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Article de méthode

Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série

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DOI :

10.3791/61364

⸱

10 mai 2020

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Dans cet article

Résumé

De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Résumé

La motilité est cruciale pour la survie et le succès de nombreuses espèces bactériennes. De nombreuses méthodologies existent pour exploiter la motilité afin de comprendre les voies de signalisation, d’élucider la fonction et l’assemblage des pièces flagelleuses, et d’examiner et de comprendre les modèles de mouvement. Nous démontrons ici une combinaison de trois de ces méthodologies. La motilité dans la gélose molle est la plus ancienne, offrant une sélection forte pour isoler des mutations de suppresseur de gain-de-fonction dans les contraintes motilité-altérées, où la motilité est reconstituée par une deuxième mutation. La technique d’attache cellulaire, d’abord employée pour démontrer la nature rotative du moteur flagellaire, peut être employée pour évaluer l’impact des effecteurs de signalisation sur la vitesse du moteur et sa capacité à commuter la direction de rotation. L’analyse du « passage de la frontière » est plus récente, où les bactéries nageurs peuvent être amorcées pour passer à se déplacer collectivement comme un essaim. En combinaison, ces protocoles représentent une approche systématique et puissante pour identifier les composants de la machinerie de motilité, et pour caractériser leur rôle dans différentes facettes de la natation et de l’essaimage. Ils peuvent être facilement adaptés pour étudier la motilité chez d’autres espèces bactériennes.

Introduction

Les bactéries emploient de nombreux appendices pour le mouvement et la dispersion dans leurs niches écologiques1. La motilité induite par flagelles est la plus rapide d’entre elles, favorisant la colonisation de lieux favorables en réponse aux signaux environnementaux, et contribuant de manière significative à la capacité pathogène de certaines espèces2,3. Les bactéries flagellées peuvent nager individuellement dans un liquide en vrac, ou essaimer en tant que collectif sur une surface semi-solide4. Les flagelles extracellulaires se fixent et sont entraînés par des moteurs rotatifs intégrés dans la membrane, qui exploitent la puissance des gradients d’ions pour générer un couple qui provoque une rotation1,2,4,5,6,7,8. Chez E. coli, dont les moteurs fonctionnent à un couple constantde 9, la sortie du moteur peut être classée en termes de vitesse de rotation et de commutation du rotor entre les directions dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW) et dans le sens des aiguilles d’une montre (CW). La rotation CCW favorise la formation d’un faisceau flagellaire cohérent qui propulse la cellule vers l’avant (run), tandis qu’un commutateur transitoire dans le sens de rotation (CW) provoque le démontage partiel ou complet du faisceau10,et la cellule réoriente sa direction de nage (chute). E. coli court généralement une seconde et chute pendant un dixième de seconde. La fréquence de commutation du rotor ou « biais de culbute » est contrôlée par le système de signalisation de la chimiotaxie, dans lequel les chimiorécepteurs transmembranaires détectent les signaux chimiques externes et les transmettent via phosphorelay au moteur flagellaire pour prolonger les courses en réponse aux attractifs, ou les supprimer en réponse à des produits chimiques toxiques11,12. La motilité de la natation est analysée dans une gélose molle à 0,3 %.

Pendant l’essaimage, les bactéries naviguent sur une surface semi-solide comme un collectif dense, où des paquets de bactéries coulent dans un mouvement tourbillonnant continu2,13,14,15. Les essaims d’E. coli présentent une physiologie chimiosensorieuse altérée (biais de chute plus faible), des vitesses plus élevées et une tolérance plus élevée aux antimicrobiens sur les cellules nageant dans un liquide en vrac16,17. Les nains varient dans leur déploiement d’une pléthore de stratégies qui facilitent le mouvement, y compris la production de surfactants, l’hyperflagellation et l’allongement cellulaire2. L’essaimage offre aux bactéries un avantage concurrentiel dans les milieux écologiques et cliniques18,19,20. Il existe deux catégories de bactéries essaimantes: les nains tempérés, qui ne peuvent essaimer que sur des milieux solidifiés avec une gélose à 0,5-0,8%, et les nains robustes, qui peuvent naviguer à travers des concentrations de gélose plus élevées21.

