Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

2.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/61400

⸱

14 juillet 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Dans cet article

Avis d’erratum

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Résumé

Le protocole décrit ici met en évidence les principales étapes de la différenciation des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, de la préparation de Neisseria meningitidis pour l’infection et de la collecte d’échantillons pour d’autres analyses moléculaires.

Résumé

La méningite à méningocoques est une infection potentiellement mortelle qui survient lorsque Neisseria meningitidis (méningocoque, Nm) peut accéder au système nerveux central (SNC) en pénétrant dans des cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées. Comme le Nm est un agent pathogène spécifique à l’homme, l’absence de systèmes modèles in vivo robustes rend difficile l’étude des interactions hôte-pathogène entre le Nm et les BEC et établit la nécessité d’un modèle humain qui imite les BEC natifs. Les BEC possèdent des propriétés de barrière plus serrées que les cellules endothéliales périphériques caractérisées par des jonctions serrées complexes et une résistance électrique trans-endothéliale (TEER) élevée. Cependant, de nombreux modèles in vitro , tels que les BEC primaires et les BEC immortalisés, n’ont pas ou perdent rapidement leurs propriétés de barrière après avoir été retirés du microenvironnement neuronal natif. Les progrès récents dans les technologies des cellules souches humaines ont permis de mettre au point des méthodes permettant de dériver des cellules endothéliales semblables à celles du cerveau à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) qui permettent de mieux faire une phénocopie des BEC par rapport à d’autres modèles humains in vitro . L’utilisation de BEC dérivés d’iPSC (iPSC-BEC) pour modéliser l’interaction Nm-BEC présente l’avantage d’utiliser des cellules humaines qui possèdent des propriétés de barrière BEC et peut être utilisée pour examiner la destruction de la barrière, l’activation immunitaire innée et l’interaction bactérienne. Nous montrons ici comment dériver des iPSC-BEC à partir d’iPSCs en plus de la préparation bactérienne, de l’infection et de la collecte d’échantillons pour analyse.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière méningée-sang-LCR (mBCSFB) sont des barrières cellulaires extrêmement serrées qui séparent la circulation du système nerveux central (SNC) et sont principalement composées de cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées1,2. Ensemble, les BEC maintiennent une bonne homéostasie cérébrale en régulant les nutriments et les déchets à l’intérieur et à l’extérieur du cerveau, tout en excluant de nombreuses toxines, médicaments et agents pathogènes 1,2. La méningite bactérienne survient lorsque les bactéries transmissibles par le sang sont capables d’interagir avec la barrière formée par les BEC et de la pénétrer, ce qui provoque une inflammation. Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une bactérie à Gram négatif qui colonise le nasopharaynx de 10 à 40 % des individus en bonne santé, mais qui, dans certains cas, peut provoquer une maladie systémique grave3. Chez les personnes atteintes, le Nm peut accéder à la circulation sanguine où il peut provoquer un purpura fulminans ainsi que pénétrer dans les BEC en accédant au SNC causant la méningite3. Le Nm est l’une des principales causes de méningite bactérienne dans le monde et, malgré les efforts de vaccination, reste l’une des principales causes de méningite4. Les interventions médicales modernes, telles que les traitements antibiotiques, ont permis de survivre à ces maladies, mais les personnes atteintes de méningite se retrouvent souvent avec des dommages neurologiques permanents 5,6.

Des études antérieures ont identifié des facteurs bactériens et la signalisation de l’hôte qui contribuent aux interactions Nm-BEC 7,8,9,10,11. Les adhésines et les invasines identifiées telles que la protéine d’opacité Opc et les pili de type IV, ainsi que des récepteurs tels que CD147, ont été menées sur divers modèles BEC in vitro, mais ces modèles manquent de nombreuses propriétés BHEdéfinissant 7,9,11,12. La compréhension complète des interactions Nm-BEC reste difficile à atteindre, en partie à cause de l’incapacité d’utiliser des modèles in vivo, d’une protection vaccinale incomplète et du manque de modèles BEC humains robustes in vitro.

