine-protéasome (UPS) et l’autophagie ^1,2. L’activation des voies de réponse au stress, telles que la réponse au choc thermique (HSR) médiée par HSF-1, la réponse protéique dépliée du réticulum endoplasmique (UPR^ER) et des mitochondries (UPR^mito) est vitale pour l’adaptation cellulaire et la survie lors de défis environnementaux ou de maladies de mauvais repliement des protéines qui conduisent à l’agrégation de protéines toxiques 1,2,3,4,5^{, 6}. Planche à voile

La protéostasie cellulaire est coordonnée par une couche supplémentaire dans les organismes multicellulaires, tels que C. elegans, qui nécessite l’orchestration des réponses cellulaires au stress à travers différents tissus pour activer les composants de contrôle de la qualité des protéines protectrices tels que les chaperons moléculaires⁷. Au cours de la dernière décennie, l’activation cellulaire non autonome des voies de réponse au stress « cellulaire » a été observée pour la réponse au choc thermique (HSR),^{l’UPR ER} et l’UPR^mito, ainsi que pour la signalisation chaperon transcellulaire (TCS)3,4,7,8,9,10 . Dans chaque cas, le système nerveux ainsi que la signalisation de l’intestin jouent un rôle crucial dans le contrôle de l’activation des chaperons à travers les tissus, pour se protéger contre les conséquences toxiques des stress aigus et chroniques de mauvais repliement des protéines 3,5,9,11. Cette transmission des neurones vers l’intestin et d’autres cellules de la périphérie peut être réalisée par des neurotransmetteurs, comme c’est le cas pour^{l’UPR ER} et le HSR ^6,8,11. Dans une forme de signalisation cellulaire non autonome du stress, TCS, qui est activée par l’expression accrue de HSP-90 dans les neurones, les peptides immunitaires sécrétés jouent un rôle dans l’activation de l’expression chaperonne de hsp-90 des neurones vers le muscle⁵. Dans une autre forme de TCS, la réduction de l’expression du principal chaperon moléculaire hsp-90 dans l’intestin conduit à une augmentation de l’expression de hsp-70 induit par la chaleur à une température permissive dans le muscle de la paroi corporelle ^5,10. Dans ce cas particulier, les molécules de signalisation spécifiques activées dans l’intestin sensible au stress et les cellules musculaires répondantes sont cependant inconnues.

Ainsi, afin d’identifier comment l’expression du chaperon est activée d’un tissu à l’autre, une approche est nécessaire qui permet de suivre la capacité du réseau de protéostasie (PN) et l’activation de la réponse au stress au niveau spécifique du tissu. Pour déterminer quelle voie de réponse au stress est activée dans les tissus individuels, une sélection disponible de rapporteurs chaperons transcriptionnels fusionnés à des marqueurs protéiques fluorescents peut être utilisée (voir également le tableau 3). Il s’agit notamment des rapporteurs transcriptionnels hsp-90, hsp-70 et hsp-16.2 marqués par fluorescence qui indiquent l’induction du HSR, hsp-4 qui indique l’activation de l’UPR^ER et hsp-6, indiquant l’UPR^mito. La combinaison de ces rapporteurs avec une condition de stress spécifique au tissu permet alors une lecture puissante qui permettra de localiser les tissus individuels répondant à un déséquilibre du NP dans un tissu distal « émetteur » percevant le stress. Pour induire un état de stress ou un déséquilibre du NP dans un tissu spécifique, différentes approches peuvent être adoptées. Par exemple, l’une de ces approches consiste à exprimer ectopiquement la forme activée d’un facteur de transcription du stress (par exemple, xbp-1s) et une autre consiste à réduire les niveaux d’expression d’un chaperon moléculaire essentiel (par exemple, hsp-90) à l’aide de promoteurs spécifiques aux tissus ^8,10. Pour épuiser les composants de la NP dans un seul type de cellule, l’inactivation spécifique du tissu par l’ARNi est un outil utile.

