Article de méthode

Approche génétique avancée des cellules vivantes pour identifier et isoler les mutants du développement dans chlamydia trachomatis

DOI :

10.3791/61365

⸱

10 juin 2020

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise des promoteurs-reporters fluorescents, la microscopie à cellules vivantes et l’extraction individuelle d’inclusion dans une approche génétique dirigée vers l’avant pour identifier et isoler les mutants développementaux de Chlamydia trachomatis.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’agent pathogène bactérien intracellulaire Chlamydia trachomatis subit un cycle de développement composé de deux formes morphologiquement discrètes de développement. Le corps élémentaire non réplictif (EB) initie l’infection de l’hôte. Une fois à l’intérieur, l’EB se différencie dans le corps réticulé (RB). Le RB subit ensuite plusieurs tours de réplication, avant de se différencier de la forme EB infectieuse. Ce cycle est essentiel pour la survie chlamydial car l’échec de passer d’un type de cellule à l’autre empêche l’invasion de l’hôte ou la réplication.

Les limitations des techniques génétiques dues à la nature intracellulaire obligatoire de la chlamydia ont entravé l’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de type cellulaire. Nous avons conçu un nouveau système plasmide double promoteur-reporter qui, en conjonction avec la microscopie à cellules vivantes, permet la visualisation du type de cellule commutation en temps réel. Pour identifier les gènes impliqués dans la régulation du développement de type cellulaire, le système promoteur-reporter de cellules vivantes a été mis à profit pour le développement d’une approche génétique avancée en combinant la mutagénèse chimique de la souche double reporter, l’imagerie et le suivi de la chlamydia avec la cinétique développementale altérée, suivie de l’isolement clonal des mutants. Ce flux de travail génétique avancé est un outil flexible qui peut être modifié pour l’interrogatoire dirigé dans un large éventail de voies génétiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis (Ctr) est un pathogène intracellulaire obligatoire qui progresse à travers un cycle de développement biphasique qui est essentiel pour sa survie et la prolifération1. Ce cycle se compose de deux formes développementales, le corps élémentaire (EB) et le corps réticulé (RB). L’EB est incompétent de réplication mais médiateur l’invasion de cellules par l’endocytose induite par effecteur2. Une fois dans l’hôte, l’EB mûrit à la RB réplicative. Le RB effectue plusieurs séries de réplication avant de convertir à l’EB afin d’initier des séries ultérieures d’infection.

La gamme limitée d’outils génétiques a limité la plupart de la recherche chlamydiale aux études biochimiques ou à l’utilisation de systèmes de substitution. En conséquence, l’élucidation de la régulation génique et le contrôle du cycle de développement a été difficile3,4. L’un des défis les plus importants dans le domaine chlamydial est le suivi temporel à haute résolution du cycle de développement chlamydial et l’identification des protéines impliquées dans sa régulation. L’expression génique pendant le cycle de développement chlamydial a traditionnellement été effectuée par des méthodes destructrices de « point d’extrémité » comprenant RNAseq, qPCR et microscopie à cellules fixes5,6. Bien que ces méthodes aient fourni des informations inestimables, les techniques employées sont laborieuses et ont une faible résolution temporelle5,6.

Au cours de la dernière décennie, la manipulation génétique de Ctr a progressé avec l’introduction de la transformation plasmide et des méthodes pour la mutagenèse7,8,9. Pour cette étude, un système à base de plasmide a été développé pour surveiller le développement chlamydial dans les inclusions individuelles en temps réel au cours d’une infection. Un transformateur chlamydial a été créé qui a exprimé à la fois un RB et EB cellule de type spécifique promoteur-reporter. Le journaliste spécifique rb a été construit en fusionnant le promoteur du gène RB euo début en amont de la protéine fluorescente Clover. EUO est un régulateur transcriptionnel qui réprime un sous-ensemble de gènes associés à l’EB10. Le promoteur de hctB, qui code une protéine histone-like impliqués dans la condensation nucléoïde EB, a été cloné directement en amont de mKate2 (RFP) pour créer le journaliste spécifique EB11. L’épine dorsale pour hctBprom-mKate2/euoprom-Clover était p2TK2SW27. Les promoteurs hctB et euo ont été amplifiés à partir de l’ADN génomique Ctr-L2. Chaque séquence de promoteur se composait d’environ 100 paires de base en amont du site de début de transcription prévu pour le gène chlamydial spécifié plus les 30 premiers nucléotides (10 acides aminés) de l’ORF respectif. Les variantes fluorescentes fp ont été obtenues commercialement comme blocs de gènes optimisés Ctr codon et clonés dans le cadre avec les 30 premiers nucléotides de chaque gène chlamydial et promoteur. Le terminateur incD a été cloné directement en aval de mKate2. Le deuxième promoteur-reporter a été inséré en aval du terminateur incD. Le gène de résistance à l’ampicilline (bla) dans p2TK2SW2 a été remplacé par le gène aadA (résistance à la spitinomycine) de pBam4. Cela a abouti à la construction finale p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figure 1A) qui a été transformé en Ctr-L27. Cette souche de journaliste RB/EB a permis l’observation du cycle de développement dans des inclusions individuelles utilisant la microscopie à cellules vivantes (figure 1B,C).

