Method Article

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, quatre méthodes pour générer des organoïdes testiculaires à partir des cellules testiculaires murines néonatales primaires sont décrites, c’est-à-dire la matrice extracellulaire (ECM) et les environnements de culture 2D et 3D exempts d’ECM. Ces techniques ont de multiples applications de recherche et sont particulièrement utiles pour étudier le développement testiculaire et la physiologie in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les organoïdes testiculaires fournissent un outil pour étudier in vitro le développement testiculaire, la spermatogenèse et l’endocrinologie. Plusieurs méthodes ont été développées afin de créer des organoïdes testiculaires. Beaucoup de ces méthodes reposent sur la matrice extracellulaire (ECM) pour favoriser l’assemblage des tissus de novo, cependant, il existe des différences entre les méthodes en termes de morphologie biomimétique et la fonction des tissus. En outre, il existe peu de comparaisons directes des méthodes publiées. Ici, une comparaison directe est faite en étudiant les différences dans les protocoles de génération organoïde, avec des résultats fournis. Quatre méthodes de génération archétypales : (1) sans ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) sans ECM 3D, et (4) culture ECM 3D sont décrites. Trois repères primaires ont été utilisés pour évaluer la génération organoïde testiculaire. Il s’est agi de l’auto-assemblage cellulaire, de l’inclusion des principaux types de cellules (Sertoli, Leydig, germes et cellules péritubulaires) et de l’architecture tissulaire compartimentée de façon appropriée. Des quatre environnements testés, les cultures 2D ECM et 3D sans ECM ont généré des organoïdes avec des morphologies internes les plus similaires aux testicules indigènes, y compris la compartimentation de novo des types tubulaires par rapport aux cellules interstitielles, le développement de structures tubules-like, et une fonction endocrinienne établie à long terme. Toutes les méthodes étudiées utilisaient des suspensions cellulaires testiculaires primaires non triées et utilisaient des ressources de culture couramment accessibles. Ces techniques testiculaires de génération d’organoïdes fournissent une boîte à outils hautement accessible et reproductible pour les initiatives de recherche sur l’organogenèse testiculaire et la physiologie in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïdes testiculaires sont une technique pionnière pour étudier le développement testiculaire, spermatogenèse, et la physiologie in vitro1,2,3,4. Plusieurs méthodes ont été explorées pour la génération organoïde; il s’agit notamment d’une variété de systèmes de culture extracellulaire (ECM) et sans ECM, dans les deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) orientations. Différentes méthodes de génération peuvent promouvoir des stratégies d’assemblage cellulaire distinctes; il en résulte un niveau élevé de variabilité morphologique et fonctionnelle entre les modèles organoïdes publiés. Le but de cet article est de discuter de l’état actuel des modèles testiculaires in vitro, et de servir de modèle pour les futurs chercheurs, lors de la conception d’expériences organoïdes testiculaires. Dans la présente étude, quatre archétypes différents du système culturel sont définis et caractérisés dans le processus expérimental et les résultats biologiques. Il s’agit notamment de: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, et 3D ECM méthodes de culture. Les stratégies présentées ici se veulent simples, accessibles et hautement reproductibles entre différents laboratoires et groupes de recherche.

Historiquement pour les testicules, la désignation « in vitro », a été utilisée pour plusieurs méthodes de culture différentes de tissus et de cellules testiculaires. Il s’agit notamment des méthodes organotypiques de culture des tissus et des organes (c.-à-d. la culture des explantations)5,de la culture isolée des tubules séminifères6,de la culture cellulaire testiculaire7et des méthodes de morphogenèse des tissus de novo (c.-à-d. constructions biologiques et organoïdes)1. Les premières investigations sur la spermatogenèse in vitro ont été réalisées il y a environ 100 ans, avec la culture des explants de testicules de lapin en 19208,et plus tard en 1937 avec des explants de souris9. Dans ces expériences initiales spermatogonia ont été observés pour dégénérer en grande partie au cours de la première semaine de culture, bien que certaines cellules meiotically différenciation ont été identifiés. Rappelant ces rapports historiques, la culture d’explantation de testis a été relancée et optimisée en 2011 pour devenir une technique réalisable pour étudier le testis10. Depuis 2011, la culture d’explant a produit le sperme compétent de fertilité dans les rapportsmultiples 11,,12,,13. Pourtant, en raison de la dépendance de la culture d’explantation sur les tubules indigènes préexistants de testicule, ces avances récentes sont plus exactement décrites comme exemples de fonction testiculaire « ex vivo » et de spermatogenèse, fonction tissulaire qui a été maintenue ou reprise lors de l’enlèvement du corps d’un organisme. En dépit de sa prédominance dans la littérature, le maintien et la différenciation à long terme de cellules germinales dans les explants testiculaires est difficilede reproduire 14,,15,,16,,17,,18,particulièrement au-dessus des périodes assez longues pour observer entièrement la spermatogenèse in vitro (~35 jours chez lessouris 19 et 74 chez l’homme20). Il est fascinant d’apprécier que bon nombre des mêmes défis rencontrés il ya 100 ans, sont encore expérimentés dans ex vivo spermatogenesis aujourd’hui.