Chez C. elegans, l’ARNi est cependant systémique ; L’ARN double brin dans l’environnement peut pénétrer et se propager dans tout l’animal pour faire taire un gène ciblé^12,13. Cette propagation systémique de l’ARNdb ingéré est médiée par les protéines SID (ARNi systémique défectueux), telles que les protéines SID-1 et SID-2 qui sont des transporteurs d’ARNdb, ainsi que par SID-5, qui colocalise avec les protéines endosomiques tardives et est impliquée dans l’exportation de l’ARNdb 14,15,16 ingéré. SID-1 est une protéine transmembranaire à passages multiples dans toutes les cellules sauf les neurones, et est nécessaire à l’exportation et à l’importation de l’ARNdb dans les cellules¹⁷. L’expression de SID-2 est limitée à l’intestin où elle fonctionne comme un récepteur endocytaire pour l’ARNdb ingéré de la lumière intestinale dans le cytoplasme des cellules intestinales¹⁶. Les neurones ne répondent pas à l’ARNi systémique, ce qui est corrélé à une expression réduite de la protéine transmembranaire SID-1 dans les neurones, qui est essentielle pour que l’ARNdb soit importé^15,18. Ainsi, pour que l’ARNi spécifique des tissus soit efficace dans un seul type de cellule, la propagation systémique de l’ARNdb doit être évitée. Cela peut être réalisé en utilisant le mutant sid-1 (pk3321) résistant à l’ARNi qui empêche la libération et l’absorption de l’ARNdb à travers les tissus¹⁵. L’expression d’une construction d’ARNi en épingle à cheveux spécifique à un tissu chez ce mutant ou l’expression ectopique de SID-1 dans un tissu spécifique peut alors compléter la fonction du mutant sid-1 et permettra d’obtenir de l’ARNi¹⁹ spécifique au tissu.

Alors, comment l’ARNdb est-il ingéré par l’intestin dans un mutant de perte de fonction sid-1 et comment peut-il ensuite atteindre les neurones ou les cellules musculaires qui expriment de manière ectopique une construction SID-1 ? Dans un modèle actuel expliquant ce mécanisme, l’ARNdb endocytosé est absorbé dans le cytoplasme intestinal via SID-2, puis exporté dans le pseudocœlome par un autre mécanisme indépendant de SID-1, impliquant SID-5 et la transcytose¹⁷. Ainsi, comme SID-1 est nécessaire pour l’importation d’ARNdb¹⁷, seules les cellules exprimant SID-1 de type sauvage seront capables d’absorber l’ARNdb libéré de l’intestin dans le pseudocœlome.

Ici, nous démontrons l’utilisation d’un ensemble d’outils qui permettent d’utiliser des ARNi spécifiques aux tissus. Nous utilisons l’exemple du chaperon moléculaire Hsp90 pour décrire la construction de l’ARNi en épingle à cheveux qui peut être utile pour inhiber constitutivement l’expression génique dans un tissu spécifique¹⁰. L’approche décrite pourrait être utilisée pour n’importe quel gène cible d’intérêt. La réponse d’autres tissus au déséquilibre de la protéostasie causé par l’ARNi hsp-90 spécifique des tissus peut être sondée en surveillant l’expression des rapporteurs de stress marqués par fluorescence dans d’autres tissus. Comme deuxième méthode pour l’ARNi spécifique aux tissus, nous démontrons comment le système mutant sid-1 peut être adapté pour nourrir des bactéries exprimant l’ARNi plutôt que pour l’expression d’une construction d’ARNi en épingle à cheveux. Cela peut être utile lors de la réalisation d’un dépistage d’ARNi candidat ou à l’échelle du génome pour identifier les composants nécessaires à une réponse spécifique au tissu. De même, les défauts de développement associés à l’épuisement d’un composant vital de la PN nécessiteront une inhibition médiée par l’ARNi dans des tissus spécifiques à des stades ultérieurs du développement. Nous démontrons comment un système de complémentation SID-1 peut être utilisé sur un crible d’ARNi candidat pour des modificateurs de TCS spécifiques aux tissus. Dans l’exemple, nous visons à identifier les composants de signalisation qui, lorsqu’ils sont inactivés dans le tissu émetteur « percevant le stress » (intestin) et le tissu affectant le stress (muscle), conduisent à la modification de l’expression d’un rapporteur hsp-70 marqué par fluorescence dans les cellules musculaires.