Utilisant notre construction promoteur-reporter en combinaison avec la mutagenèse chimique, un protocole a été conçu pour suivre et isoler les clones individuels qui ont montré des anomalies développementales des populations mutagéenisées de Ctr serovar L2. Ce protocole permet la surveillance directe des inclusions chlamydiales individuelles, le suivi des profils d’expression des gènes au fil du temps, l’identification des clones chlamydial qui expriment un modèle modifié d’expression des gènes développementaux, et l’isolement clonal de chlamydia des inclusions individuelles.

Bien que ce protocole ait été créé spécifiquement pour l’identification des gènes impliqués dans le développement chlamydial, il pourrait être facilement adapté pour interroger n’importe quel nombre de voies génétiques chlamydiales.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les scripts Python utilisés dans ce protocole sont disponibles sur Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Reporter Chlamydia

NOTE: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs ont été directement mutagenized à l’aide de méthanesulfonate éthylique (EMS) dans les médias axeniques CIP-1 que ce média soutient le métabolisme EB et le maintien de l’infectiosité EB12.

  1. Décongeler un stock de chlamydial sur la glace contenant ~3 x10 7 EB transformés avec le p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid et pellet à >14,000 x g pour 30 min à 4 °C.
    REMARQUE : Les organismes de chlamydia utilisés pour ces expériences étaient 30 % de densité de renografin purifiée et congelée à -80 °C dans le tampon 1x saccharose-phosphate-glutamate (SPG).
  2. Jetez le supernatant et resuspendez le granulé EB dans 100 μL de tampon CIP-1 avec sonication sur la glace à 10% de puissance pour 10 s. Divisez les 100 μL de suspension EB en deux aliquots de 50 μL pour les échantillons traités mutagenisés et simulés.
  3. Préparer 20 mg/mL de solution EMS-CIP-1 dans un tube de microcentrifuge séparé de 1,5 mL. Pour ce faire, ajouter 6,8 μL de SME dans un volume total de 375 μL.
  4. Ajouter 50 μL de la solution EMS-CIP-1 dans l’un des alquots chlamydial pour la mutagenèse et 50 μL de CIP-1 seulement à l’autre aiquot chlamydial pour la mutagenèse factice.
    REMARQUE : La concentration finale du SMU est de 10 mg/mL. Le titer chlamydial, la concentration de SME, et le temps d’exposition utilisé dans ce protocole mènent à environ une réduction d’environ 60-80% de la descendance infectieuse. Ce niveau de réduction correspond à ~5-20 lésions d’ADN par génome chlamydial8.
  5. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Les EB mutagènes seront utilisés directement pour infecter les monocouches de la section 2.
    ATTENTION : Le SME est un cancérogène connu. Tous les équipements et matériaux qui entrent en contact avec le SME doivent être trempés dans 1 M NaOH pendant 24 h avant l’élimination, les gants doivent être utilisés en tout temps pendant le protocole et le nettoyage des matériaux ems.