Différents des approches ex vivo, les organoïdes testiculaires sont des microtissues assemblés de novo générés entièrement in vitro à partir de sources cellulaires (c.-à-d. cellules testiculaires primaires). Les organoïdes testiculaires fournissent une stratégie créative pour contourner la dépendance historique du champ à l’égard des tissus indigènes préexistants, et pour récapituler la biologie testiculaire complètement in vitro. Il existe de multiples exigences partagées par la plupart des modèles de tissus organoïdes; il s’agit notamment (1) de morphologie ou d’architecture des tissus in vivo-mimétiques, (2) de multiples types cellulaires majeurs du tissu représenté, (3) d’auto-assemblage ou d’auto-organisation dans leur génération, et (4) la capacité de simuler un certain niveau de la fonction et de la physiologie du tissureprésenté 21,22,23,24. Pour les testicules, cela peut être capturé en quatre grandes caractéristiques : (1) l’inclusion de principaux types de cellules testiculaires, germe, Sertoli, Leydig, cellules péritubulaires et autres cellules interstitielles, (2) assemblage de tissus dirigés par cellules, (3) types de cellules compartimentées de façon appropriée dans des compartiments tubulaires distincts (germe et Sertoli) et régions interstitielles (tous les autres types de cellules), et (4) un certain degré de fonction tissulaire (p. ex., sécrétion d’hormones reproductrices ou réponses tissulaires, et maintien et différenciation des cellules germinales). Compte tenu des défis historiques liés au maintien de la différenciation des cellules germinales ex vivo et in vitro, la récapitulation d’architectures testiculaires in vivo-mimétiques (c.-à-d. structures ressemblant à des tubules séminifères) avec des marqueurs supplémentaires suggérant la simulation de la physiologie testiculaire (p. ex., fonction endocrinienne), sont des étapes prioritaires vers la génération d’organoïdes qui pourraient un jour soutenir la spermatogenèse in vitro.

La majorité des méthodes organoïdes testiculaires publiées profitent de l’ECM disponible dans le commerce (p. ex., collagène ou formulations brevetées d’ECM)25,26,27 ou des ECM sur mesure (c.-à-d. hydrogels dérivés de testis décellularisés)28,29,30. L’ECM exogène favorise la formation de tissus de novo en fournissant un échafaudage de soutien à l’assemblage pour la génération de tissus. Les méthodes d’ECM ont offert un niveau impressionnant de formation de tissu, y compris une certaine présence de cellules germinales et la morphologie tissu-mimétique25,28. Toutefois, les ECM qu’ils utilisent ne sont pas toujours universellement disponibles (c.-à-d. hydrogels dérivés de l’ECM décellularisés), et certaines méthodes nécessitent des orientations sophistiquées en gel et en semis cellulaires (p. ex., gradients de 3 couches d’ECM et d’impression 3D)25,31,32. Les méthodes sans échafaudage (p. ex., chute suspendue et plaques de culture non hémorentes)33,34,35 ontégalement généré des organoïdes robustes et hautement reproductibles sans avoir besoin de gels ecm ou d’échafaudages. Cependant, la morphologie tissulaire de ces organoïdes sans échafaudage est souvent différente des testicules in vivo, et la plupart de ces rapports intègrent un additif biochimique ecm pour promouvoir la formationdes tissus 33,34,36, ou alternativement, compter sur la centrifugation pour l’agrégation cellulaire forcée et le compactage34, ce qui les rend moins idéal pour étudier la migration dirigée par cellules et l’auto-organisation.

