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Article de méthode

Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

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DOI :

10.3791/61373

⸱

26 juin 2020

 ,  ,  , 
1Molecular and Medical Virology, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Décrit ici est une méthode efficace sur la façon de produire des stocks de trier virale élevé du virus de l’hépatite E (HEV) pour infecter efficacement les cellules hépatomes. Avec la méthode présentée, les particules virales non enveloppées et les particules virales enveloppées peuvent être récoltées et utilisées pour inoculer diverses lignées cellulaires.

Résumé

Le virus de l’hépatite E est la principale cause de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique avec une prévalence croissante dans le monde entier. Le virus de l’ARN à brin unique est principalement transmis par transfusion sanguine, des conditions sanitaires inadéquates et des produits alimentaires contaminés. À ce jour, la ribavirine (RBV) est le traitement de choix pour de nombreux patients. Néanmoins, un traitement spécifique de VHEM reste à identifier. Jusqu’à présent, les connaissances sur le cycle de vie et la pathogénie du VH ont été sérieusement entravées en raison de l’absence d’un système efficace de culture cellulaire HEV. Un système de culture cellulaire robuste est essentiel pour l’étude du cycle de vie viral qui comprend également la pathogénie virale. Avec la méthode décrite ici, on peut produire des titres viraux allant jusqu’à 3 x 106 unité de formation de mise au point /mL (FFU/mL) de HEV non enveloppé et jusqu’à 5 x 104 FFU/mL de HEV enveloppé. En utilisant ces particules, il est possible d’infecter une variété de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et humaines, ainsi que les lignées cellulaires animales. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole extrêmement efficace.

Introduction

L’hépatite E est une maladie assez sous-estimée avec une prévalence croissante dans le monde entier. Environ 20 millions d’infections entraînent plus de 70 000 décès par an1. L’agent sous-jacent, le virus de l’hépatite E (HEV), a été réaffecté récemment et est maintenant classé dans la famille hepeviridae, y compris les genres Orthohepevirus et Piscihepevirus. HEV de diverses origines sont classés dans l’espèce Orthohèpevirus A-D y compris les isolats de l’homme, porc, lapins, rats, oiseaux et autres mammifères2. À l’heure actuelle, huit génotypes différents (GT) du virus de l’ARN à brin unique orienté vers un positif ont été identifiés2. Bien qu’ils diffèrent dans leur identité de séquence, les voies de transmission et la répartition géographique, leur structure génomique est fortement conservée. Plus spécifique, le génome hev de 7,2 kbp est divisé en 3 cadres de lecture ouverts majeurs (ORF1-3). Alors que ORF1 code toutes les enzymes nécessaires à une réplication réussie dans la cellule hôte, ORF2 code la protéine capside, et la protéine ORF3 fonctionne comme un canal d’ion fonctionnel requis pour l’assemblage et la libération des particules infectieuses3. Une fois libéré dans le lumen basal ou apical, le VHEM existe chez les deux espèces, quasi-enveloppées et non enveloppées/nues selon que le virus provient du sang ou des excréments, respectivement4,5.

Alors que gt1 et GT2 se trouvent principalement dans les pays en développement uniquement infecter les humains6 par la voie fécale-orale, GT3, GT4 et GT7 se produisent principalement dans les pays développés1,7 avec une variété d’espèces servant de réservoirs, par exemple, porcs8, rat9, poulet10,11, cerf12, mangouste13, chauve-souris14, lapin15,16, sanglier17 et beaucoup plus7,18,19, fournissant des preuves de zoonose7,20,21,22. En plus des conditions sanitaires inadéquates23 et des produits alimentaires contaminés12,24,25,26, la transmission par transfusion sanguine et transplantations d’organes est également possible27,28. Le VHEV est une cause fréquente de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique29, en particulier chez les patients atteints d’une maladie hépatique préexistante, d’immunocompromis (génotype 3, 4 et 7) et de femmes enceintes (génotype 1). A noter, il ya aussi des manifestations extrahépatiques telles que la maladie hématopoïétique30,31,32, troubles neurologiques33 et les lésions rénales34.