La modélisation des hBEC in vitro a été difficile en raison des propriétés uniques des BEC. Par rapport aux cellules endothéliales périphériques, les BEC présentent un certain nombre de phénotypes qui améliorent leurs propriétés de barrière, telles qu’une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER) due à des jonctions serrées complexes12. Une fois retirés du microenvironnement cérébral, les BEC perdent rapidement leurs propriétés barrières, ce qui limite l’utilité des modèles primaires ou in vitro immortalisés qui ne forment qu’une barrière faible12,13. La combinaison de la spécificité humaine des infections à Nm, de l’absence de modèles in vivo robustes et des défis liés à la modélisation des BEC humains in vitro crée un besoin de meilleurs modèles pour comprendre l’interaction complexe hôte-pathogène entre Nm et les BEC. Récemment, à l’aide de technologies modèles de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), des cellules de type BEC ont été dérivées de cellules iPS qui imitent mieux les BEC in vivo12,13,14,15. Les iPSC-BEC sont d’origine humaine, facilement évolutives et possèdent les phénotypes BEC attendus par rapport à leurs homologues primaires ou immortalisés12,13,14,15. De plus, nous et d’autres avons démontré que les iPSC-BEC sont utiles pour modéliser diverses maladies du SNC telles que l’interaction hôte-pathogène, la maladie de Huntington et le déficit en MCT8 qui cause le syndrome d’Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21. Ici, nous montrons comment dériver des iPSC-BEC à partir de sources d’iPSC renouvelables et l’infection des iPSC-BEC par Nm conduisant à l’activation de la réponse immunitaire innée. Nous pensons que ce modèle est utile pour interroger l’interaction hôte-pathogène qui ne peut pas être récapitulée dans d’autres modèles in vitro et est particulièrement utile lors de l’examen des interactions avec des agents pathogènes spécifiques à l’homme tels que Nm.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

REMARQUE : Toutes les étapes de préparation des milieux et des réactifs, de l’entretien des cellules souches et de la différenciation sont adaptées de Stebbins et al.22.

1. Préparation des matériaux nécessaires à la culture des cellules iPS et à la différenciation BEC.

  1. Revêtement matriciel de plastique de culture tissulaire (TC) pour la culture iPSC IMR90-4
    1. Gel de matrice de la membrane basale aliquote (p. ex., Matrigel) en aliquotes de 2,5 mg et conserver à -20 °C.
      REMARQUE : Travaillez rapidement lorsque vous manipulez le gel matriciel et l’aliquote sur de la glace, car il forme un gel au-dessus de 4 °C et ne peut pas être alicoté une fois qu’il s’est solidifié.
    2. Pour l’enrobage du plastique TC, ajouter rapidement une aliquote de gel matriciel à 30 mL de milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 1 mL du milieu sur le gel matriciel congelé, pipeter de haut en bas jusqu’à ce qu’il soit décongelé et transférer immédiatement dans le tube conique de 50 mL avec le milieu restant.
    3. Utiliser 1 mL de cette solution de gel-enrobage matriciel par puits d’une plaque à 6 puits et 12 mL par flacon T75.
      REMARQUE : Le plastique TC enduit de gel Matrix peut être préparé jusqu’à deux semaines avant son utilisation. Il est cependant essentiel d’éviter que la solution de gel matriciel ne se dessèche, ce qui peut nécessiter l’ajout occasionnel de plus de DMEM/F12 sur le dessus des puits.
  2. Préparer le milieu d’entretien des cellules souches en ajoutant 50 mL de supplément 50x à 450 mL de milieu basal d’entretien des cellules souches dans l’environnement stérile d’une enceinte de sécurité biologique.
    NOTE : D’autres milieux d’entretien des cellules souches (mTeSR et E8) ont été utilisés dans d’autres études 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Pour préparer 500 mL de milieu non conditionné (UM), combinez 392,5 mL de DMEM/F12 avec 100 mL de sérum de remplacement knock-out (KOSR), 5 mL d’acides aminés non essentiels, de L-glutamine à une concentration finale de 1 mM et 3,5 μL de β-mercaptoéthanol. Filtrer et stériliser à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
  4. Pour préparer 200 mL de milieu de cellules endothéliales (CE) plus de l’acide rétinoïque (AR) et du bFGF, combiner 198 mL de milieu libre de sérum endothélial humain (hESFM), 2 mL de sérum dérivé pauvre en plaquettes (PDS) stérilisé par filtre et 20 ng/mL de bFGF. Filtrer, stériliser et conserver jusqu’à 2 semaines à 4 °C. Juste avant l’ajout aux cellules, ajoutez 10 μM de PR au milieu EC.
    REMARQUE : Comme le PDS a été abandonné et peut donc être limité, ce protocole a été mis en œuvre avec succès en utilisant B27 au lieu de PDS 15,23,26.
  5. Pour préparer 200 mL de milieu EC sans RA ni bFGF, mélanger 198 mL de hESFM et 2 mL de PDS stérilisé par filtre et stériliser le filtre. Conserver jusqu’à 4 semaines à 4 °C.