Les quatre méthodes de génération organoïde présentées dans ce manuscrit comprennent à la fois des stratégies dépendantes de l’ECM et des stratégies indépendantes, chacune utilisant un ensemencement cellulaire simple qui permet l’observation de l’auto-assemblage organoïde conduit par cellules. Les quatre techniques peuvent être exécutées à partir des mêmes suspensions cellulaires ou peuvent faire usage de populations enrichies personnalisées et de type cellulaire. Une force de ces méthodes est la capacité d’observer les organoïdes s’auto-assembler en temps réel, et de comparer directement comment les structures testiculaires s’auto-assemblent entre différents microenvironnements de culture. Les différences phénotypiques entre ces quatre méthodes culturelles devraient être prises en considération pour leur impact sur la question de recherche ou le sujet de l’investigateur. Chaque méthode produit des constructions biologiques ou organoïdes dans les 24 h ou moins. En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent une boîte à outils des techniques d’assemblage organoïde pour étudier l’assemblage organoïde testiculaire, le développement tissulaire, et la physiologie testiculaire in vitro.

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Protocol

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Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern, et toutes les procédures ont été effectuées en vertu des protocoles approuvés par l’IACUC.

1. Préparation de solutions enzymatiques de dissociation tissulaire

  1. Utilisez deux solutions enzymatiques différentes (Solution 1 et Solution 2), toutes deux fabriquées à l’aide d’une solution moyenne de culture basale (BM).
  2. Pour préparer la BM, ajouter le sérum et la pénicilline-streptomycine à des concentrations minimales essentielles moyennes à finales de 10 % et 1 % respectivement (voir tableau des matériaux pour les reagents spécifiques). Filtrez ensuite stérilement le BM à travers un filtre de 0,22 μm. Avant utilisation avec les cellules, pré-équilibrer bm stérile à un pH neutre en se distribuant dans un plat de culture et en plaçant dans un humidifié, incubateur de CO2 à 37 °C pour un minimum de 1 h.
    REMARQUE : BM peut être stocké à 4 °C jusqu’à 1 semaine, après quoi bm frais doit être fait.
  3. Pour préparer des solutions de stock de collagène I, dissoudre d’abord 100 mg de collagène I en 1 mL d’embryon stérile de qualité H2O (concentration finale de 10% m/v), inverser ou tourbillonner pour dissoudre, et stocker 20 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Aliquots ne devrait être décongelé qu’une seule fois.
  4. Pour préparer des solutions de stock de désoxyribonuclease I (DNase I), ajoutez 20 mg de DNase I dans 1 mL d’embryon stérile de grade H2O (concentration finale de 2% m/v), inversez ou tourbillonnez pour dissoudre (ne pas vortex), et stockez 20 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Aliquots ne devrait être décongelé qu’une seule fois.
  5. Pour les solutions de stock d’hyaluronidase, ajouter 30 mg dans 1 mL de saline tamponnée stérile de phosphate (PBS; concentration finale 3% m/v hyaluronidase dans PBS contenant Ca++/Mg++), inverser ou tourbillonner pour dissoudre, et stocker 100 aliquots μL à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Les aliquots peuvent être décongelés et regelés plusieurs fois sans perte d’activité enzymatique.
  6. Pour préparer la dissociation Solution 1, ajouter 10 μL collagène I et 10 μL DNase I en 1 mL de BM stérile et prééquilibré (concentrations finales : 1 mg/mL de collagène I et 5 μg/mL DNase I). Triturer délicatement à l’aide d’une pipette pour mélanger la solution et préchauffer à 37 °C avant de l’utiliser avec le tissu.
    REMARQUE : La solution 2 est préparée en ajoutant 33 μL d’hyaluronidase (préchaurmée à 37 °C) par 1 mL de solution 1 (à une concentration finale de 1 mg/mL). Ceci se produit à mi-chemin par dissociation enzymatique du tissu de testicules à l’étape 2.5 ci-dessous.

2. Dissociation des tissus Testis

REMARQUE : Toutes les souris étaient logées dans des cages en polypropylène et fournies avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les animaux ont été nourris chow irradié qui ne contient pas de phytoestrogènes. Des souris juvéniles de CD-1, 5 jours post-partum (dpp), ont été employées pour toutes les expériences et anesthésiées avant l’euthanasie et la collecte de tissu, dans une chambre d’anesthésie attachée à un vaporisateur d’isoflurane (2.5 L/min dans O2). Des souris ont été confirmées pour l’anesthésie complète par l’absence d’une réponse au orteil-piqûre, après quoi les souris ont été euthanasiées par décapitation.