À ce jour, la ribavirine (RBV) médicament hors étiquette est le traitement de choix pour de nombreux patients infectés35,36. Cependant, des cas d’échec de traitement et de mauvais résultats cliniques à long terme ont été rapportés. L’échec de traitement a été lié à la mutagénèse virale et à l’hétérogénéité virale accrue dans les patients chroniquement infectés37,38,39. Au contraire, une étude multicentrique rétrospective européenne récente n’a pas été en mesure de corréler les mutations de la polymérase à l’échec du traitement rbv40. Dans les observations cliniques et les expériences in vitro, l’interféron41,42,43, sofosbuvir44,45, sels de zinc46 et silvestrol47,48 ont également montré des effets antiviraux. Néanmoins, un traitement spécifique de VH reste à trouver, entravé par le manque de connaissances au sujet du cycle de vie de HEV et de sa pathogénie. Par conséquent, un système robuste de culture cellulaire pour les études virologiques et le développement de nouveaux médicaments antiviraux est nécessaire de toute urgence49.

Malheureusement, comme d’autres virus de l’hépatite, le VHE est difficile à propager dans les lignées cellulaires conventionnelles et progresse généralement très lentement, ce qui entraîne de faibles charges virales. Néanmoins, certains groupes ont été en mesure d’augmenter les charges virales par la génération de sous-clones ligne cellulaire50 ou l’ajustement des suppléments de médias51. Récemment, la génération de clones d’ADNC52 et l’adaptation des isolats du patient primaire en passant53,54 encore amélioré propagation HEV dans la culture cellulaire55. Dans ce protocole, nous avons utilisé le génome d’une souche Kernow-C1 adaptée à la culture cellulaire (appelée p6_WT)54 et d’une souche mutante abritant une mutation améliorant la réplication (appelée p6_G1634R)37. Kernow-C1 est la souche la plus fréquemment utilisée dans la culture cellulaire HEV et est capable de produire des charges virales élevées. En évaluant les numéros de copie virale de l’ARN, la réplication du VH peut être surveillée in vitro. Néanmoins, ces techniques ne permettent pas d’évaluer le nombre de particules infectieuses produites. Par conséquent, nous avons établi une coloration d’immunofluorescence pour déterminer les unités de formation de mise au point (FFU/mL).

La méthode56 décrite ici peut être utilisée pour produire des particules virales infectieuses pleine longueur qui sont capables d’infecter une variété de types de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et les lignées cellulaires des mammifères. Il s’agit d’une condition préalable fondamentale pour déchiffrer les aspects importants de l’infection et du tropisme de HEV. Il n’y a pas besoin d’inoculation avec des isolats de patient habituellement limités. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole comparablement efficace. En outre, ce système peut être utilisé pour la génétique inverse permettant l’étude de l’altération du génome in vivo identifié et leur impact sur la réplication et la condition physique du VH. Cette technique surmonte de nombreuses limitations et peut suivre la voie pour le développement de médicaments, les études de mutagenesis et l’évaluation des interactions virus-hôte tels que la restriction ou les facteurs d’entrée.

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Protocole

REMARQUE : Toutes les expériences sont effectuées sous condition BSL-2. Tous les matériaux qui entrent en contact avec l’ARN du virus de l’hépatite E ou le virus infectieux doivent être rincés correctement avec 4% Kohrsolin FF à partir d’un conteneur de déchets à l’intérieur du capot avant l’élimination.