2. Entretien de la culture cellulaire IMR90-4

NOTE : Nous utilisons ici la lignée cellulaire IMR90-4 comme exemple, mais d’autres lignées de cellules souches pluripotentes induites telles que CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR et CS03iCTRn2 ont été utilisées avec succès pour la différenciation en BEC 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Cultivez des cellules iPS à 37 °C dans du CO 2 à 5 % et conservez-les généralement sur des plaques à 6 puits à différentes densités avec2 mL de milieu d’entretien de cellules souches par puits.
  2. Pour l’entretien de la culture des CSPi, choisir un seul puits de passage qui n’est pas confluent et qui comporte des espaces ouverts entre les colonies.
    1. Aspirer le milieu de culture, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire non enzymatique et incuber à 37 °C pendant 7 min. Pendant que l’incubation est en cours, remplacez la solution de gel matriciel, sur une nouvelle plaque à 6 puits, par 2 mL de milieu d’entretien de cellules souches fraîches par puits.
    2. Aspirer soigneusement le réactif de dissociation cellulaire non enzymatique en prenant soin de ne pas aspirer les cellules encore attachées à la plaque.
    3. Ajouter 6 mL de milieu d’entretien pour cellules souches et rincer le fond du puits à quelques reprises jusqu’à ce que toutes les cellules soient complètement détachées. Ensuite, ensemencez la nouvelle plaque à 6 puits avec des densités variables, généralement 1 :6 ou 1 :12 pour un entretien normal.
      REMARQUE : En utilisant les ratios susmentionnés, les cellules sont divisées environ deux fois par semaine.
    4. Déplacez la plaque vers l’incubateur et répartissez les cellules ensemencées uniformément dans les puits en secouant la plaque d’avant en arrière et de gauche à droite, en faisant une pause entre les mouvements d’agitation alternés jusqu’à ce que le milieu se soit déposé.