2. Imagerie de mutant Ctr

  1. Culture cellulaire d’hôte pour l’imagerie et l’isolement du Ctr mutagène
    1. Épépinez une plaque de fond en verre de 6 puits avec 6 x10 5 cellules Cos-7 (ATCC) par puits dans 2 mL de milieux complets (RPMI-1640 complétée par 10% de sérum bovin fœtal et 10 mg/mL de gentamicine). Utilisez cette plaque de fond en verre pour l’imagerie du Ctr mutagène.
    2. Épépinez une plaque de polystyrène de 24 puits avec 1 x 105 cellules Cos-7 (ATCC) par puits dans un support complet de 1 mL. Utilisez cette plaque de polystyrène pour la réinfection de chlamydia isolée d’intérêt.
    3. Incuber les deux plaques à 5% CO2, 37 °C pendant environ 18 h. Une fois que les cellules atteignent la confluence, remplacez les milieux par un milieu complet complété par 1 μg/mL de cycloheximide et concuber pendant la nuit.
  2. Infecter la culture cellulaire hôte avec ctr mutagenisé
    1. Infecter 5 puits de la plaque de fond de verre avec ~6 x 105 d’EB mutagènes dans 1,5 mL/puits de glace HBSS. Cela se traduira par le MOI de ~ 0,3 que ~ 70% taux de mortalité est prévu en raison de la mutagenèse.
    2. Infectez le puits restant avec ~2 x 105 faux EB mutagenisés dans 1,5 mL/puits de glace HBSS. Sans mutagenèse, attendez-vous à moins de mortalité, donc un tiers de l’inoculum est utilisé pour atteindre le MOI d’environ 0,3.
      REMARQUE : Le moi d’environ 0,3 garantit que les cellules hôtes sont infectées par un seul EB et permet une séparation suffisante entre les cellules infectées pour l’isolement clonal.
    3. Incuber la plaque pendant 15 min, à bascule, à 37 °C.
    4. Laver les cellules hôtes infectées avec du HBSS préguerre (37 °C) contenant 1 mg/mL d’héparine suivi immédiatement d’un rinçage HBSS. Répétez le lavage de l’héparine, en rinçant immédiatement 2x avec HBSS pour vous assurer que l’héparine est enlevée.
      REMARQUE : L’héparine inhibe et peut inverser les premières interactions électrostatiques entre la cellule hôte et les EB13. Les lavages d’héparine suppriment les EB qui n’ont pas encore entrer dans les cellules hôtes, synchronisant l’infection. Lors du lavage des cellules le faire doucement pour éviter de déloger les cellules de la surface des puits. Les solutions HBSS et heparine contiennent des SME résiduels et doivent être placées dans un bécher contenant 1 M NaOH pendant 24 h avant élimination.
    5. Remplacer le HBSS par un support d’imagerie de 4 mL/puits de préaugement (37 °C) (support complet, cycloheximide de 1 μg/mL, 20 mM HEPES et pas de phénol rouge).
    6. Remplissez les espaces interwells de H2O déonué préaguerré (37 °C) pour faciliter le contrôle de la température et réduire l’évaporation. Incuber la plaque à 37 °C incubateur avec 5% de CO2 pour 10 h.
  3. Mise en place et imagerie au microscope
    REMARQUE : L’imagerie fluorescente multiposition multiposition multicolore est utilisée pour recueillir des images en time-lapse afin d’identifier les mutants chlamydial qui diffèrent dans la dynamique d’expression des gènes du développement. Ce protocole utilise le logiciel open source μManager pour le contrôle automatisé du microscope14.
    1. Commencer la configuration du microscope 10 h post infection. Réglez l’incubateur de phase de microscope à 5% CO2, 37 °C. Placez la plaque de fond de verre de 6 puits infectée dans l’incubateur de scène et insérez le thermostor d’échantillon dans l’interwell H2O.
    2. Calibrer l’étape XY à l’aide du plugin High Content Screening(HCS). Cliquez sur Plugins | Outils d’acquisition | Générateur de site HCS dans le logiciel de contrôle du microscope μManager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. Sélectionnez le modèle de plaque de 6 puits et de générer une liste de position d’imagerie composée de 12 champs de vue (FOV) par puits dans le plugin HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Ouvrez la liste de position d’étape et concentrez-vous manuellement et définissez la position Z initiale pour chaque FOV à l’aide du plugin Stage Control (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Ajustez les coordonnées XY de tout FOV qui a des cellules manquantes ou ne contient pas de monocouche uniforme.