1. Préparation plasmide

  1. Inoculer un milieu de 200 mL LB contenant une ampicilline de 100 μg/mL avec une apéricile Escherichia coli JM109 transformée intégrant un codage plasmide pour la séquence HEV gt3 Kernow-C1p6 pleine longueur (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 ou pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incuber pendant 16 h à 37 °C sous agitation permanente (170 tr/min).
    REMARQUE : L’isolement plasmide a été effectué à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide (voir tableau des matériaux).
  2. Suivant le protocole de fabrication, tournez 200 mL de culture de nuit à 6.000 x g et 4 °C pendant 10 min et jetez le supernatant. Le granulé bactérien peut être congelé et stocké à -20 °C.
    1. Resuspendez la pastille bactérienne dans 4 mL de tampon de resuspension en faisant des pipes de haut en bas avec une pipette sérologique de 10 mL et un homme de pipette. En outre, vortex rigoureusement.
    2. Ajouter 4 mL de tampon de lyssis préguerre (30-40 °C). Inverser doucement pendant plusieurs fois et incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
    3. Ajouter 4,8 mL de tampon de neutralisation, inverser doucement et s’assurer que le lysate est neutralisé quantitativement (voir la description du fabricant). Puis centrifugeuse à 11 000 x g et 4 °C pendant 20 min.
    4. Placez un morceau de 2 cm x 2 cm de mull à l’intérieur d’une pointe non filtrée de 1 mL, chargez le supernatant, lysé et neutralisé dans une pipette sérologique de 10 mL, ajoutez 1 pointe mL avec mull à la pointe de la pipette sérologique et filtrez le supernatant dans un nouveau tube de 50 mL.
      REMARQUE : Le supernatant peut être conservé à 4 °C jusqu’à 30 min si nécessaire.
    5. En plusieurs étapes, appliquer 750 μL du supernatant filtré sur un total de 4 colonnes de filtre (fournies dans le kit) et la centrifugeuse à 11 000 x g pour 30 s. Jetez le flux et répétez cette séquence jusqu’à ce que tout supernatant soit appliqué sur les colonnes du filtre.
    6. Laver chaque colonne de filtre deux fois avec 500 μL de tampon de lavage préa réchauffement (50 °C) AW à 11 000 x g pendant 30 s et jeter le flux à travers par la suite.
    7. Laver chaque colonne de filtre avec 600 μL de tampon de lavage A4 en centrifuge à 11 000 x g pendant 30 s. Jetez les colonnes de filtre et dassévez-les par centrifugation à 11 000 x g pendant 2 min.
    8. Elute l’ADN plasmide de chaque colonne de filtre en transférant 60 μL de tampon d’élution sur le centre des colonnes de filtre. Incuber pendant 1 min à RT et centrifugeuse à 11 000 x g pendant 1 min.
    9. Combiner les éluates et mesurer la concentration de l’ADN plasmide extrait à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. Lainéralisation et purification de l’ADN

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Figure 1 : Configuration expérimentale schématique pour la linéarisation plasmide et la purification de l’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE : La linéarisation augmente le rendement de l’ARN pendant la transcription in vitro (étape 3)

  1. Pour linéariser l’ADN plasmide (Figure 1) mélanger 10 μg de l’ADN modèle (extrait à l’étape 1), 10 μL de la mémoire tampon, 2 μL de MluI et ajuster à un volume de 100 μL avec H2O.
    1. Incuber pendant 1 h à 37 °C et confirmer la linéarisation du plasmide par l’électrophorèse du gel agarose (p. ex., chargez l’ADN plasmide non digéré et digéré [1 μL d’ADN chacun] sur un gel agarose de 1 % et une électrophorèse de course à 120 V courant constant).
  2. Conformément au protocole des fabricants pour l’extraction de l’ADN (voir tableau des matériaux, figure 1),mélanger 500 μL de tampon de liaison, fourni dans le kit, avec 100 μL d’ADN linéarisé. Appliquer l’échantillon sur une colonne de filtre et la centrifugeuse à 17 800 x g pendant 30 s. Jetez le flux et placez les colonnes de filtre dans le même tube.
    1. Laver la colonne de filtre en ajoutant 650 μL de tampon de lavage et de centrifugation à 17 800 x g pendant 30 s. Jetez le flux et placez la colonne de filtre dans le même tube. Pour enlever la tampon résiduelle de lavage, la centrifugeuse sèche à 17 800 x g pour 60 s et placer chaque colonne de filtre dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 m L par la suite.
    2. Elute ADN en transférant 60 μL de H2O préguerre (pcr grade, 70 °C) au centre du filtre. Incuber pendant 1 min à 70 °C et centrifugeuse à 18 000 x g pendant 1 min. Mesurer la concentration de l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Conserver l’ADN à -20 °C jusqu’à la transcription in vitro.