Il existe une variété de tests pour interroger la motilité de la natation et sa régulation. Lorsqu’elle est altérée par des mutations ou des conditions environnementales, la motilité elle-même offre une sélection forte pour identifier les mutations suppresseurs de gain de fonction. Ces suppresseurs peuvent être de véritables réducteurs de la mutation d’origine, ou des pseudo-réducteurs, où une deuxième mutation restaure la fonctionnalité. Ces mutants peuvent être identifiés par séquençage du génome entier (WGS). Une solution de rechange à la sélection impartiale des suppresseurs est une stratégie de mutagenèse ciblée biaisée (p. ex. mutagenèse par PCR). Ces méthodologies mettent souvent en lumière la fonction ou la régulation environnementale de l’appareil de motilité. Si l’objectif est d’étudier la fonction motrice, alors la restauration de la motilité de type sauvage telle que mesurée dans la gélose molle n’indique pas nécessairement la restauration de la puissance motrice de type sauvage. L’essai de cellule-attache, dans lequel les cellules sont attachées à une surface de verre par un flagelle simple et la rotation du corps cellulaire est par la suite surveillée, peut être l’essai initial de choix pour évaluer le comportement moteur. Bien que des méthodologies plus sophistiquées soient maintenant disponibles pour surveiller les propriétés du moteur, la configuration de caméras à grande vitesse requise et l’application de progiciels pour l’analyse de mouvement limitent leur utilisation généralisée22,23,24,25. L’essai d’attache cellulaire exige seulement que les flagelles soient ciselés, permettant la fixation des filaments courts à une lame de verre, suivie de l’enregistrement vidéo de la rotation du corps cellulaire. Bien que les vitesses motrices enregistrées soient faibles dans ce test en raison de la charge élevée que le corps cellulaire exerce sur le flagelle, ce test a néanmoins contribué à des informations précieuses sur les réponses chimiotactiques26,27,28,29,et reste un outil d’investigation valide comme discuté ci-dessous.

La motilité de l’essaimage pose un ensemble différent de défis aux chercheurs. La sélection des suppresseurs de gain de fonction ne fonctionne que chez les nains qui produisent des tensioactifs copieux et essaiment facilement13. Les non-producteurs de tensioactifs tels que E. coli sont méqueux en ce qui concerne le choix de la gélose, la composition des milieux et l’humidité de l’environnement2,13,14,21. Une fois les conditions d’essaimage établies, l’essai17 au passage de la frontière est une méthodologie utile pour interroger la capacité d’un essaim à naviguer dans des conditions nouvelles ou difficiles. Bien que les protocoles présentés ci-dessous se rapportent à E. coli,ils peuvent être facilement adaptés pour être épayus chez d’autres espèces.

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Protocole

1. Isolement des mutants suppresseurs dans des souches déficientes en motilité

REMARQUE: Utilisez cette méthode comme un large « fourre-tout » pour identifier la nature générale du défaut de motilité.