      REMARQUE : En raison du temps qu’il faut pour que chaque image soit capturée, un nombre maximal de 72 FOV peut être pris par intervalle de 30 minutes.
    4. Utilisez un objectif 20x pour l’imagerie. Ce grossissement permet d’imaginer ~8 inclusions par FOV tout en fournissant la résolution souhaitée.
    5. Enregistrez la liste des positions car cela sera utilisé pour localiser les inclusions d’intérêt après analyse de données (JoVE61365_screenfile7).
    6. Utilisez l’option Mise au point automatique dans le logiciel d’imagerie, pour définir le focus pour l’imagerie automatisée (JoVE61365_screenfile8).
    7. Utilisez les sélections et les valeurs suivantes pour produire les résultats de mise au point les plus cohérents à l’aide d’une mise au point automatique basée sur l’image dans μManager. Dans la fenêtre Propriétés de mise au point automatique, sélectionnez OughtaFocus dans le menu déroulant et utilisez les paramètres suivants. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusPropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtonFocus-Channel: DIC.
      REMARQUE : La réduction de la fenêtre d’imagerie autofocus en diminuant le facteur de culture permet une mise au point automatique plus cohérente. La sélection oui pour OughtaFocus-ShowImages permet à l’utilisateur d’afficher l’image de mise au point automatique.
    8. Capturez la cinétique du cycle de développement par imagerie pendant 24 h avec des intervalles de temps de 30 min (JoVE61365_screenfile9). L’imagerie entre 12 et 36 HPI garantit que la chlamydia termine le cycle de développement, mais ne lyse pas la cellule hôte.
    9. Image des monocouches cellulaires avec une exposition de 250 ms à 4% et 18% d’intensité dans les canaux GFP et DP, respectivement (JoVE61365_screenfile10). Détectez le signal Clover (GFP) par excitation à 470 nm avec un filtre d’émissions de bande de 514/30 nm. Détectez le signal mKate2 (DP) par excitation à 595 nm et avec un filtre d’émissions de bande de 641/75 nm.
      REMARQUE : Il est essentiel de minimiser l’intensité de l’excitation pour réduire au minimum le photobleaching fluorophore et la phototoxicité à la chlamydia. L’intensité minimale d’excitation pour générer une image résolue avec une exposition de 200 à 300 ms devrait être déterminée empiriquement dans les études pilotes.
    10. Capturez plusieurs tranches de Z avec une plage de mise au point qui se termine de chaque côté de la tranche de mise au point. Dans cette expérience, au grossissement 20x, cela a été réalisé avec 4 tranches à 10 μm étapes (JoVE61365_screenfile11).
    11. Sélectionnez Relative Z pour l’imagerie de plusieurs tranches dans la fenêtre d’acquisition. L’option Z relative utilise l’emplacement du plan Z enregistré dans la liste de position d’imagerie comme point de départ pour l’intervalle de temps suivant. Entrez les valeurs z-offset appropriées pour les canaux d’imagerie par fluorescence (JoVE61365_screenfile12).
      REMARQUE : Le système de mise au point basé sur l’image est imparfait et, sur une période d’imagerie de 24 h, cela conduit à la dérive de mise au point. Il a été constaté qu’en capturant 3-4 Z plans focal pour chaque point de temps une image au point a été maintenue. Z-offset est nécessaire pour corriger les différences dans les plans focals entre les canaux d’image fluorescent et le canal DIC. La détermination empirique de ce Z-offset sera nécessaire.
    12. Enregistrez des images en sélectionnant le répertoire racine et en nommant l’expérience. Utilisez l’option de fichier de pile d’images μManager pour enregistrer des images en tant que fichiers de pile tiff (JoVE61365_screenfile13).
    13. Enregistrez les détails expérimentaux dans la zone Commentaires acquisitions dans la fenêtre Acquisition Multi-D (JoVE61365_screenfile13). C’est-à-dire, Puits A1 : Contrôle non traité. Bien A2-3 et B1-3: EMS Mutants. Imagerie: 12-36HPI. Démarrez l’acquisition d’image à 12 HPI.
      REMARQUE : Si vous utilisez μManager, laissez le programme, la configuration expérimentale et le matériel de microscope en cours d’exécution une fois l’expérience terminée. Les sites d’imagerie seront réexaminés pour l’isolement de l’inclusion une fois l’analyse de la population mutagenisée terminée.