3. Transcription in vitro du génotype HEV de pleine longueur 3 p6 ADN et purification de l’ARN

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Figure 2 : Configuration expérimentale schématique pour la transcription in vitro et la purification de l’ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE : La transcription in vitro est nécessaire pour produire l’ARN génomique viral à partir de l’ADN plasmide.

  1. Pour le mélange de transcription in vitro 20 μL de tampon de transcription 5x T7, 10 mM TTT, 100 U d’inhibiteur de la ribonucléase, 25 mM ATP, CTP et UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg de modèle d’ADN linéaire et 80 U de T7 ARN polymerase. Remplissez jusqu’à 100 μL de nucléase sans H2O, mélangez bien et incuber pendant 2 h à 37 °C.
    REMARQUE : Le stockage à court terme à -20 °C est possible après l’étape 3.1 à 3.1.2.
    1. Ajouter 2 μL de polymérase d’ARN T7, bien mélanger et incuber pendant encore 2 h à 37 °C.
    2. Pour digérer le modèle d’ADN initial, ajouter 7,5 μL de DNase (sans RNase, 1 U/μL), bien mélanger et incuber à 30 min à 37 °C.
      REMARQUE : Nettoyez toutes les surfaces et les pipettes avec le décontaminant de surface pour RNase lorsque vous travaillez avec l’ARN pour éviter la dégradation. En outre, assurez-vous que tous les tubes de réaction sont sans RNase et stériles. Utilisez uniquement des pointes avec des filtres et diluer uniquement avec de l’eau stérile et sans RNase.
  2. Conformément au protocole de fabrication pour l’extraction de l’ARN (voir tableau des matériaux, figure 2),préparer un prémélange de tampon de lysis et 100 % d’éthanol en mélangeant 330 μL de tampon de lyssis et 330 μL d’éthanol à 100 % pour chaque réaction de transcription in vitro. Ajouter 660 μL de prémélange tampon-éthanol de Lysis à 110 μL d’ARN et de vortex. Chargez l’échantillon sur une colonne de filtre et une centrifugeuse à 8000 x g pendant 30 s. Jetez le flux et placez la colonne de filtre dans le même tube.
    1. Ajouter 600 μL de tampon de lavage et de centrifugeuse à 8000 x g pendant 30 s. Jetez la colonne de filtre dans le même tube. Ajouter 350 μL de tampon de lavage et de centrifugeuse à 8000 x g pendant 2 min pour enlever le tampon de lavage résiduel. Placez chaque colonne de filtre dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 m L. Ouvrez le couvercle de la colonne de filtre et laissez la colonne sécher pendant 3 min.
    2. Elute ARN en plaçant 50 μL de RNase libre H2O au centre de la colonne de filtre. Incuber pendant 1 min à RT et centrifugeuse ultérieurement à 8 000 x g pendant 1 min. Vérifiez l’intégrité de l’ARN en chargeant 1 μL d’ARN sur un gel agarose et mesurez la concentration d’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Conserver l’ARN à -80 °C jusqu’à l’électroporation et le dégel exclusif de l’ARN sur la glace pour éviter la dégradation.

4. Préparation des cellules HepG2 pour la production de HEV dérivé de la culture cellulaire (HEVcc)

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Figure 3 : Configuration expérimentale schématique pour la préparation des cellules HepG2 pour la production de HEV dérivé de la culture cellulaire (HEVcc). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE : Pour éviter la contamination, la préparation des cellules, l’électroporation, l’infection, la récolte et la fixation cellulaire ont été effectuées dans des conditions stériles dans une installation de biosécurité de niveau 2. Les étapes d’incubation à 37 °C qui impliquent des cellules ont été réalisées dans un incubateur de CO2 de 5 %.