  1. Préparation de plaque de gélose molle
    REMARQUE: Soft-agar, également appelé motility- ou swim-agar, est une gélose à faible pourcentage (~ 0,2-0,35% p / v), longtemps utilisée pour analyser la chimiotaxie31,32.
    1. Ajouter 3 g de bacto-agar (0,3 % p/v) et 20 g de LB dans une fiole inférieure ronde de 2 L. Ajouter 1 L de ddH2O (eau doublement distillée) dans le ballon et mélanger uniformément la suspension à l’aide d’une tige d’agitation et d’une plaque d’agitation magnétique.
    2. Autoclave pendant 20 min à 121 °C.
    3. Laisser refroidir avec une agitation douce en utilisant la tige / plaque comme ci-dessus. Lorsque la température atteint environ 50 °C, verser 25 mL dans des boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm) et laisser la gélose fondue se mettre en place avec un couvercle en place pendant au moins 1 h, pour une utilisation dans les 16 h.
  2. Préparation de la culture, inoculation et isolement des mutants suppresseurs
    REMARQUE: E. coli inoculé au centre des milieux riches en nutriments solidifiés avec une gélose molle consomme des nutriments localement, créant un gradient de nutriments qu’ils suivent. Lorsqu’ils se déplacent vers l’extérieur, des « anneaux » définis apparaissent (figure 1A), qui sont liés à des chimioattractants spécifiques auxquels les bactéries répondent. Les défauts dans le système de chimiotaxie ou les composants structurels du moteur de flagelle peuvent compromettre la représentation dans cette analyse. Souvent, les mutants avec un avantage de motilité apparaissent pendant le criblage, et peuvent être vus émergeant d’un seul ou de plusieurs points le long de la périphérie de l’anneau, d’où ils « s’évasent »(Figure 1C). On remarquera que le bord extérieur du front de natation contraste facilement avec la gélose douce vierge non cloonisée.
    1. Cultiver pendant la nuit des cultures de la souche déficiente en motilité souhaitée dans 5 mL de bouillon Lennox (LB; 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl, Table des matériaux)à 30 °C avec une secousse horizontale (220 p.r.m.). Le lendemain, sous-culture (dilution 1:100) en LB frais, poussant dans les mêmes conditions jusqu’en phase exponentielle (DO600 de 0,6).
    2. Inoculer 6 μL de la culture au centre d’une plaque de gélose molle (1.1) à l’aide d’une pipette, en poussant la pointe stérile chargée dans la gélose pour expulser doucement le contenu. Transférer à 30 °C et incuber(figure 1B),jusqu’à ce que des « éruptions » de motilité soient évidentes, émanant du point d’inoculation ou de la périphérie des anneaux de motilité, généralement en 24-36 h(figure 1C).
      NOTA : Dans les essais de motilité, inoculer une souche de type sauvage à côté des isolats mutants à des fins de comparaison. Cette souche de type sauvage montrera les anneaux chimiotactiques concentriques caractéristiques (figure 1A) et remplira la plaque dans les 8-10 h.
    3. Utilisez une boucle métallique stérile pour soulever les cellules de la région de la « torche » et des stries pour purifier les colonies individuelles sur une plaque de gélose dure LB (LB préparée comme ci-dessus, solidifiée avec 15 g / L bacto-agar).
    4. Choisissez des colonies uniques dans la plaque de strie à l’aide d’une boucle de fil stérile et purifiez à nouveau en stries pour les colonies uniques afin d’assurer l’isolement d’un isolat de colonie « pur ».
  3. Confirmation et caractérisation des mutants suppresseurs
    1. Confirmer que les mutants suppresseurs isolés ont restauré la motilité. Préparer des plaques de gélose molle (1.1) et des cultures pour les souches d’intérêt (comme au point 1.2.1), y compris la souche de type sauvage et la souche de départ « déficiente en motilité » à des fins de comparaison.
    2. Inoculer les plaques (comme au point 1.2.2) et incuber à 30 °C pendant 8 à 10 h.
    3. Notez le diamètre de l’anneau le plus à l’extérieur (bord du cercle) et comparez-le pour établir lequel des isolats a substantiellement restauré la motilité.
      NOTA : Il est recommandé de photographier les plaques tout au long de l’expérience. Pour de meilleurs résultats, utilisez un dispositif « seau de lumière »30, où un appareil photo numérique est monté au-dessus d’une source de lumière pour un meilleur éclairage afin de mesurer le diamètre de la colonie de nage et de la distinguer de la gélose non colonisée.
    4. Le sujet a vérifié des isolats au WGS au besoin, tenant compte de la « couverture d’ordre » suffisante pour identifier positivement les mutations qui ont reconstitué la fonction de type sauvage.