Protocole

1. L’ARNi spécifique du tissu de deux manières : l’ARNi en épingle à cheveux et la complémentation SID-1 spécifique du tissu

1. Génération de constructions d’ARNi en épingle à cheveux pour l’expression tissulaire spécifique chez les mutants sid-1
   1. Amplifier la séquence du gène cible (p. ex., séquence hsp-90 isolée du clone ARNi hsp-90 de la banque d’ARNi²⁰ d’Ahringer) par PCR. Placez une séquence non palindromique à l’extrémité 3' de la séquence hsp-90, c’est-à-dire un site SfiI (ATCTA)²¹.
      REMARQUE : Les amorces utilisées pour cloner le hsp-90 avec la séquence SfiI (soulignée) sont :
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Sous-clonez la séquence amplifiée dans le vecteur du kit de clonage commercial (par exemple, TOPO pCR BluntII).
   3. Isolez la séquence inversée hsp-90 du clone ARNi hsp-90 (banque d’ARNi Ahringer)²⁰ par digestion par restriction à l’aide des sites de restriction XbaI et PstI et placez-la en aval de la séquence hsp-90-SfiI dans le vecteur (à partir de l’étape 1.1.1), ce qui permet d’obtenir une construction en épingle à cheveux hsp-90 (Figure 1).
   4. Sous-cloner la construction en épingle à cheveux en un vecteur d’entrée Gateway pDONR221 et la fusionner avec des clones d’entrée Gateway qui contiennent des promoteurs spécifiques aux tissus pour l’une ou l’autre expression dans les neurones (rgef-1p) ; dans l’intestin (VHA-6P) ; ou le muscle de la paroi corporelle (unc-54p) et l’unc-54 3'UTR (ou tout autre 3'UTR de choix) dans une réaction Gateway telle que décrite dans le protocole du fournisseur.
   5. Linéariser les constructions d’ARNi en épingle à cheveux résultantes (Figure 1) à l’aide d’un site de restriction unique en dehors de la séquence codante et micro-injecter en tant que réseau complexe à une concentration de 1 ng/μL d’ARNi en épingle à cheveux, mélangé à 100 ng/μL d’ADN génomique N2 Bristol (digéré avec ScaI) dans une souche de C. elegans exprimant le rapporteur hsp-70p ::RFP (souche AM722) et croisé dans le fond génétique de sid-1(pk3321) mutants (souche NL3321). Pour un protocole sur la façon d’effectuer la micro-injection de réseaux complexes, veuillez suivre²².
   6. En tant que contrôle négatif, utilisez des constructions en épingle à cheveux vectorielles vides exprimant la séquence non palindromique contenant SfiI (GGCCATCTAGGCC) sous le contrôle d’un promoteur spécifique au tissu.
   7. Utilisez l’augmentation de l’expression hsp-70p ::RFP du rapporteur comme lecture pour marquer des transformants positifs exprimant l’ARNi en épingle à cheveux hsp-90 (Figure 3). Pour une approche plus générale visant à vérifier l’inactivation spécifique au tissu de tout gène d’intérêt, mesurez les niveaux d’ARNm de l’animal entier à l’aide de la qRT-PCR du gène d’intérêt.