  1. Pour préparer les cellules HepG2 pour la production de HEVcc (Figure 3), les cellules de graines dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) complet de Dulbecco (voir tableau 1) sur un mélange de collagène de 15 cm (voir tableau 1, mélange d’acide acétique de filtre stérile PBS à travers un maillage de 0,2 μm avant d’ajouter du collagène). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.
    REMARQUE : Chaque plat de 15 cm contenant 90 % de cellules confluentes produira suffisamment de cellules pour jusqu’à 4 électroporations.
  2. Retirez doucement le milieu de la plaque et lavez les cellules une fois avec 10 mL de 1x PBS. Trypsiniser les cellules en ajoutant 3 mL de 0,05% trypsine-EDTA sur les cellules et incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées. Resuspender les cellules dans 10 ml de DMEM complètent le milieu et transfèrent la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL. Déterminer le nombre total de cellules.
  3. Puisque chaque électroporation nécessite 5 x 106 cellules, transférer le volume approprié dans un nouveau tube de 50 ml et remplir jusqu’à au moins 35 ml avec 1x PBS. Cellules de centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et jeter soigneusement le supernatant sans déranger le granulé cellulaire.
  4. Laver les cellules une fois de plus avec 35 mL de 1x PBS à 200 x g pendant 5 min. Placer les cellules sur la glace et ne pas enlever 1x PBS encore, pour garder les cellules en suspension.

5. Électroporation des cellules hepG2

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Figure 4 : Configuration expérimentale schématique pour l’électroporation des cellules HepG2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour l’électroporation des cellules HepG2 (Figure 4) préparer 400 μL de Cytomix complet par électroporation en complétant 384 μL de Cytomix (voir tableau 1) avec 2 mM ATP et 5 mM Glutathion. Préparer frais juste avant l’utilisation et placer directement sur la glace.
    REMARQUE : Une exécution correcte mais rapide des étapes suivantes est cruciale. Par conséquent, assurez-vous que tout est bien préparé.
  2. Retirez soigneusement 1x PBS sans perturber la pastille cellulaire de l’étape 4.4. Resuspend 5 x 106 cellules dans 400 μL de Cytomix complète et ajouter 5 μg d’ARN à partir de l’étape 3.2.2. Transférer la solution dans une cuvette de 4 mm et pulser une fois avec 975 μF, 270 V pour 20 ms avec un système d’électroporation.
    1. Après l’électroporation transférer les cellules le plus rapidement possible avec une pipette Pasteur dans 11 mL DMEM complet par électroporation.
      REMARQUE : Pour s’assurer que l’ARN est transfecté avec succès dans les cellules HepG2, un contrôle de transfection (TC) sera effectué. Les taux de transfection prévus varient entre 40 et 60 % des cellules orf2-positives.
  3. Transférer 10 mL de cellules électroporées dans un plat de culture de 10 cm recouvert de collagène. Ajouter 1,3 x 105 cellules électroprorées (300 μL) dans un puits d’une plaque de 24 microtitre recouverte de collagène portant un glissement de couverture (plus tard utilisé comme contrôle de transfection). Distribuer les cellules uniformément et incuber à 37 °C.
    1. Après 24 h, changer le milieu du plat de 10 cm et remplacer par 10 mL frais DMEM complet. Ne modifiez pas le support du contrôle de transfection. Incuber encore 6 jours à 37 °C.
  4. Arrêter le contrôle de transfection dans la plaque de 24 puits 5-7 d après l’électroporation selon la densité cellulaire en continuant avec le protocole de coloration d’immunofluorescence (étape 8). L’efficacité de la transfection est calculée en comptant le nombre de cellules positives ORF2 normalisées au nombre total de cellules.