2. Quantification du comportement moteur des flagelles via l’attache cellulaire

Remarque : utilisez cette méthode lorsque le comportement normal run-tumble (chimiotaxie) semble être compromis.

  1. Préparation de la culture et cisaillement des flagelles
    1. Préparer une culture en phase exponentielle de la souche d’intérêt comme décrit à l’étape 1.2.1.
    2. Granulé 10 mL de cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 3 min avant remise en suspension dans 10 mL de tampon de motilité stérilisé par filtre (MB; tampon phosphate de potassium 10 mM [0,0935 MK2HPO4 , 0,0065 MKH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl 10 mM, 75 mM KCl).
      REMARQUE: MB prend en charge la motilité, mais ne prend pas en charge la croissance bactérienne
    3. Répéter l’étape 2.1.2 deux autres fois avant de reprendre la pastille finale dans 1 mL de Mo.
    4. Transférer la suspension cellulaire dans une seringue de 1 mL et fixer une aiguille 23G à la fin. Assemblez une seringue ou un appareil à aiguille identique et fixez les deux ensemble au moyen de 6 pouces de tube en polyéthylène (diamètre intérieur de 0,58 mm) bien gainés sur chaque pointe d’aiguille.
    5. Cisaillez les flagelles (ils sont fragiles et se cassent facilement) en passant doucement la suspension cellulaire d’une seringue à l’autre 50x, avec 1 minute de pauses entre tous les 10 passages.
    6. Centrifuger les cellules cailleuses à 2 000 x g pendant 3 min et les ressusciter dans un volume final de 500 μL de Mo.
  2. Préparation des lames et attache des cellules
    1. Préparer une chambre de fixation cellulaire en empilant une lame de couverture de 18 mm x 18 mm sur une lame de microscope en verre de 3 pouces x 1 pouce x 1 mm, séparée par du ruban adhésif double face(figure S1).
    2. Rincer la chambre avec une solution de poly-lysine à 0,01% (p / v) en appliquant sur le dessus de la chambre. Inclinez le bord inférieur (la lame de couverture affleurant avec la lame du microscope) sur un essuie-glace de tâche (papier de soie) pour aider à dessiner la solution à travers la chambre(Figure S1). Incuber ensuite à température ambiante pendant 10 min.
    3. Laver la chambre trois fois avec 40 μL de Mo en utilisant comme décrit à l’étape 2.2.2
    4. Ajouter 40 μL de la suspension de cellules cailleuses (préparée ci-dessus) au sommet de la chambre et incuber à température ambiante pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle.
    5. Rincer délicatement la chambre avec 40 μL de Mo comme au 2.2.3 pour enlever les cellules non attachées.
  3. Enregistrement et quantification de la rotation cellulaire
    1. Transférer la lame du microscope chargée de cellules attachées à l’étape du microscope.
    2. À l’aide de la microscopie à contraste de phase et d’un objectif 100x, scannez la population à la recherche de cellules fixées en place et tournant sur un seul axe, c’est-à-dire des rotations lisses sur un point fixe plutôt que de se présenter à un angle dans lequel la cellule se déplace dans et hors de la mise au point(Vidéo 1).
    3. Utilisez un microscope commercial et une caméra associée. Ouvrez le logiciel associé, assurez-vous que les cellules d’intérêt sont au point et cliquez sur l’acquisition vidéo pour enregistrer la rotation des cellules pendant une minute (à 10 images par seconde ou plus).
    4. À partir de la lecture vidéo, quantifiez le nombre de rotations complètes par minute et le nombre de fois que la cellule change de direction (fréquence de commutation).
      REMARQUE: Les vitesses de rotation et la fréquence de commutation peuvent être trop rapides à évaluer à l’œil nu, il est donc recommandé d’utiliser un logiciel vidéo qui offre une lecture lente / fine, ou adopte un système logiciel automatisé pour quantifier les modèles de rotation33. Une alternative serait d’augmenter la viscosité du MB en utilisant de la méthylcellulose (ou un agent similaire) pour aider à ralentir et à résoudre la rotation de bactéries plus rapides ou à compenser lorsque des caméras à faible framerate sont utilisées.
    5. Répétez l’étape 2.3.2 avec des répétitions biologiques pour compiler une représentation de la population d’intérêt.