   8. Intégrer le réseau extrachromosomique de la souche résultante exprimant la construction en épingle à cheveux hsp-90 spécifique de l’intestin (PVH2 ; voir tableau 1) par irradiation gamma. Pour l’intégration des réseaux extrachromosomiques dans le génome, veuillez consulter la^{section 22}.
2. Expression de SID-1 spécifique au tissu pour permettre l’ARNi spécifique du tissu en nourrissant des bactéries exprimant l’ARNdb
   1. Sous-clonez l’ADN génomique sid-1 du vecteur TU867 (unc-119p ::SID-1⁾¹⁹ dans le vecteur d’entrée de la passerelle pDONR221. Des amorces pour le clonage de l’ADN de sid-1 peuvent être trouvées dans¹⁹. Fusionner la construction sid-1 pDONR221 avec des clones d’entrée de Gateway contenant des promoteurs spécifiques du muscle (myo-3p) ou de l’intestin (vha-6p) et le unc-54 3'UTR (ou tout autre 3'UTR de choix) dans la réaction de Gateway, comme décrit précédemment en 1.1.4.
   2. Microinjectez les constructions résultantes vha-6p ::SID-1 ::unc-54 3'UTR ou myo-3p ::SID-1 ::unc-54 à une concentration de 30 ng/μL avec un marqueur de co-injection pharyngée fluorescent rouge (par exemple, myo-2p ::RFP ; 5 ng/μL) dans des mutants sid-1(pk3321).
   3. Intégrer dans le génome les réseaux sid-1 extrachromosomiques spécifiques de l’intestin ou des muscles dans le génome, comme décrit au^{point 22}. Ici, cela a abouti aux souches PVH5 [myo-3p ::SID-1 ; myo-2p ::RFP] ; sid-1(pk3321) et PVH65 [vha-6p ::SID-1 ; myo-2p ::RFP] ; Sid-1(PK3321).
   4. Pour l’expression neuronale de sid-1 chez le mutant sid-1(pk3321), utiliser la souche TU3401 uIs3401[unc-119p ::SID-1 ; myo-2p ::RFP] ; sid-1(pk3321) qui a été généré précédemment par Calixto et ^al.19.
   5. Comme mentionné à la section 1.1.7, assurez-vous de l’inhibition tissulaire du gène d’intérêt en mesurant les niveaux d’ARNm du gène cible souhaité par qRT-PCR. Vous pouvez également confirmer la sensibilité à l’ARNi spécifique du tissu en utilisant une protéine fluorescente (p. ex., GFP ou RFP) exprimée dans le même tissu et traiter les vers avec de la GFP ou de l’ARNi RFP. Exposer les nématodes à l’ARNi GFP/RFP sous forme de larves synchronisées au stade L1 et se développer sur les bactéries ARNi jusqu’au premier jour de l’âge adulte (voir la figure 2). Dans notre cas, nous avons utilisé des souches exprimant SID-1 dans les neurones, le muscle ou l’intestin et les avons croisées avec des souches exprimant HSP-90 ::RFP dans les neurones (AM987), dans l’intestin (AM986) et dans le muscle (AM988).