6. Récolte de HEVcc intracellulaire et extracellulaire

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Figure 5 : Configuration expérimentale schématique pour la récolte intra- et extracellulaire HEVcc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour récolter le HEVcc extracellulaire(figure 5),filtrer le supernatant, obtenu à partir du plat de 10 cm après 6 jours (étape 5.3.1), à travers un maillage de 0,45 μm pour enlever les débris cellulaires. Stocker le HEVcc extracellulaire récolté à 4 °C pour l’infection le même jour, sinon conserver à -80 °C.
  2. Pour récolter le HEVcc intracellulaire(figure 5),laver les cellules avec 1x PBS et trypsiniser en ajoutant 1,5 mL de 0,05% trypsin-EDTA. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées. Ajouter 10 ml de DMEM complet, plaque de chasse d’eau pour détacher les cellules et transférer la suspension des cellules dans un tube de 50 mL. Laver les cellules deux fois avec PBS. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    1. Jetez le supernatant et resuspendez le granulé cellulaire dans 1,6 mL de DMEM complet par électroporation. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de réaction de 2 mL.
      REMARQUE : N’utilisez pas de volumes plus importants car cela diminuerait considérablement les charges virales.
    2. Congeler (dans l’azote liquide) et décongeler les cellules. Répétez cette séquence 3 fois.
      REMARQUE : Ne pas mettre en commun plus d’une électroporation (1,6 mL) pour les 3 cycles de gel et de dégel, car l’efficacité de la lyse serait altérée. Ne pas vortexer la suspension cellulaire entre les cycles. Assurez-vous de décongeler la suspension cellulaire lentement (p. ex., température ambiante ou sur la glace) afin de maximiser les charges virales.
    3. Centrifugeuse à grande vitesse les cellules lysées pendant 10 min à 10.000 x g pour séparer les débris cellulaires. Transférer le supernatant dans un nouveau tube. Prenez le supernatant pour l’infection, sinon rangez-le à -80 °C.
    4. En option, concentrer le HEVcc extra-et intracellulaire à l’aide d’un concentrateur pour augmenter les charges virales (selon le protocole du fabricant).

7. Infection des cellules hepg2/c3A avec heVcc intra- et extracellulaire

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Figure 6 : Configuration expérimentale schématique pour l’infection des cellules hepG2/C3A avec HEVcc intra- et extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE : L’infection des cellules hepg2/c3A doit s’assurer que des particules infectieuses ont été produites. En outre, la titration de l’HEVcc intracellulaire et extracellulaire récolté est utilisée pour calculer les titres de virus dans FFU/mL. Ce sera plus tard appelé contrôle des infections (IC).

  1. Pour préparer les cellules HepG2/C3A pour l’infection à HEVcc (Figure 6), préguerre minimal de milieux essentiels (MEM) complet (voir tableau 1) à 37 °C.
    1. Graine 2 x 104 cellules/puits en 100 μL sur la plaque de microtiter enduite de collagène 96 puits un jour avant l’étape 6. Assurez-vous de remplir les puits les plus externes de 1x PBS pour éviter l’évaporation du milieu à l’intérieur des 60 puits internes. Incuber à 37 °C pendant 24 h.
    2. Infecter avec l’HÉVcc extracellulaire en ajoutant 50 μL du supernatant (de l’étape 6.1) aux cellules HepG2/C3A ensemencées la veille. Bien mélanger en faisant monter et descendre et diluer six fois 1:3 en transférant 50 μL dans le puits suivant. Effectuez des doublons de dilution en série pour les répliques techniques.
    3. Infecter avec l’HÉVcc intracellulaire en ajoutant 25 supernatants μL (de l’étape 6.2.3) aux cellules HepG2/C3A ensemencées la veille. Bien mélanger en faisant des pipes de haut en bas et diluer six fois 1:5 en transférant 25 μL dans le puits suivant. Effectuez la dilution en série des doublons pour la réplication technique.
    4. Après 7 d à 37 °C arrêter l’infection en continuant avec le protocole de coloration d’immunofluorescence (étape 8).