3. Préparation d’essaims dans un essai de passage de frontière

REMARQUE: Utilisez cette méthode pour évaluer l’impact d’une mutation ou d’une condition sur la motilité du groupe. L’essaim-agar fait référence à la gélose où le pourcentage est généralement plus élevé que celui de la gélose molle. Dans la gélose molle (0,3 %), les cellules nagent individuellement à l’intérieur de la gélose. Dans la gélose à essaim (0,5 % et plus), les cellules se déplacent en groupe à la surface. Alors que les plaques d’essaim doivent être utilisées comme détaillé ici, les plaques de nage ont une durée de conservation plus longue et peuvent être utilisées pendant plusieurs jours. Notre préférence personnelle est d’utiliser en 1-2 jours.

  1. Préparation de la gélose à essaim
    1. Ajouter 5 g de gélose Eiken (0,5 % p/v) et 20 g de LB dans une fiole inférieure ronde de 2 L. Ajouter 1 L de ddH2O dans le ballon et mélanger uniformément la suspension à l’aide d’une tige d’agitation et d’une plaque d’agitation magnétique.
    2. Autoclave pendant 20 min à 121 °C.
    3. Laisser refroidir avec une agitation douce pour éviter toute bulle d’air en utilisant la tige / plaque comme ci-dessus. À une concentration d’environ 50 °C, ajouter du glucose stérilisé par filtre pour une concentration finale de 0,5 %.
    4. Verser 25 mL dans des boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm) et laisser régler à température ambiante pendant au moins 14 h et pas plus de 20 h. Ne pas stocker pour une utilisation ultérieure.
  2. Inoculation et incubation de plaques d’essaim
    1. Inoculer 6 μL d’une culture moyenne exponentielle (préparée comme dans 1.2) en les repérant sur le dessus de la gélose.
    2. Laissez le couvercle éteint pendant 5-10 min et remplacez-le lorsque l’inoculum a séché dans la surface de la gélose.
    3. Incuber à 30 °C pendant 8 h. Évitez la tentation d’inspecter la progression de l’essaim en enlevant le couvercle, car cela contribuera au séchage de la gélose et altérera l’essaimage.
      REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier selon le phénotype de la souche. Certaines mutations isolées peuvent nuire à la capacité d’essaimage et nécessiteront un pourcentage réduit de gélose ou une période d’incubation plus prolongée.
  3. Préparation des plaques d’essai au passage des frontières
    REMARQUE : Ce test utilise une boîte de Petri modifiée, où une ligne de partage des eaux en plastique (bordure) crée deux chambres, plutôt qu’une(figure 2A). Chaque chambre peut être préparée indépendamment de l’autre, offrant des conditions différentes pour l’essaimage, avant de « connecter » les deux. Selon la conception expérimentale, la première chambre (désignée à gauche) peut être préparée avec de la gélose de nage (0,3 % p/v) ou de la gélose d’essaim (0,5 % p/v) d’où les bactéries peuvent migrer de l’autre côté de la frontière vers la chambre de droite contenant de la gélose d’essaim +/- tout supplément ou défi requis (p. ex. antibiotiques). La migration sur l’une ou l’autre gélose est généralement mesurée/comparée en enregistrant le plus grand diamètre de colonisation bactérienne (bord à bord) à partir du point d’inoculation d’origine.
    1. Préparer la gélose à la nage décrite à la section 1.1, au besoin.
    2. Préparer la gélose à essaim comme décrit à la section 3.1.
    3. Verser environ 30 mL de gélose à essaim (avec la supplémentation souhaitée si nécessaire) dans la chambre droite d’une boîte de Pétri à double compartiment (100 mm x 15 mm), au point où elle est au niveau du diviseur en plastique entre les chambres, mais ne débordant pas dans la gauche(Figure 2B).
    4. Une fois la gélose durcie, remplissez la chambre gauche avec environ 30 mL de gélose à la nage ou à l’essaim, encore une fois jusqu’au point de contact avec la ligne de partage des eaux en plastique(figure 2C). Avant qu’il ne se mette en place, utilisez une pointe de pipette stérile pour faire glisser doucement la gélose sur la bordure afin de relier les deux côtés avec un pont de gélose d’environ 1 mm de haut qui s’étend sur toute la longueur de la ligne de partage des eaux (Figure 2D).
    5. Laisser sécher la plaque à température ambiante (3.1).
      REMARQUE: Une autre méthode de création de pont consiste à laisser sécher la gélose de la chambre gauche, puis à pipetter lentement environ 100 μL de gélose d’essaim fondu le long du diviseur en plastique pour relier les deux chambres (3.4). Inoculer les plaques de la chambre gauche comme indiqué ci-dessus pour nager (1.2.2) ou essaimer (3.2) gélose, avant d’incuber à 30 °C pendant 12-16 h, ou jusqu’à ce que les essaims aient fait suffisamment de progrès sur la chambre droite pour permettre des comparaisons entre les souches d’intérêt.