3. Identifier et isoler la chlamydia mutagène avec des phénotypes développementaux altérés

  1. Création d’une pile d’images mise au point
    1. Extraire l’image la plus ciblée des piles Z à l’aide des données d’image enregistrées qui contiennent 4 tranches Z par point de temps. Utilisez l’option de mesure de la kurtose (Analyse | Mesurez) dans ImageJ/FIJI pour identifier automatiquement la tranche Z la plus ciblée (score de kurtose le plus élevé) et créer une nouvelle pile d’images avec seulement ces images au point. Un script Python est inclus comme fichier supplémentaire (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) pour automatiser ce processus.
  2. Quantifier l’expression de la fluorescence dans les inclusions individuelles
    REMARQUE : Pour quantifier la cinétique d’expression des deux reporters, utilisez l’application d’analyse d’images open source ImageJ/FIJI et le plugin Trackmate15. Trackmate identifie les « taches » (correspondant aux inclusions dans ce cas) et les suit à travers une pile d’images en time-lapse enregistrant l’emplacement X,Y et l’intensité du signal pour chaque inclusion au fil du temps (JoVE61365_screenfile14). Ces informations sont enregistrées sous forme de fichier CSV et seront importées dans un bloc-notes Python personnalisé pour analyse.
    1. Ouvrez la pile d’images réduite Z en ligne de mire dans ImageJ/FIJI à l’aide de Bio-formats Importateur en cliquant sur Plugins | Bio-Formats | Bio-formats Importateur. Sélectionnez Hyperstack et Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
    2. Soustrayez l’arrière-plan de l’image en cliquant sur Processus | Soustraire l’arrière-plan à l’aide d’un rayon de boule roulant de 50,0 pixels et améliorer le contraste de l’image à 0,3 % pour les pixels saturés (Processus | Améliorer le contraste). Multiplier les valeurs d’image par 10.0 (Processus | Mathématiques | Multiplier) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. Dans Trackmate (Plugins | Suivi | Trackmate), sélectionnez un diamètre blob estimé à 48 pixels (déterminé empiriquement en fonction de la taille de l’inclusion à la fin de l’imagerie). Produire des pistes d’inclusion non fragmentées en sélectionnant une distance maximale de liaison et une distance maximale de 8,0 pixels et un écart de cadre maximum de 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
      REMARQUE : Pour améliorer la capacité de Trackmate à identifier et à suivre les inclusions sur l’ensemble du cycle, un canal d’image distinct est créé en ajoutant les canaux de bal euoet hctBà l’aide de la fonction mathématique de l’image dans ImageJ/FIJI. Ce canal est ensuite utilisé par Trackmate pour identifier et suivre les inclusions au fil du temps. Les valeurs fluorescentes des chaînes de bal euoprom et hctBsont ensuite enregistrées dans les canaux 2 et 3.
    4. Enregistrer les pistes qui répondent à une durée minimale continue: Durée de la piste: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analyser les pistes et enregistrer les spots dans les statistiques de suivi comme un fichier CSV (JoVE61365_screenfile27).
      REMARQUE : Ce processus a été automatisé à l’aide d’un script Python personnalisé fourni dans les données supplémentaires (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
  3. Identifier les pistes d’inclusion avec des profils de développement modifiés
    REMARQUE : Pour identifier les inclusions contenant Chlamydia avec des profils de développement modifiés, chaque piste d’inclusion a été visualisée à l’aide d’un bloc-notes Python. Ces visualisations permettent d’identifier les inclusions avec des profils d’expression génétique cinétique qui différaient de la population traitée par simulation. Le bloc-notes Python utilisé pour identifier les inclusions ayant une programmation de développement modifiée est fourni dans les données supplémentaires (EMS_Screen-Markdown).
    1. Importez les données de suivi d’inclusion des Spots dans les statistiques de suivi des fichiers CSV dans le cadre de données Pandas à l’aide de la cellule Import dans le bloc-notes Python EMS_Screen-Markdown.
    2. La ligne de base corrige chaque piste en soustrayant la valeur minimale de chaque piste du reste des valeurs de piste à l’aide des cellules Deline Subtrayez. Enregistrez les valeurs résultantes en tant que fichier de cornichons à l’aide de la cellule Enregistrer comme pickle. Cela permettra d’enregistrer en permanence les valeurs de canal après la soustraction de base pour une récupération ultérieure.
      REMARQUE : La soustraction de base définit l’intensité fluorescente de départ de chaque inclusion à zéro.
    3. Éliminer les traces des inclusions près des bords du FOV à l’aide de la cellule Bordures de filtre car leurs profils fluorescents peuvent ne pas être entièrement capturés; ces traces peuvent produire de faux profils positifs de développement.
    4. Calibrer les valeurs du cadre(totalFrames) des tranches d’image aux valeurs de temps(startTime, intervalle)avec la cellule d’étalonnage time-lapse à l’aide de l’heure de début expérimentale et de l’intervalle de temps d’imagerie. Exclure les lectures d’inclusion partielle en filtrant les traces qui ne s’étendent pas sur les 20 dernières heures de l’expérience (16-36 HPI) à l’aide de la cellule Filtre durée de la piste.
    5. Séparez les pistes dans des images de données individuelles par condition expérimentale avec la cellule Assign Treatment. Filtre pour les inclusions qui présentent une croissance suffisante à l’aide de la cellule Filtre pour la croissance. Dans la cellule Filtre pour la croissance, définissez empiriquement le seuil d’intensité de fluorescence pour le canal de bal euoen modifiant les valeurs dans les deux dernières lignes de code. Cela filtrera la chlamydia qui n’a pas grandi.