8. Coloration d’immunofluorescence du contrôle de la transfection et de l’infection

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Figure 7 : Configuration expérimentale schématique pour la coloration de l’immunofluorescence de la transfection et du contrôle des infections. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour la coloration de l’immunofluorescence (figure 7),laver 3x avec 1x PBS et fixer les cellules en distribuant 350 μL (contrôle de transfection [TC]) ou 50 μL (contrôle de l’infection [IC]) de 4% solution de fixation par puits. Incuber pendant 15 min à RT et laver soigneusement deux fois avec 1x PBS par la suite.
    NOTE: Le protocole peut être mis en pause ici pour le contrôle de transfection jusqu’à ce que l’infection des cellules HepG2/C3A est arrêté ainsi. Conserver bien la plaque à 4 °C. Sceller également avec le parafilm pour éviter l’évaporation.
  2. Permeabiliser les cellules en ajoutant 350 μL (TC) ou 50 μL (IC) de 0,2% Triton X-100 (en 1× PBS) pendant 5 min à RT. Ensuite, lavez soigneusement deux fois avec 1x PBS et bloquez avec 350 μL (TC) ou 50 μL (IC) de 5% de sérum de cheval (en 1x PBS) pendant 1 h à RT sous agitation constante sur un shaker orbital (30 tr/min).
    REMARQUE : Préparez un petit plat en plastique (30 mm) en plaçant un tissu humide à l’intérieur et une couche de film de paraffine sur le dessus, créant ainsi une chambre humide. Ensuite, transférer le bordereau de couverture TC face vers le haut sur le film de paraffine. Les étapes suivantes pour le TC seront exécutées dans la chambre humide.
  3. Ajouter 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) d’anticorps primaires anti-ORF2 8282 (sérum hyperimmune de lapin spécifique au HEV, 1:5,000 dans 5% sérum de cheval) par puits et incuber toute la nuit à 4 °C sous agitation constante sur un shaker orbital (30 tr/min).
    1. Laver soigneusement deux fois avec 1x PBS et ajouter 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) d’anticorps secondaires anti-lapin 488 (1:1 000 dans 5 % sérum de cheval). Incuber pendant 1 h sous agitation constante sur un shaker orbital (30 tr/min) dans l’obscurité. Encore une fois, laver soigneusement deux fois avec 1x PBS
  4. Ajouter 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) de DAPI (1:10 000 en H2O) et incuber pendant 1 min. Laver soigneusement deux fois avec H2O. Sortez le couvercle glisser de la chambre humide, monter le couvercle glisser avec 6 μL du réactif de montage à l’envers sur une glissière de couverture (seulement pour TC) et laisser le réactif de montage sécher pendant 16 h à RT dans l’obscurité. Conserver IC dans l’eau jusqu’à l’imagerie et sceller la plaque avec du film de paraffine pour éviter le séchage dû à l’évaporation.
  5. Prenez des images pour confirmer la transfection et l’infection réussies.
    REMARQUE : Des résultats comparables ont été obtenus à l’aide de l’anticorps anti-ORF2 1E6 disponible dans le commerce57 (1:200 dans le sérum de cheval à 5 %) et d’un anticorps secondaire anti-souris (1:1 000 dans 5 % sérum de cheval)

9. Détermination de la FFU

REMARQUE : Un FFU est défini comme une ou plusieurs cellules ORF2-positives séparées d’une autre FFU par au moins trois cellules négatives.

  1. Pour les HEVcc extracellulaires, commencez à compter tous les foyers ORF2 positifs des deux puits dans les deux dilutions les plus basses. Au total, quatre puits devraient être comptés. Les unités de formation de mise au point (FFU) par millilitre peuvent être calculées avec l’équation suivante :

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    REMARQUE : Les titres attendus varient entre10 2 et 5 x10 4 FFU/mL.
  2. Pour les HEVcc intracellulaires, commencez à compter tous les foyers ORF2 positifs dans les puits où entre 50 et 100 foyers sont observés. En outre, compter les deux puits dans la dilution supérieure suivante. Au total, quatre puits devraient être comptés. Les unités de formation de mise au point (FFU) par millilitre peuvent être calculées avec l’équation suivante :

    figure-protocol-9
    REMARQUE : Les titres attendus varient entre10 5 et 3 x 106 FFU/mL. Les facteurs 20x et 40x sont utilisés pour extrapoler le nombre de FFU par 50 μL et 25 μL à 1 mL et peuvent être adaptés en conséquence.

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Résultats

Dans ce protocole, nous décrivons la production de HEVcc infectieux à haute teneur en titer. La première étape consiste à isoler l’ADN plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 et pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figure 8a), qui est ensuite linéaire par digestion de restriction et purifié pour la transcription in vitro (Figure 1). Une linéarisation réussie peut être vérifiée en comparant l’ADN plasmide non digéré à l’ADN plas...