3. Différenciation des cellules endothéliales cérébrales des cellules iPS humaines

  1. Placage des cellules iPS pour la différenciation (jour -3 du protocole de différenciation)
    1. Selon le puits de culture d’entretien IMR90-4 utilisé pour plaquer la différenciation, aspirer le milieu de culture, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire enzymatique par puits et incuber à 37 °C pendant 7 min.
    2. Inactiver le réactif de dissociation des cellules enzymatiques en transférant 1 mL de suspension cellulaire dissociée dans un tube conique de 15 mL avec au moins 2 mL de milieu d’entretien de cellules souches fraîches pour 1 mL de cellules. Faire tourner la suspension cellulaire à 1 500 x g pendant 5 min.
    3. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu d’entretien des cellules souches par puits de cellules IMR90-4 utilisées, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      REMARQUE : Il peut être utile de diluer 1 :1 avec 0,4% de bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes lors du comptage. Selon la densité des cellules iPS, un puits d’une plaque à 6 puits donne généralement 1 à10 6 cellules.
    4. Pour la différenciation dans un flacon T75, ajouter 7,5 x 105 cellules à 12 mL de milieu d’entretien des cellules souches et d’inhibiteur ROCK (dichlorhydrate Y27632) à une concentration finale de 10 μM. Aspirer la solution de gel enrobage matriciel à partir d’un flacon T75 et transférer la suspension cellulaire dans le flacon. Répartissez les cellules de manière égale en agitant la fiole d’avant en arrière et de gauche à droite (voir étape 2.2.4) et incubez à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE : Il est essentiel d’ajouter un inhibiteur de ROCK à cette étape pour améliorer la survie des cellules souches uniques dissociées25,29. Les cellules doivent être réparties uniformément dans le flacon et dans des singulières présentant une morphologie étalée, semblable à celle du mésenchymateux, en raison du traitement par inhibiteur de ROCK22.
  2. Le jour -2 et le jour -1, changer le milieu pour un milieu d’entretien de cellules souches fraîches ; 12 mL par T75.
  3. Le jour 0, commencez la différenciation en changeant le média en messagerie unifiée ; 12 mL par T75.
  4. Changez d’UM tous les jours (jour 1 – jour 5).
    REMARQUE : Les cellules atteignent généralement la confluence après 2 à 3 jours dans UM, ce qui peut être observé à l’œil nu ou à travers un microscope à fond clair inversé. Au fur et à mesure que la différenciation progresse, les « voies neurales » nestin+ deviennent visibles avec des cellules PECAM-1+ entre les deux, comme décrit précédemment13,14.
  5. Augmenter sélectivement la population de cellules endothéliales en passant au milieu EC avec 20 ng/mL de bFGF et 10 μM d’acide rétinoïque (PR) (jour 6) et en incubant pendant deux jours. Le milieu EC avec bFGF peut être préparé jusqu’à deux semaines à l’avance. L’AR est ajouté à partir d’un bouillon congelé le jour de l’utilisation (p. ex., 1 μL de 10 mM d’AR pour 1 mL d’EC + bFGF).
    REMARQUE : Une différenciation réussie peut également être obtenue sans supplémentation en PR aux jours 6 et 8. L’omission de l’AR produira toutefois des BEC avec des FEER réduitsde 12,13,14.
  6. Enrober les plaques de culture cellulaire et les inserts membranaires (p. ex., Transwell) de collagène IV et de fibronectine (jour 7), pour la purification des BEC et les expériences suivantes.
    1. Pour le revêtement des inserts membranaires, combinez 4 parties de collagène IV (1 mg/mL dans 0,5 mg/mL d’acide acétique), 1 partie de fibronectine (1 mg/mL) et 5 parties d’eau stérile de qualité tissulaire. La solution ECM peut être diluée 1 :5 pour le revêtement des plaques de culture cellulaire (c’est-à-dire 4 parties de collagène IV, 1 partie de fibronectine, 45 parties d’eau). Incuber avec une solution d’enrobage à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Les plaques et les inserts membranaires peuvent également être enduits pendant au moins 4 h avant la sous-culture le jour même de l’étape de purification.
  7. Purifier les BEC en sous-cultivant les cellules différenciées sur des plaques ou des inserts membranaires enrobés de collagène IV et de fibronectine (jour 8).
    1. Aspirer le milieu EC et ajouter un réactif de dissociation cellulaire enzymatique (12 mL par T75). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que 90 % des cellules se soient détachées du flacon.
      REMARQUE : La dissociation cellulaire peut prendre jusqu’à 1 h.
    2. Pendant le temps d’incubation, retirez la solution d’enrobage de collagène IV/fibronectine des plaques/inserts préalablement préparés et laissez-les sécher dans une hotte stérile. Il faut environ 20 minutes pour que les inserts sèchent.
    3. Une fois que les cellules se sont détachées, rincez-les du flacon à l’aide d’une pipette de 10 ml. Pipeter de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique.
      REMARQUE : La suspension à cellule unique est importante pour un comptage fiable des cellules et pour obtenir des monocouches solides.
    4. Diluer avec un volume au moins égal d’hESFM frais dans un tube conique de 50 mL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Pelleter les cellules à 1 500 x g pendant 10 min.
    6. Remettre les cellules en suspension dans un volume approprié d’EC + bFGF + RA fraîchement préparé pour obtenir une suspension de 2 x 106 cellules/mL pour l’ensemencement sur des inserts membranaires. Ajouter 500 μL (1 x 106 cellules) sur le dessus d’un insert à 12 puits et 1,5 mL de milieu EC + bFGF + RA sur le fond. Pour l’ensemencement sur des plaques à 24 et 48 puits, diluer la suspension cellulaire 1 :2 et ajouter 500 μL (5 x 10 5 cellules) et 250 μL (2,5 x 105 cellules) par puits, respectivement. Répartir les cellules uniformément dans le puits/l’insert (voir étape 2.2.4) et incuber à 37 °C sous 5 % de CO2.
  8. Changer le milieu sur les plaques/transpuits en EC sans bFGF ou RA (jour 9).
  9. Effectuer des expériences d’infection, des mesures TEER et des colorations par immunofluorescence comme décrit dans les sections suivantes (jour 10).
    REMARQUE : Les BEC différenciées et purifiées avec succès atteignent généralement le pic TEER au jour 10 et expriment des marqueurs caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales telles que PECAM-1 (CD31) et la VE-cadhérine, le transporteur de glucose GLUT-1, les transporteurs d’efflux tels que la glycoprotéine p et les composants à jonction serrée ZO-1, Occludin et Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Reportez-vous à Lippmann et al., Stebbins et al. et d’autres pour plus de détails et d’images des types cellulaires, des morphologies et de l’expression des marqueurs spécifiques au type cellulaire au cours du processus de différenciation 13,14,15,16,17,19,22. Des images représentatives des cellules IMR90-4 à différents stades du processus de différenciation BEC sont présentées à la figure supplémentaire 1.