2. Utilisation de rapporteurs de stress et de capteurs de protéostasie pour surveiller la protéostasie cellulaire autonome et non autonome

REMARQUE : Pour surveiller la capacité de NP dans des tissus spécifiques, utilisez des capteurs de protéostasie spécifiques aux tissus (tels que les souches exprimant Q44 dans l’intestin ou Q35 dans le muscle - voir le tableau 3) et des rapporteurs de stress (tels que le rapporteur hsp-70p ::mCherry induit par la chaleur ; Tableau 3).

1. Croisement génétique de l’allèle mutant sid-1 (pk3321) dans une souche capteur de protéostasie et confirmation de la présence de sid-1(pk3321) en donnant de l’ARNi
   1. Croiser génétiquement la souche du capteur de protéostase/rapporteur de stress dans le patrimoine génétique de la souche mutante SID-1 (PK3321). Pour établir des croisements génétiques entre différentes souches transgéniques, veuillez suivre^{le protocole 23} pour un protocole détaillé.
      REMARQUE : Les mutants sid-1(pk3321) sont résistants à l’ARNi nourricier et, par conséquent, le traitement des embryons avec de l’ARNi contre un gène essentiel (tel que elt-2 ou hsp-90) n’entraînera que des arrêts du développement ou une létalité larvaire chez les souches hétérozygotes ou de type sauvage pour le gène sid-1 .
   2. Laisser 10 hermaphrodites gravides pondre des œufs sur des plaques d’ARNi contre elt-2 ou hsp-90 et contrôler (vecteur vide ; EV) à 20 °C. Retirez les mères après 1 à 2 h. Utilisez N2 Bristol et le mutant sid-1(pk3321) comme témoins.
   3. Observez le développement des larves sur les plaques d’ARNi au cours des 2-3 prochains jours. ELT-2 L’ARNi entraînera l’arrêt larvaire L1, tandis que l’ARNi hsp-90 entraînera l’arrêt larvaire L3 dans l’ARN N2 Bristol. Les mutants sid-1 ne seront pas affectés par le traitement ARNi et deviendront des adultes gravides.
      REMARQUE : C. elegans homozygote pour sid-1 (PK3321) montrera une population uniforme se développant jusqu’à l’âge adulte. Les hétérozygotes seront indiqués par des populations mixtes de certains animaux présentant un arrêt larvaire, et certains animaux devenant adultes.
2. Confirmation de la présence de sid-1(pk3321) par génotypage
   1. Prélever 15 à 20 vers de la souche F2 candidate sélectionnée dans un tube PCR contenant 15 μL de tampon de lyse de vers (tableau 2).
   2. Placez le tube à -80 °C pendant au moins 10 min ou toute la nuit.
   3. Incuber le tube dans la machine PCR à l’aide du programme suivant :
   4. 65 °C pendant 60 min (ver de lyse) ; 95 °C pendant 15 min (inactivation de la protéinase K) ; maintenir à 4 °C.
   5. Utilisez 2 μL de lysat de ver comme « matrice » pour effectuer la réaction PCR pour le génotypage, en utilisant les amorces suivantes pour sid-1 : sid-1 forw : 5'-agctctgtacttgtattcg-3' et sid-1 rev : 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Utilisez le programme suivant pour le génotypage par PCR : 1 cycle à 95 °C pendant 3 min ; puis 30 cycles de 95 °C pendant 10 , 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; 1 cycle à 72 °C pendant 10 min, maintien à 4 °C.
   7. Purifier le produit PCR de ~650 pb à l’aide d’un kit de purification PCR (Table des matériaux) et séquencer le produit PCR sid-1 pour identifier la mutation du point G à A de l’allèle sid-1 (pk3321). Alternativement, la mutation du point G à A crée un site de restriction ApoI, qui peut être utilisé sur le produit PCR pour le génotypage comme décrit en²⁴.
3. Utilisation de iQ44 ::YFP comme capteur de protéostasie pour l’intestin
   1. Synchroniser C . elegans exprimant Q44 ::YFP dans l’intestin (souche OG412) ou croisé avec le fond mutant sid-1(pk3321) par blanchiment, en suivant le protocole décrit en²⁵. Déposer les larves synchronisées en L1 sur un milieu de croissance des nématodes (NGM) de 9 cm-plaque de gélose contenant des bactéries OP50 et croître jusqu’au stade L4 à 20 °C.
   2. Prélevez les animaux L4 en lavant les vers de la plaque à l’aide de 5 ml de tampon M9. Transférez le tampon M9 contenant les vers L4 dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette en verre ou d’une pipette en plastique siliconé, puis centrifugez à 1000 x g pendant 1 min à température ambiante pour granuler doucement les vers. Retirez le surnageant avec précaution, en veillant à ce que la pastille de ver ne soit pas dérangée.
   3. Étape critique : Pour transférer ou plaquer les nématodes, utilisez une pipette en verre ou une pointe de pipette en plastique qui a été traitée avec un agent siliconant (p. ex., SigmaCote) conformément aux instructions du fabricant. Cela permet d’éviter que les vers ne collent à la surface en plastique d’une pointe de pipette.
   4. Répétez l’étape 2.3.2 trois fois de plus pour éliminer toutes les bactéries OP50 des vers.
   5. Prélever la pastille de vers dans 5 mL de tampon M9 et compter le nombre de vers présents dans 10 μL.
   6. Plaquez les animaux L4 sur des plaques de gélose NGM de 6 cm contenant des bactéries vides de lutte antivectorielle (EV) ou de l’ARNi hsp-90 à une densité de 10 vers par plaque (préparez 5 plaques par point temporel et répliquez biologiquement) et incubez pendant 24 à 48 heures à 20 °C.
   7. Après 24 heures (= jour 1 adultes) et 48 heures (= jour 2 adultes), comptez le nombre de foyers Q44 dans les intestins des nématodes présentant des agrégats. Évaluez un total de 30 à 50 nématodes par répétition biologique.