      REMARQUE : Soyez prudent lors de la définition des filtres de seuil, si le filtre est trop faible, les parcelles de dispersion qui en résultent seront bruyantes, mais si le filtrage est défini, des mutants trop importants peuvent être éliminés.
    6. Calculer le pourcentage de mortalité causé par le SMU en divisant le nombre de pistes mutagenisées/bien par le nombre de pistes/puits traités par simulation. Multipliez le nombre de pistes traitées par simulation par le facteur de dilution initial de 3 pour calculer le nombre de pistes traitées par simulation/puits. Utilisez les cellules Count Inclusion Tracks and Calcule Percent Mortality pour effectuer cette tâche.
    7. Calculez le temps à l’expression demi-maximale pour les journalistes précoces et tardifs pour chaque piste à l’aide de la cellule Calculer. Ces valeurs seront utilisées pour comparer les populations mutagéenisées et simulées afin d’identifier les mutants développementaux.
    8. Dans la cellule Half-Max Plot utiliser le paquet de traçage bokeh pour visualiser le temps à l’expression demi-max de chaque promoteur, graphique du temps de bal euoà l’expression demi-maximale contre celle du bal hctB. Identifiez les inclusions de la population mutante qui tombent en dehors du nuage de dispersion traité par simulation à l’aide de l’explorateur d’id de piste interactif bokeh. Prenez note des coordonnées FOV et XY des inclusions d’intérêt (figure 2).
      REMARQUE : Choisissez les inclusions de candidats qui tombent visuellement en dehors du nuage de contrôle comme vérification et évaluation statistique de chaque clone seront effectuées ultérieurement.
    9. Dans la cellule de l’intrigue animée visualiser les changements dans la cinétique expression promoteur dynamiquement à travers le temps en graphisant les intensités d’expression de bal euocontre le bal hctBà l’aide de l’outil de traçage Plotly16. La fonction de diffusion de Plotly est utilisée pour animer l’expression du gène au fil du temps (Vidéo 1).
    10. Visualisez un instantané à partir du graphique animé par Plotly dans la cellule Inclusion Locator, traçant l’expression debal euo et hctBà un moment précis (c.-à-d. 28 HPI) à l’aide du package bokeh (Figure 3). Identifier les inclusions de la population mutante décrites à l’étape 3.3.8.
      REMARQUE : Cette analyse doit être effectuée rapidement (<4 h) car les inclusions sont encore en expansion et commenceront à lyser les cellules hôtes ~48 h après l’infection.
  4. Isoler les mutants du développement des inclusions d’intérêt
    REMARQUE : Pour isoler la chlamydia des inclusions qui étaient déterminées à afficher la régulation modifiée de gène un micromanipulateur avec des aiguilles capillaires a été employé. Les coordonnées Well ID, FOV et X,Y des inclusions d’intérêt ont été déterminées à l’aide de la visualisation des données à la section 3.3.
    1. Préparer les aiguilles capillaires en tenant le centre du tube capillaire dans une flamme et en tirant les deux extrémités du tube capillaire jusqu’à ce qu’il se soit séparé. Créez une ouverture dans l’aiguille capillaire tirée en cassant la pointe tirée sur une lame de microscope. Pour casser l’aiguille, placez la pointe fermée sur la partie givrée de la lame du microscope à un angle et appliquez une pression.
      REMARQUE : Les spécifications des tubes capillaires étaient de 1,0 mm O.D., 0,5 mm D.I.
    2. Vérifiez que l’ouverture de l’aiguille est approximativement la taille d’une inclusion sous un microscope, objectif 20x.
    3. Prepull ~25-30 aiguilles capillaires pour l’isolement des inclusions des candidats (une aiguille par inclusion).
    4. Remplissez le microinjecteur d’huile minérale en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit présente.
    5. Attachez une aiguille capillaire en verre au microinjecteur et expulsez l’huile jusqu’à la pointe de l’aiguille, en expulsant les bulles d’air. Placez l’aiguille capillaire dans un support complet et dessinez le support à mi-chemin. Le remplissage de l’aiguille capillaire avec du milieu empêche la contamination par l’huile dans le puits.
    6. À l’aide de la liste de positions enregistrées dans μManager à partir de l’étape 2.3.5, migrez vers le puits et FOV d’une inclusion d’intérêt identifiée dans le bloc-notes de visualisation Python.
    7. Utilisez le joystick du micromanipulateur pour localiser l’aiguille capillaire aux coordonnées XY de l’inclusion d’intérêt.
    8. Utilisez le canal d’excitation de 595 nm pour visualiser les EB en vue de l’extraction et le canal de lumière blanche phase/DIC pour la visualisation de l’aiguille. Manœuvrez l’aiguille capillaire jusqu’à l’inclusion, rompez l’inclusion, puis dessinez les EB dans l’aiguille capillaire à l’aide du microinjecteur.
    9. Expulsez les EB de l’aiguille capillaire en un seul puits de la plaque de polystyrène préparée 24 puits préparée à l’étape 2.1.2. Retirer l’aiguille capillaire et remplacer par une aiguille capillaire fraîche pour l’extraction de l’inclusion suivante. Répétez la section 3.4 pour toutes les inclusions des candidats.
      REMARQUE : Pour l’expansion et pour assurer un tritre suffisamment élevé pour la ré-imagerie, incuber les isolats mutants dans un incubateur de 5 % de CO2, 37 °C jusqu’à ce que la majorité des cellules hôtes soient infectées (~1 semaine). Les puits doivent être surveillés de près, car différents isolats peuvent présenter des taux de croissance différents.
  5. Isolats mutants de récolte
    1. Sur la glace, perturbez la monocouche infectée en grattant avec une pointe de micropipette de 1 mL. Transférez les milieux, les débris cellulaires et libérez la chlamydia dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L.
    2. Pellet Chlamydia par centrifugation pendant 30 min à 4 °C, >14 000 x g. Retirer le surnatant et resuspend le granulé dans 75 μL de glace 1x SPG. Aliquot en trois tubes microcentrifuge à vis de 1,5 m L. Conserver à -80 °C.