4. Résistance électrique transendothéliale (TEER) comme mesure de l’étanchéité de la barrière

NOTA : Le TEER est habituellement lu sur les inserts membranaires aux jours 9 et 10 de la différenciation afin de confirmer la génération réussie de CSPi-BEC formant une barrière (Figure 1A).

  1. Placez le volt-ohmmètre épithélial (EVOM) dans l’environnement stérile d’une hotte de biosécurité et connectez l’électrode à l’EVOM.
  2. Désinfectez l’électrode en l’immergeant dans de l’EtOH à 70 % pendant au moins 5 min et laissez-la sécher complètement.
    REMARQUE : Une incubation plus longue dans de l’EtOH à 70% ou une décontamination de l’électrode à l’aide d’une solution d’hypochlorite à 5% est possible si nécessaire.
  3. Récupérez les iPSC-BEC sur les inserts membranaires de l’incubateur et mesurez le TEER.
    REMARQUE : Il est important de lire TEER rapidement après le retrait de l’incubateur car le changement de température peut avoir un impact sur la mesure TEER.
  4. Lire TEER en plongeant l’électrode dans le milieu de manière à ce que l’électrode la plus courte soit placée sur le dessus de l’insert et que l’électrode la plus longue atteigne le milieu entourant l’insert.
    REMARQUE : Assurez-vous que les électrodes aux extrémités des « baguettes » sont complètement recouvertes de liquide. Si nécessaire, inclinez le puits pour y parvenir avant de reposer à nouveau la plaque pour la mesure.