3. Criblage d’ARNi candidat spécifique au tissu pour les modificateurs de la protéostasie cellulaire non autonome

REMARQUE : Pour le dépistage de l’ARNi spécifique aux tissus, nous avons utilisé la souche PVH172 permettant l’ARNi spécifique de l’intestin en nourrissant les bactéries ARNi et la souche PVH171 permettant l’ARNi spécifique du muscle (voir le tableau 1 pour le génotype).

1. Préparation des plaques d’ARNi candidates
   1. Préparez des plaques de gélose NGM de 6 cm complétées par 100 μg/mL d’ampicilline, 12,5 μg/mL de tétracycline et 1 mM d’IPTG selon les méthodes standard²⁵.
   2. Utilisez la banque d’ARNi d’Ahringer pour obtenir les clones d’ARNi candidats pour le criblage d’ARNi²⁰.
   3. Inoculer 3 mL de milieu LB-amp (50 μg/mL d’ampicilline dans un milieu LB) dans un tube d’au 15 mL avec le clone ARNi souhaité à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. Cultiver à 37 °C pendant la nuit en agissant.
   4. Le lendemain, ajouter de l’isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (à partir d’un stock de 1 M) à une concentration finale de 1 mM dans la culture bactérienne de nuit.
   5. Agiter les cultures pendant 3 h supplémentaires à 37 °C.
   6. Déposer 300 μL de culture d’ARNi bactérien sur une plaque de gélose NGM de 6 cm complétée par 100 μg/mL d’ampicilline, 12,5 μg/mL de tétracycline et 1 mM d’IPTG. Laissez sécher les plaques sur le banc pendant 2 jours à température ambiante, recouvertes de papier d’aluminium pour les protéger de la lumière. Une fois sèches, les plaques d’ARNi peuvent être conservées dans une boîte à 4 °C pendant plusieurs semaines.
2. Synchronisation de C. elegans et traitement avec des bactéries ARNi
   1. Pour synchroniser les souches de vers, prélever 15 adultes gravides sur des plaques d’ARNi et laisser pondre des œufs pendant 1 h. Retirez ensuite les adultes de l’assiette.
   2. Étape critique : La synchronisation par blanchiment est évitée dans ce cas, car elle peut induire le rapporteur hsp-70p ::RFP , car il s’agit d’une condition stressante pour C. elegans.
   3. Prélever les larves synchronisées du stade L4 et les transférer sur une plaque ARNi fraîche.
   4. Laisser les nématodes se développer sur l’ARNi pertinent pendant deux générations pour assurer une absorption efficace de l’ARNdb, en veillant à ce que la température soit maintenue à 20 °C.
   5. Pour l’imagerie et la quantification de la fluorescence hsp-70p ::RFP , utilisez Day 1 adults.
3. Préparation des lames de microscope
   1. Préparez les lames de microscope en plaçant ~250 μL d’une solution d’agarose à 2 % (dans un tampon M9) sur une lame de microscope en verre et une deuxième lame placée sur le dessus pour créer un disque plat.
   2. Placez 5 μL de solution de lévamissole 5 mM (dans le tampon M9) sur le tampon d’agarose et transférez 5 vers adultes du jour 1 dans la goutte de lévamisole. Laissez les nématodes paralyser pendant 5 min.
   3. Une fois que C. elegans est paralysé, alignez-le soigneusement avec un pic en fil de platine et retirez l’excès de lévamisole avec une lingette de laboratoire avant d’ajouter une lamelle.
   4. Étape critique : Assurez-vous de prendre des images des vers dans les 30 minutes suivant la préparation des lames de microscope. Les nématodes paralysés sur la lame de microscope peuvent se dessécher et éclater, ce qui peut compromettre les mesures de fluorescence.
4. Réglages du microscope et analyse d’images
   REMARQUE : Les images sont obtenues à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une caméra EM-CCD et d’un logiciel d’automatisation et d’analyse d’images de microscopie.
   1. Prenez des images à des grossissements de 10x à l’aide d’un laser de 561 nm pour l’excitation de fluorescence RFP. Assurez-vous que toutes les images sont prises en utilisant les mêmes paramètres de puissance laser, de taille de sténopé et de gain de fluorescence pour permettre les comparaisons.
   2. Enregistrez toutes les images sous forme de fichiers TIFF.
   3. Effectuez une analyse d’image à l’aide d’ImageJ. Mesurez l’intensité de la fluorescence dans chaque image en pixels par unité de surface, en soustrayant la fluorescence d’arrière-plan. Normalisez l’intensité de fluorescence de chaque image en fonction de la zone de l’image ainsi que de la longueur des vers.
   4. Mesurer l’intensité moyenne à l’aide de l’outil Analyser | Mesurez en ImageJ. Normalisez la valeur d’intensité résultante à la zone de l’image en divisant l’intensité par la surface.
   5. Pour normaliser l’intensité à la longueur du ver, mesurez le ver en traçant une ligne le long de la longueur du ver dans ImageJ et en utilisant Analyze | Mesurer. La raison de la normalisation de l’intensité de la fluorescence à la longueur du ver est que la taille des vers peut varier, en fonction du gène qui est désactivé par l’ARNi, ce qui pourrait affecter l’intensité moyenne.
   6. Normaliser les intensités de fluorescence mesurées pour les témoins non traités (c.-à-d. C .elegans cultivé sur des plaques d’ARNi témoins (EV). Regroupez les valeurs normalisées pour comparer les intensités moyennes de fluorescence pour chaque condition d’ARNi. Essayez d’imager 20 vers par réplication biologique et de collecter au moins 3 images répliquées biologiques.
   7. Calculez les valeurs P des valeurs moyennes d’intensité de fluorescence à l’aide du test t de Student et effectuez une correction pour plusieurs tests à l’aide de la méthode de Benjamini-Hochberg, en utilisant un taux de fausses découvertes de 0,05.

