Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série

Résumé

De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Résumé

La motilité est cruciale pour la survie et le succès de nombreuses espèces bactériennes. De nombreuses méthodologies existent pour exploiter la motilité afin de comprendre les voies de signalisation, d’élucider la fonction et l’assemblage des pièces flagelleuses, et d’examiner et de comprendre les modèles de mouvement. Nous démontrons ici une combinaison de trois de ces méthodologies. La motilité dans la gélose molle est la plus ancienne, offrant une sélection forte pour isoler des mutations de suppresseur de gain-de-fonction dans les contraintes motilité-altérées, où la motilité est reconstituée par une deuxième mutation. La technique d’attache cellulaire, d’abord employée pour démontrer la nature rotative du moteur flagellaire, peut être employée pour évaluer l’impact des effecteurs de signalisation sur la vitesse du moteur et sa capacité à commuter la direction de rotation. L’analyse du « passage de la frontière » est plus récente, où les bactéries nageurs peuvent être amorcées pour passer à se déplacer collectivement comme un essaim. En combinaison, ces protocoles représentent une approche systématique et puissante pour identifier les composants de la machinerie de motilité, et pour caractériser leur rôle dans différentes facettes de la natation et de l’essaimage. Ils peuvent être facilement adaptés pour étudier la motilité chez d’autres espèces bactériennes.

Introduction

Les bactéries emploient de nombreux appendices pour le mouvement et la dispersion dans leurs niches écologiques¹. La motilité induite par flagelles est la plus rapide d’entre elles, favorisant la colonisation de lieux favorables en réponse aux signaux environnementaux, et contribuant de manière significative à la capacité pathogène de certaines espèces^2,3. Les bactéries flagellées peuvent nager individuellement dans un liquide en vrac, ou essaimer en tant que collectif sur une surface semi-solide⁴. Les flagelles extracellulaires se fixent et sont entraînés par de....

Protocole

1. Isolement des mutants suppresseurs dans des souches déficientes en motilité

REMARQUE: Utilisez cette méthode comme un large « fourre-tout » pour identifier la nature générale du défaut de motilité.

1. Préparation de plaque de gélose molle
   REMARQUE: Soft-agar, également appelé motility- ou swim-agar, est une gélose à faible pourcentage (~ 0,2-0,35% p / v), longtemps utilisée pour analyser la chimiotaxie^31,32.
   1. Ajouter 3 g de bacto-agar (0,3 % p/v) et 20 g de LB dans une fiole inférieure ronde de 2 L. Ajouter 1 L de ddH₂O (eau doublement....

Résultats

L’isolement des pseudo-rétractants dans une souche d’E. coli dont la motilité est altérée par des niveaux élevés de la molécule de signalisation c-di-GMP, a été détaillé dans des travaux récents de notre laboratoire^34. Cette souche (JP1442) a abrité deux mutations : ΔyhjH et ΔycgR. YhjH est la phosphodiestérase la plus active qui dégrade c-di-GMP chez E. coli. L’absence de YhjH conduit à des niveaux élevés de c-di-GMP et à l’inhibition de la motilité. YcgR est u.......

Discussion

L’isolement et la caractérisation des mutations suppresseurs ont contribué avec succès à identifier les composants clés du système de chimiotaxie^35,36,37,ainsi que la machinerie motrice elle-même^38,39,40. Lors de l’utilisation du protocole 1, il est important d’inclure plusieurs répétitions indépendantes pour assurer l’isolement d’un la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactifs
Bacto Agar déshydraté	Fisher Scientific	DF0140-15-4
EDTA Sel disodique, dihydraté	Fisher Scientific	02-002-786
Eiken agar	Eiken Chemical Co. Japon	E-MJ00	Essentiel pour l’essaimage de E. coli
Glucose D (+)	Fisher Scientific
LB (Lennox) Bouillon	Fisher Scientific	BP1427-500
Solution de poly-L-lysine (0,1 %)	Sigma-Aldrich	P8920
Chlorure de potassium (KCl)	Fisher Scientific	18-605-496
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP362-500
Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Materials and Equipment
Logiciel d’imagerie de microscope CellSense (V. 1.6)	Olympus		Ou logiciel équivalent pour microscope utilisé
Microscopie électronique Sciences Scotch 666 Ruban adhésif double face	Fisher	50-285-28
Lames de microscope givrées 3x1x1mm	Fisher	12-550-343
Microscope Olympus BX53	Olympus	BX53	N’importe quel microscope à phase verticale ou à phase inversée peut être utilisé
Boîtes de Pétri (100 mm de diamètre)	Fisher Scientific	FB0875712	Pour les dosages en gélose molle
Nébuliseur en polyéthylène Tube capillaire (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)	Perkin Elmer
Boîte de Pétri ronde à 2 compartiments	VWR	89200-944	Pour le franchissement des frontières
Aiguilles hypodermiques de sécurité (23G)	Fisher Scientific	14-826A
Seringue stérile - 1 mL	Fisher scientific	14-955-450
Lingettes de travail/tissulettes	Fisher scientific	06-666	Ou lingettes tissulaires à usage unique équivalentes
VWR micro verre-couverture 18x18mm	VWR	48366205
XM10 appareil photo	Olympus	XM10	Ou appareil photo microscope équivalent

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