5. Coloration par immunofluorescence (IF) pour valider le phénotype BEC

NOTA : Pour valider la qualité des cellules entièrement différenciées et purifiées, les monocouches iPSC-BEC sont colorées pour les marqueurs caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales au jour 10 du processus de différenciation, tel que décrit précédemment (Figure 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Aspirez le médium et lavez 1x avec du PBS.
  2. Fixez les cellules avec du méthanol glacé à température ambiante (RT) pendant 15 min.
  3. Laver 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bloquer avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans du PBS à RT pendant 1 h.
  4. Aspirer et ajouter les anticorps primaires dilués dans une solution bloquante. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Se reporter au tableau des matériaux et à Stebbins et al. pour obtenir des informations sur la source et la dilution des anticorps22.
  5. Laver 3 fois avec du PBS avant d’ajouter l’anticorps secondaire dilué dans une solution bloquante. Incuber à RT pendant 1 h. Protégez les échantillons de la lumière à partir de ce point.
  6. Laver 2x avec du PBS. Ensuite, ajoutez le DAPI à une dilution de 1 :5 000 dans du PBS et colorez à RT pendant 15 min.
  7. Lavez 1x en laissant le PBS allumé et prenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence.

6. Préparation de bactéries et infection des iPSC-BEC

  1. La veille de l’expérience d’infection (jour 9 de la différenciation), commencez une culture de la bactérie pendant la nuit à partir de bouillons congelés. En cas d’infection par le Nm, étalez les bactéries sur la gélose Columbia avec 5 % de sang de mouton (gélose au sang). Incuber les cultures bactériennes à 37 °C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
  2. Le lendemain (jour 10), préparez du PPM+ frais en complétant le milieu de protéase peptone (PPM) avec 50 μL de 2 M MgCl2, 50 μL de 2 M NaHCO3 et 100 μL de supplément Kellogg’s par 10 mL. Inoculer 10 mL de milieu PPM+ dans un tube conique de 50 mL avec Nm de la plaque de culture de nuit à l’aide d’un coton-tige stérile. Incuber en agitant à 200 tr/min à 37 °C pendant 1,5 h (c’est-à-dire jusqu’à ce que les bactéries soient en phase de croissance logarithmique).
  3. Au cours de l’incubation bactérienne, préparer les iPSC-BEC dans une plaque à 24 puits ou sur des inserts membranaires pour l’infection en remplaçant l’ancien milieu par 400 μL de milieu EC frais (sans bFGF ni RA) par puits/haut de l’insert membranaire.
  4. Centrifuger la culture bactérienne à 4000 x g pendant 10 min et aspirer le milieu. Remettre la pastille bactérienne en suspension dans 250 μL de PBS.
  5. Dans 4 mL de PBS frais, utiliser une partie de la suspension de cellules bactériennes et ajuster à une OD600 de 0,4 (environ 1 x 108 UFC/mL).
  6. Ensuite, diluer les bactéries dans un milieu de culture cellulaire (milieu EC) en fonction de la multiplicité d’infection souhaitée (MOI).
    REMARQUE : Par exemple, pour une MMO de 10, diluer 1 :10 ou 1 :5 lors de l’infection des CSP-BEC iPS dans une plaque à 24 puits ou sur des inserts membranaires, respectivement (1 x 105 cellules par monocouche dans une plaque à 24 puits). L’ajout de sérum humain n’est pas inclus dans la préparation du Nm pour l’infection, comme cela a été décrit dans d’autres manuscrits, car il a été observé qu’il avait un effet délétère sur le phénotype de barrière iPSC-BEC tel que mesuré par TEER (données non présentées)30,31. Cependant, l’interaction du Nm et des CSPi-BEC n’est pas affectée avec ou sans sérum humain (données non présentées).
  7. Infecter les CSP-BEC iPS dans chaque puits avec 100 μL de la suspension bactérienne préparée et incuber pendant la durée d’infection souhaitée.
    NOTE : L’expression d’un certain nombre de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires est élevée dans les CSPi-BEC lorsqu’elles sont infectées par Nm, surtout après 8 h d’infection, comme décrit précédemment par Martins-Gomes et al (Figure 2)19.

7. Activation immunitaire innée par PCR quantitative

REMARQUE : À l’aide d’un protocole préféré d’isolement de l’ARN, de synthèse de l’ADNc et de qPCR, prélever des échantillons et exécuter la qPCR sur les cytokines sélectionnées.