  1. Anesthésier les souris dans une chambre d’isoflurane, assurer l’anesthésie par l’intermédiaire d’une piqûre d’orteil, puis décapiter la souris à l’aide d’un ciseaux pointu. Placez la sulfpine de souris euthanasiée sur un tapis de dissection et stérilisez l’abdomen avec 70% d’éthanol. Tentez la peau du bas-ventre avec des forceps et ouvrez l’abdomen avec des ciseaux.
  2. Localiser les testicules dans les régions inguinales inférieures à gauche et à droite de l’abdomen. Couper leurs connexions aux déférents vas et tout tissu conjonctif d’ancrage, puis soulever l’ensemble des testicules (avec epididyme encore attaché) de l’animal. Placer les testicules dans une boîte de Pétri de BM pré-équilibrée.
  3. Sous un microscope à dissection et dans un champ stérile, faire une petite incision dans la tunica albuginea à une extrémité de chaque testicule avec soit un petit ciseaux de microdissection ou en déchirant doucement à l’aide de deux forceps fins.
    1. Puis, tout en tenant les testicules de l’extrémité opposée de l’incision, presser doucement les testicules avec des forceps fins et pousser dans un mouvement de balayage doux vers le trou dans la tunica; ceci libérera le tissu testiculaire comme pièce cohésive.
  4. Couper les testicules en petits morceaux (≤ 2 mm3) et les placer dans 1 mL de dissociation préchauffée (37 °C) solution 1.
    1. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
    2. Pour plus de 10 testicules, augmenter le volume total de la solution de dissociation de 1 mL, assurant un minimum de 1 mL de solution de dissociation par 10 testicules (p. ex., 2 mL pour 20 testicules, 3 mL pour 30 testicules, etc.).
    3. Triturer délicatement les morceaux de testicules 50 fois (50x) dans la solution 1 à l’aide d’une pipette P1000. Assurez-vous que les tubules se séparent les uns des autres et des tissus interstitiels à ce stade. S’il reste des touffes, incuber pendant 5 minutes supplémentaires et triturer une fois de plus (50x).
  5. Ajouter 33 μL de solution de bouillon d’hyaluronidase (préchauffée à 37 °C, à partir de l’étape 1,5) par 1 mL de mélange de dissociation de solution 1 (contenant le tissu testiculaire partiellement dissocié et les tubules). Après avoir ajouté hyaluronidase, c’est ce qu’on appelle la solution 2.
    1. Triturate (50x) à l’aide d’un P1000 et incuber à 37 °C pendant 5 min.
    2. Triturate (50x) à l’aide d’une pipette P200.
    3. Assurez-vous qu’à ce stade, il n’y a pas de tubules visibles ou de touffes de cellules. Si les touffes persistent, incuber jusqu’à 5 minutes de plus, avec trituration supplémentaire à l’aide d’une pipette P200 (50x).
  6. Étancher les enzymes de dissociation en ajoutant le sérum bovin fœtal (FBS) à 10% du volume total de la solution 2. Triturer plusieurs fois à l’aide d’une pipette P200 pour s’assurer qu’il ne reste pas d’amas et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour produire une suspension à cellule unique.
  7. Centrifugeuses à 100 x g pendant 7 min, jeter le supernatant, et resuspendre les cellules en BM frais.
  8. Comptez les concentrations cellulaires totales et viables à l’aide de l’exclusion bleue trypan sur un hémocytomètre. Ajouter 10 μL de 1:1 dilué, suspension cellulaire: trypan solution bleue, dans la chambre de comptage des cellules hemocytomètre (voir tableau des matériaux).
    1. Re-centrifugeuses cellules à 100 x g pendant 7 min et resuspendre en BM frais.
      REMARQUE : N’utilisez que des cellules viables pour calculer la concentration et le nombre de cellules. N’utilisez que des suspensions cellulaires ≥ une viabilité de 80 % pour la génération d’organoïdes.
    2. Préparer la suspension d’une seule cellule en concentrations cellulaires telles que décrites afin d’aliquot 280.000 cellules étant donné les volumes utilisés dans le protocole étapes spécifiques ci-dessous dans la section 3: 2D ECM-Libre - 0,56 x 106 cellules / mL, ECM 2D – 0,56 x 106 cellules/mL, 3D ECM-Free – 4,66 x 106 cellules/mL, ECM 3D – 2,8 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE : Toutes les expériences de culture présentées ici commencent par 280 000 cellules ensemencées par culture bien. Ces chiffres sont appariés aux données représentatives de la figure 1, de la figure 2, de la figure 3 et de la figure 4.

3. Préparation de plats de culture organoïde et ensemencement de cellules

REMARQUE : Pour assurer un ECM homogène, prégelez les aliquots congelés d’ECM pendant la nuit avant l’expérimentation. Les aliquots ECM doivent être immergés dans un seau de glace dans un réfrigérateur de 4 °C ou une pièce froide pour garantir une augmentation lente et graduelle de la température. Tout ECM est utilisé lors d’une dilution finale 1:1 dans BM pour la culture. Gardez l’ECM décongelé et l’ECM dilué 1:1 sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient immédiatement avant utilisation, sinon l’ECM pourrait polymériser prématurément.