4. Vérification des phénotypes d’isolat mutant

  1. Culture cellulaire d’hôte pour l’imagerie des isolats mutagenisés
    1. Épépinez une plaque de fond en verre de 96 puits avec 1,6 x 104 cellules Cos-7 (ATCC) par puits dans 100 μL de support complet. Incuber à 5% CO2, 37 °C. Les cellules devraient atteindre la confluence en environ 24 h. Après que les cellules sont confluentes, remplacer le milieu par un milieu complet complété par 1 μg/mL cycloheximide, incuber pendant la nuit.
  2. Infecter les cellules avec des isolats candidats pour la vérification phénotypique
    1. Décongeler les clones mutants et le type sauvage Chlamydia sur la glace.
    2. Dans la plaque de puits préparée 96, effectuez une dilution en série double des isolats mutants, à l’aide d’une colonne par isolat (11 colonnes). Commencez par une dilution initiale de 1:20 dans 100 μl HBSS.
      REMARQUE : La dilution en série de la chlamydia est effectuée pour s’assurer que les échantillons mutants sont photographiés à un MOI < 1.
    3. Infecter la colonne restante (12e) avec le type sauvage Chlamydia à MOI ~0,5.
      REMARQUE : La chlamydia de type sauvage est utilisée comme contrôle pour la comparaison avec les isolats mutagenisés.
    4. Incuber pendant 15 min à bascule à 37 °C.
    5. Laver les cellules hôtes infectées avec du HBSS préguerre (37 °C) avec 1 mg/mL d’héparine et de HBSS comme indiqué à la section 2.2.
    6. Remplacer par 200 μL par puits de support d’imagerie préguerre (37 °C).
    7. Remplissez les espaces interwells deh2O déonué (37 °C) déionisé.
    8. Incuber à 5% CO2, 37 °C pour 10 h.
  3. Configuration du microscope
    REMARQUE : Reportez-vous à la section 2.3 pour la configuration du microscope, cette section ne contiendra que les modifications d’installation requises.
    1. Sélectionnez le modèle de plaque de puits 96 dans le plugin HCS.
    2. Déterminer empiriquement les puits correspondant à un MOI < 1 pour chaque isolat mutant. L’expression de trèfle sous le contrôle du promoteur euo est observable à ~10 HPI rend possible la visualisation précoce des inclusions (Figure 1B).
    3. Sélectionnez trois puits par isolat mutant qui correspondent à un MOI < 1 et de générer une liste de position d’imagerie composée de deux FOV par puits.
      REMARQUE : Seulement 72 images peuvent être prises par intervalle de temps en raison de contraintes matérielles, ce qui équivaut à trois dilutions (puits) par souche à l’aide de deux sites d’imagerie par puits si 12 échantillons sont photographiés.
    4. Enregistrez le cycle de développement de chaque isolat mutant pendant 36 h à intervalles de temps de 30 min à partir de 12 HPI.
    5. Enregistrez les détails expérimentaux dans la zone Commentaires d’acquisitions. c.-à-d. Eh bien ABC1 : contrôle de type sauvage. Eh bien ABC2: Mutant souche 1, ABC3: Mutant souche 2, etc ... Imagerie: 12-48 HPI.
    6. Démarrez l’acquisition d’image à 12 HPI.