  1. 7.1. Prélever l’ARN des échantillons BEC après l’infection au jour 10 du protocole de différenciation, en utilisant des réactifs provenant d’un kit d’isolement de l’ARN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Évitez la contamination par nucléase des échantillons en travaillant soigneusement dans un environnement nettoyé et stérilisé.
    1. Préparez le tampon de lyse et ajoutez 350 μL à chaque puits/monocouche d’iPSC-BEC.
    2. Prélever les échantillons en pipetant de haut en bas plusieurs fois (p. ex., 20x) et en transférant la suspension dans un tube de microcentrifugation stérile.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être isolés par l’ARN.
    3. Suivez le protocole fourni avec le kit d’isolement de l’ARN pour la purification de l’ARN à partir de cellules et de tissus en culture.
    4. Après l’élution dans de l’eau exempte de nucléases, conservez les échantillons d’ARN sur la glace afin de minimiser toute activité potentielle de la RNase.
    5. Estimer les concentrations d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (p. ex., Nanodrop).
  2. Générez une banque d’ADNc à partir de l’ARN collecté à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc (voir le tableau des matériaux).
    1. Mettre en place des réactions composées d’un mélange maître de synthèse d’ADNc, d’au moins 200 ng (idéalement 500 ng) d’ARN d’échantillon et d’eau sans nucléase dans un volume de réaction total défini tel que décrit dans le protocole du kit de synthèse d’ADNc.
    2. Sur un thermocycleur standard, exécutez un programme adapté aux réactifs du kit de synthèse d’ADNc utilisé. Par exemple : 25 °C pendant 2 min, 55 °C pendant 10 min, 95 °C pendant 1 min.
    3. Après la synthèse, diluer l’ADNc jusqu’à 1 :10 dans de l’eau exempte de nucléases et déplacer les échantillons à 4 °C pour un stockage à court terme ou à -20 °C pour un stockage à long terme.
      NOTA : Une dilution plus faible peut être nécessaire si la concentration d’ARN est faible (p. ex., inférieure à 50 ng). L’ADNc dilué peut être conservé jusqu’à un an à une température de -20 °C.
  3. Effectuez une qPCR sur les échantillons d’ADNc ciblant les transcrits des gènes de réponse immunitaire innée tels que les cytokines et les chimiokines avec des amorces soigneusement conçues et validées.
    REMARQUE : Comme la conception de l’amorce est très importante pour la qualité des résultats de la qPCR, l’efficacité de l’amorce doit être testée en effectuant une série de dilution et l’absence de plusieurs produits doit être confirmée sur un gel d’ADN.
    1. Pour une réaction de 25 μL, utiliser 0,5 μL d’amorce directe et 0,5 μL d’amorce inverse (10 mM dans de l’eau sans nucléase), 1 μL d’ADNc, 10,5 μL de H2O sans nucléase et 12,5 μL de mélange maître qPCR.
    2. Effectuer la réaction sur un appareil qPCR en utilisant le protocole de cycleur suivant : (a) 4 °C pendant 2 min ; b) 95 °C pendant 15 min ; c) 95 °C pendant 15 s ; d) 60 °C pendant 1 min ; parcourez (c) et (d) 45 fois ; e) courbe de fusion facultative : 30 à 99 °C par incréments de 1 °C ; 25 °C pendant 5 min.
    3. Pour l’analyse des données, utilisez le calcul ΔΔCT pour comparer les niveaux d’expression des cytokines et des chimiokines à un gène de référence tel que 18S ou GAPDH.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le protocole décrit ici est adapté de Stebbins et al. et met en évidence le processus de différenciation des cellules iPS en cellules endothéliales semblables au cerveau qui possèdent des propriétés de BHE, et comment utiliser ce modèle pour les études d’infection utilisant des cellules iPSC-BEC avec Nm19,22. Les iPSC-BEC, lorsqu’ils sont différenciés correctement, présentent des propriétés de barrière serrée mesurées par TEER qui sont souvent supérieures à 2000 ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La modélisation des BEC et de la BHE a posé des défis, car les BEC humains primaires et immortalisés, in vitro, ont tendance à ne pas avoir de phénotypes barrières robustes. L’avènement des technologies de cellules souches humaines a permis la génération de cellules de type BEC dérivées de CSPi qui conservent les phénotypes de BHE caractéristiques attendus, tels que les marqueurs endothéliaux, l’expression des jonctions serrées, les propriétés barrières, la réponse à d’autres types de cellules du SNC et les tran...