Résultats

ARNi spécifique du tissu de deux manières : Expression de constructions en épingle à cheveux ou complémentation SID-1 spécifique du tissu
L’expression de constructions d’ARNi en épingle à cheveux spécifiques aux tissus permet l’inactivation constitutive d’un gène tout au long du développement. Cependant, cela peut parfois être peu pratique lorsque le gène étudié est nécessaire à l’organogenèse de ce tissu particulier, comme elt-2 qui est nécessaire au développement de l’intestin

Discussion

Les méthodes décrites ici démontrent l’utilisation d’outils qui permettent l’inactivation tissulaire spécifique des composants de la PN de manière constitutive et temporelle. Nous avons précédemment identifié la TCS, un mécanisme de réponse cellulaire non autonome au stress qui est induit par une altération tissulaire spécifique des niveaux d’expression¹⁰ de Hsp90. L’inactivation tissulaire spécifique de hsp-90 par l’expression de l’ARNi en épingle à chev...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ampicilline	Merck	A0166-5G	Protocole Section 3.1.
ADN propre & Concentrateur-500	Zymo Research	D4031	Protocole Section 2.2.
IPTG Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocole Section 3.1.
Kit de clonage de passerelle multisite	Thermo Fisher	12537100	Protocol Section 1.2.
Protocole SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Section 2.3.
Tétracycline	Merck	T7660-5G	Protocole Section 3.1.
Kit de clonage TOPO PCR Zero Blunt	Protocole K280002		Section 1.1.