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Discussion

En commençant par la préparation du plasmide, les rendements de l’ADN devraient dépasser 150 ng/μL pour être en mesure d’effectuer une linéarisation multiple à partir du même stock de plasmide, ce qui minimise le risque de mutagenèse induite par les bactéries des séquences génomiques cruciales. En outre, il est important de vérifier la digestion de restriction pour la linéarisation complète du plasmide par électrophorèse de gel (figure 8b). Un manque d’ADN plasmide linéarisé induirait l’ampl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Suzanne Emerson pour le virus de l’hépatite E p6 clone. Rainer Ulrich, Institut Friedrich Loeffler, Allemagne, a fourni un sérum hyperimmune de lapin spécifique à HEV. En outre, nous remercions tous les membres du Département de Virologie Moléculaire et Médicale de l’Université de la Ruhr Bochum pour leur soutien et leur discussion. Les chiffres 1 à 7 ont été générés avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 et micro ; m meshSarstedt83.1826Récolte extracellulaire Virus
4 % HistofixCarlRothP087.4Immunofluorescence
Acide acétiqueCarlRoth6755.1Solution de travail de collagène
Amicon Ultra-15Merck MilliporeUFC910024Récolte du virus
AmpicillineSigma-AldrichA1593Sélection de bactéries
ATPRoche11140965001in vitro transcription et électroporation
BioRenderBioRenderFigure Generation
CaCl2Roth5239.2Cytomix
Collagen R solution 0,4 % stérileServa47256.01Solution de travail de collagène
CTPRocheTranscription 11140922001in vitro
CuvetteBiorad165-2088Électroporation
DAPIInvitrogenD21490Immunofluorescence
DMEMgibco41965-039Culture cellulaire
DNAsePromegaM6101in vitro transcription
DTTPromegainclus dans la transcription P2077in vitro
EGTARoth3054.3Cytomix
Escherichia coli JM109PromegaL2005Transformation
Sérum fœtalbovin gibco10270106Culture cellulaire
FluoromountSouthernBiotech0100-01Immunofluorescence
GenePulser Xcell Système d’électroporationBioRad1652660Électroporation
Gentamycinegibco15710049Culture cellulaire
GTPRoche11140957001in vitro Transcription
H2OBraun184238001Immunofluorescence
HepesInvitrogen15630-03Cytomix
Sérumde cheval gibco16050122Immunofluorescence
K2HPO4RothP749.1Cytomix
KCLRoth6781.3Cytomix
KH2PO4Roth3904.2Cytomix
L-Glutamingibco25030081Culture cellulaire
L-Glutathion réduitSigma-AldrichG4251-5GCytomix
MEMgibco31095-029Culture cellulaire
MEM NEAA (100× ;)gibco11140-035Culture cellulaire
MgCl2Roth2189.2Cytomix
Spectrophotomètre UV-Vis microvolume NanoDrop OneThermo FisherConcentration d’ADN/ARN
MluIenzyme NEBR0198LLinéarisation
TamponNEB inclusdans R0198LLinéarisation
Kit plasmide NucleoSpinMacherey & Nagel740588.250Préparation plasmidique
NucleoSpin ARN Kit de nettoyageMacherey & Nagel740948.250Purification de l’ARN
PBSgibco70011051Culture cellulaire
Pencher/StrepThermo Fisher15140122Culture cellulaire
Plasmide codant pour le génome complet du VHE (p6_G1634R)Todt et.alProduction de virus
Plasmide codant pour le génome complet du VHE (p6_WT)Shukla et al.N° d’adhésion GenBank JQ679013Production du virus
Anticorps primaire 1E6LS-BioC67675Immunofluorescence
Anticorps primaire 8282Rainer Ulrich, Institut Friedrich Loeffler, Allemagne
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Extraction d’ADN
Ribo m7G Cap AnalogPromegaP1711in vitro transcription
RNase awayCarlRothA998.3Purification de l’ARN
RNasin (inhibiteur de la RNase)PromegaN2515in vitro
Anticorps secondaire âne anti-souris 488Thermo FisherA-21202Immunofluorescence
Anticorps secondaire chèvre anti-lapin 488Thermo FisherA-11008Immunofluorescence
Sodium Pyruvatgibco11360070Culture cellulaire
T7 ARN polymérasePromegaP2077in vitro Tampon
transcriptionPromegainclus dans P2077in vitro transcription
Triton X-100CarlRoth3051.3Immunofluorescence
Trypsine-EDTA (0,5 %)gibco15400054Culture cellulaire
IgG ultra-faiblegibco1921005PJCulture cellulaire
UTPRoche11140949001in vitro
de transcription

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