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Résultats

L’isolement des pseudo-rétractants dans une souche d’E. coli dont la motilité est altérée par des niveaux élevés de la molécule de signalisation c-di-GMP, a été détaillé dans des travaux récents de notre laboratoire34. Cette souche (JP1442) a abrité deux mutations : ΔyhjH et ΔycgR. YhjH est la phosphodiestérase la plus active qui dégrade c-di-GMP chez E. coli. L’absence de YhjH conduit à des niveaux élevés de c-di-GMP et à l’inhibition de la motilité. YcgR est u...

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Discussion

L’isolement et la caractérisation des mutations suppresseurs ont contribué avec succès à identifier les composants clés du système de chimiotaxie35,36,37,ainsi que la machinerie motrice elle-même38,39,40. Lors de l’utilisation du protocole 1, il est important d’inclure plusieurs répétitions indépendantes pour assurer l’isolement d’un la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention GM118085 des National Institutes of Health et en partie par la Fondation Robert Welch (subvention F-1811 à R.M.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs
Bacto Agar déshydratéFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Sel disodique, dihydratéFisher Scientific02-002-786
Eiken agarEiken Chemical Co. JaponE-MJ00Essentiel pour l’essaimage de E. coli
Glucose D (+)Fisher Scientific
LB (Lennox) BouillonFisher ScientificBP1427-500
Solution de poly-L-lysine (0,1 %)Sigma-AldrichP8920
Chlorure de potassium (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials and Equipment
Logiciel d’imagerie de microscope CellSense (V. 1.6)OlympusOu logiciel équivalent pour microscope utilisé
Microscopie électronique Sciences Scotch 666 Ruban adhésif double faceFisher50-285-28
Lames de microscope givrées 3x1x1mmFisher12-550-343
Microscope Olympus BX53OlympusBX53N’importe quel microscope à phase verticale ou à phase inversée peut être utilisé
Boîtes de Pétri (100 mm de diamètre)Fisher ScientificFB0875712Pour les dosages en gélose molle
Nébuliseur en polyéthylène Tube capillaire (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)Perkin Elmer
Boîte de Pétri ronde à 2 compartimentsVWR89200-944Pour le franchissement des frontières
Aiguilles hypodermiques de sécurité (23G)Fisher Scientific14-826A
Seringue stérile - 1 mLFisher scientific14-955-450
Lingettes de travail/tissulettesFisher scientific06-666Ou lingettes tissulaires à usage unique équivalentes
VWR micro verre-couverture 18x18mmVWR48366205
XM10 appareil photoOlympusXM10Ou appareil photo microscope équivalent
4109550009908265

Références

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