5. Analyse des données pour la vérification des isolats

  1. Créer des piles d’images sur le point et quantifier l’expression de fluorescence dans les inclusions individuelles
    1. Générer des traces d’intensité fluorescente pour chaque inclusion, comme indiqué à la section 3.1 - 3.2.
  2. Vérifier les isolats mutagenisés Ctr
    REMARQUE : Pour vérifier les profils de développement modifiés des isolats mutants, leurs profils d’expression sont comparés au profil d’expression wildtype à l’aide du bloc-notes Python. Le bloc-notes Python utilisé pour la vérification des clones mutants avec une programmation de développement modifiée est fourni dans les données supplémentaires (clone_check-Markdown).
    1. Importer et filtrer les données de suivi d’inclusion dans le bloc-notes Python clone_check-Markdown, comme le fait la section 3.3.
    2. Calculez l’écart moyen et standard (MST) à partir des traces de chaque population de contrôle d’isolat et de type sauvage à l’aide de la cellule Calculer la moyenne et les MST.
    3. Avec la trace de cellule Graph Iso vs WT, l’erreur moyenne et standard de la moyenne (SEM) de chaque clone mutant contre le contrôle du type sauvage pour déterminer si la cinétique de l’expression mutante est divergente de l’échantillon de type sauvage (Figure 4).
    4. Déterminer si la population mutante isolée est clonale en traçant les traces mutantes et en les comparant à des traces d’inclusion de type sauvage à l’aide d’une parcelle de dispersion telle qu’elle est effectuée à la section 3.3 (étapes 3.3.7-3.3.10) (Figure 2, Figure 3). Si l’isolat est une population mixte, la parcelle montrera une population superposée avec du type sauvage et une deuxième population distincte en dehors du nuage de dispersion de type sauvage. Si la population semble mixte, le mutant peut être ré-isolé en utilisant la procédure originale décrite à la section 3.4.
      REMARQUE : Pour déterminer si le profil de développement d’un isolat est statistiquement différent du type sauvage, les courbes de chaque isole doivent être comparées au type sauvage à l’aide d’ANOVA.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mutagènesis direct d’EMS de notre souche chlamydia de promoteur-reporter a eu comme conséquence une réduction d’infection d'~75% dans À l’aide du protocole d’imagerie à cellules vivantes décrit, ~600 inclusions ont été image et suivies sur une période de 24 h. La cinétique d’expression fluorescente des deux reporters dans chaque inclusion a été visualisée à l’aide de scripts de bloc-notes Python personnalisés. Deux approches de visualisation ont été mises en œuvre pour identifier la chlamydia mutagenisée cand...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dissection des mécanismes qui contrôlent le cycle de développement chlamydial a été entravée par les limites des outils génétiques actuellement disponibles. Utilisant notre promoteur-reporter Chlamydia en conjonction avec la microscopie automatisée à cellules vivantes, un système a été construit qui permet la surveillance du développement de type cellulaire dans les inclusions individuelles sur une période de 24 h. Ce système, combiné à la mutanéèse chimique et à l’isolement de l’inclusion directe, a établi u...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Anders Omsland de l’Université d’État de Washington d’avoir fourni les médias axeniques CIP-1. Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01AI130072, R21AI135691 et R21AI113617. Un soutien supplémentaire a été fourni par des fonds de démarrage de l’Université de l’Idaho et du Center for Modeling Complex Interactions par le biais de leur subvention P20GM104420 des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de polystyrène à 24 puitsCorning3524Croissance de la culture cellulaire pour la réinfection des isolats Plaques à
fond en verre à 6 puitsCellvisP06-1.5H-NCroissance de la culture cellulaire pour l’imagerie
Plaques à fond en verre à 96 puitsNunc165305Croissance de la culture cellulaire pour l’imagerie
Unité de CO2 à ligne audacieuseOKO LabsUNITÉ de CO2 BLIncubateur de scène Contrôle du CO2
Bold line T UnitOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUSContrôle de la température de l’incubateur de scène
Tubes capillaires en verre borosilicatéSutter InstrumentB1005010Tubes capillaires
Filtre passe-bande BrightLine (514/30nm)SemrockFF01-514/30-25Cube filtrant fluoescent
Filtre passe-bande BrightLine (641/75nm)SemrockFF02-641/ 75-25Cube filtrant fluoescent
CellTram VarioEppendorf5196000030Microinjecteur
Chlamydia trachmatis sérovar L2ATCCVR-577Chlamydia trachomatis
CIP-1 médiainterne NAAxenic. IPB complété par 1 % de FBS, 25 &mu ; Acides aminés M, 0,5
mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT et 50 &mu ; M GTP, UTP et
CTP. (Omsland, A. 2012) fabriqué en interne.
Cellules Cos-7 (ATCC)ATCCCRL-1651Cellule rénale de singe vert africain (cellules hôtes)
CycloheximideMP Biomedicals194527Inhibiteur de croissance de la cellule hôte
Ethyl methanesulfonate, 99 %Acros OrganicsAC205260100Mutagen
Fetal PlexGemini Bio-Products100-602Supplément pour milieu de croissance de base
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/FijiNALogiciel d’analyse d’images Open sourse. https://imagej.net/Fiji
Incubateur CO2 Galaxy 170 SEppendorfCO1700100XGblocks d’incubation de culture cellulaire
(variantes FP fluorescentes : Clover et mKate2)Integrated DNA TechnologiesNAgblock ORFs de variantes FP optimisées pour Ctr pour clonage en p2TK2SW2
Gentamycine 10mg/mlGibco15710-064Antibiotique pour milieu de croissance
HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)Corning21-020-CMRinçage des cellules hôtes
Héparine sodiqueAmersham Life Science16920inhibe et inverse les interactions électrostatiques précoces entre la cellule hôte et les EB
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01Tampon de pH pour milieu
de croissance InjectManEppendorf5179 000.018Micromanipulateur
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NAVisualisation des traces d’inclusion. https://jupyter.org/
Lambda 10-3Sutter InstrumentLB10-3Contrôleur de roue à filtres
Oko Touch OKOLabsOkoTouch Interface pour contrôler la ligne Bold T et l’unité CO2
Étage XY précédentPriorH107Platine de microscope XY motorisée
Centrifugeuse PrismRLabnetC2500-RMicrocentrifugeuse à température contrôlée
Four d’hybridation ProblotLabnetH1200AIncubateur à bascule pour infection à Chlamydia
Proscan IIPriorH30V4Contrôleur de platine de microscope XYZ
Purificateur Classe 2 Armoire de biosécuritéLabconco362804Travaux de culture cellulaire
RPMI-1640 (sans rouge de phénol)Gibco11835-030Milieu de croissance de base pour l’imagerie
RPMI-1640 (rouge de phénol)GE Life SciencesSH30027.01Média de croissance de
baseLED d’excitation LED (470nm,595nm)ScopeLEDF140Lumière d’excitation
Sonic Dismembrator Modèle 500Fisher Scientific15-338-550Sonicateur, remise en suspension de pastille de chlamydia
Étape incubateurOKO LabsH301-K-FRAMEChambre d’incubation à plaque de puits de grappe
tampon saccharose-phosphate-glutamate 1X (SPG)Tampon de stockage dechlamydia NA interne. (10 mM de phosphate de sodium [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM de saccharose, 0,50 mM d’acide L-glutamique ; pH 7,4)
Fioles T-75Thermo Scientific156499Croissance de la culture cellulaire
Microscope inversé TE 300 MicroscopeNikon16724
Microscope THOR LEDThor LabsLEDD1BLumière blanche
TrypsineCorning25-052-CIDéloge les cellules hôtes du ballon pour les ensemencer dans des plaques
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3Caméra d’imagerie
et micro ; Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNALogiciel de contrôle automatisé de microscope à source ouverte

Références

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