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L.M.E. est soutenu par le programme de formation à la recherche de la DFG GRK2157 intitulé « Modèles tissulaires 3D pour l’étude des infections microbiennes par des agents pathogènes humains » attribué à A. S-U. B.J.K. bénéficie d’une bourse postdoctorale de la Fondation Alexander von Humboldt. De plus, nous remercions Lena Wolter pour son assistance technique dans la génération des iPSC-BEC dans le domaine de la culture.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Accutase (1x)SigmaA6964Réactif de dissociation cellulaire enzymatique
Acide acétiqueSigmaA6283
Acide rétinoïque tout-trans (RA)SigmaR2625
Anti-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludineInvitrogen33-1500
Anti-VE-cadhérineSanta Cruzsc-52751
Anti-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptoneBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Plaques et flacons de culture cellulaireCentrifugeuse Sarstedt
(Heraeus Megafuge 1.0R)Thermo Scientific
Classe IINuaireNU-437-400E
(Incubateur DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed)Nuaire
Collagen IVSigmaC5533
Columbia ager + 5 % de sang de moutonBiomérieux43049
Costar Transwell filtres polyester (12 ou 24 puits)Corning3460, 3470
D(+)-GlucoseMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Gibco21600-069
Volt-ohmmètre épithélial (Millicell ERS-2) avec électrode STXMerck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronectinSigmaF1141
(Eclipse Ti)
Hémacytomètre Nikon (Neubauer)A. HartensteinZK06
Facteur de croissance des fibroblastes de base humain (bFGF)PeproTech100-18B
Milieu sérique endothélial humain (hESFM)Gibco11111-044
Microscope inversé (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cellules
Pour préparer 110 ml de supplément Kellogg’s, préparez 100 ml de 4 g/ml de glucose, 0,1 g/ml de glutamine, 0,2 mg/ml de pyrophosphate de thiamine et 10 ml de 5 mg/ml de Fe(NO3)3 et combinez les solutions. Filtrer, stériliser et stocker aliquote à -20 ° ;C.
Remplacement sérique knockout (KOSR)Gibco10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010Lkit de synthèse d’ADNc
Matrigel MatrixCorning354230
MéthanolROTH4627.5
MgCl2ROTHKK36.1
Micropipettes (Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Acides aminés non essentiels (NEAA)Gibco11140-035
NucleoSpin Kit d’isolement d’ARNMachery-Nagel740955Kit d’isolement d’ARN
Pipette boy (Accu-Jet Pro)Marque
Sérum dérivé du plasma pauvre en plaquettes, bovin (PDS)Fisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR master mix
film qPCR (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
plaques qPCR (MicroAmp Fast 96-well)Applied Biosystems4346907
Inhibiteur de ROCK, chlorhydrate Y27632Tocris1254
Thermocycleur RT-PCR (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Pipettes sérologiquesSarstedt
StemFlex milieu basal + 50x supplément StemFlexGibcoA3349401Milieu d’entretien des cellules souches
Rotor à godets oscillants (Heraeus #2704)Thermo Scientific
Pyrophosphate de thiamineSigmaC8754-5G
Trypan Blue Solution, 0,4 %Gibco15250061
VerseneGibco15040-033Réactif de dissociation cellulaire non enzymatique (EDTA)
Armoire de biosécurité Incubateur CO2 Microscope à fluorescence

Références

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26(2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Étiquettes

Cellules endothéliales cérébrales dérivées d'iPSCmodèle de barrière hémato-encéphaliquerésistance électrique transendothélialedifférenciation des cellules souchesmarqueurs de cellules endothélialesprotocole de préparation bactériennemaintenance de la culture cellulaireanalyse des propriétés de barrièreinteraction hôte-pathogène
Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.