  1. Pour une culture sans ECM 2D, aucune préparation spéciale n’est nécessaire, plaquez les suspensions à cellule unique (500 μL de 0,56 x 106 cellules/mL en BM) directement sur les glissières de chambre de 4 puits et placez-les dans un incubateur de 35 °C pour la culture.
    REMARQUE : Les cellules doivent adhérer au fond du plat de culture dans les 24 premières heures de la culture et peuvent présenter quelques petits groupes de cellules 3D dans ce même temps.
  2. Pour la culture 2D ECM, distribuez 100 μL de liquide matriciel extracellulaire dilué froid 1:1 dans une glissière de chambre de 4 puits, en veillant à ce que le gel couvre l’ensemble du fond du plat.
    1. Placez la glissière de chambre dans un incubateur de 35 °C pendant au moins 30 min pour permettre à l’ECM de polymériser dans un gel.
    2. Ajouter la suspension cellulaire (500 μL de 0,56 x 106 cellules/mL en BM) directement sur le dessus du gel 2D une fois qu’il a polymérisé.
      REMARQUE : Les cellules doivent se regrouper pour former de petits clusters 3D dans les 24 premières heures de la culture.
  3. Pour une culture 3D sans ECM, préparez des inserts de boîtes de Pétri 3D agarose avant de commencer la culture cellulaire.
    1. Tout d’abord, autoclave 1,5 g de poudre d’agarose dans un bécher de 100 mL, puis ajouter 75 mL stérile, l’eau distillée et micro-ondes pour produire fondu 2% agarose pour la coulée de boîte de Pétri 3D.
    2. Dans un espace de travail stérile, distribuez l’agarose fondue dans le moule de boîte de Petri 3D jusqu’à ce que le ménisque soit nivelé avec les côtés du moule.
    3. Laisser refroidir et solidifier l’agarose. Lorsqu’il est solide, tourner le moule à l’envers et fléchir doucement à plusieurs reprises jusqu’à ce que la boîte de Pétri 3D agarose tombe libre du moule.
      REMARQUE: À ce stade, on peut préparer de nombreux plats de Pétri 3D agarose et les stocker dans stérile H2O ou DPBS à 4 °C pendant plus d’un mois.
    4. Avant de la culture, placez les boîtes de Pétri 3D agarose dans un plat 24 bien cultivé, et couvrez-les avec 1 mL de BM. Laissez les boîtes de Pétri 3D s’équilibrer en BM pendant au moins 30 min dans un incubateur culturel de 37 °C. Jetez le BM, et répétez l’équilibrage une fois de plus avec 1 mL de BM frais. Après l’équilibrage des boîtes de Pétri 3D en BM, elles apparaîtront de la même couleur que la BM (c.-à-d. rose).
    5. Pour préparer l’ensemencement cellulaire, retirez tous les BM du puits et distribuez 200 μL de BM frais autour, mais pas à l’intérieur de l’évidement central de la boîte de Pétri 3D. En outre, recueillir tout BM restant de l’intérieur de la cavité centrale d’ensemencement cellulaire de l’insert de microwell.
    6. Distribuez la suspension à cellule unique (4,66 cellules/mL dans 60 μL de BM) dans l’évidement central de la boîte de Pétri 3D agarose. Triturer doucement de haut en bas pour mélanger les cellules et garantir une suspension cellulaire unique au début de la culture.
    7. Placer dans un incubateur humidifié de 35 °C pour la culture. Le lendemain, retirez les 200 μL de BM autour de l’insert de microwell, et remplacez-les par 1 mL de BM frais. Ceci apportera le niveau liquide au-dessus du plan de l’insert, vantant toute la culture.
    8. Retirez/ajoutez lentement et soigneusement les supports de l’extérieur de la boîte de Pétri 3D agarose. Les organoïdes devraient s’être compactés pendant la nuit, ce qui leur permet de se reposer au fond et de permettre aux changements des médias de laisser les organoïdes intacts.
  4. Pour la culture ecm 3D, préparer une suspension cellulaire unique en combinant, à parts égales, la suspension cellulaire en BM avec ecm froid et prégelé (concentration finale = 2,8 x 106 cellules/mL).
    1. Distribuez immédiatement le mélange cellule-ECM dans une glissière de chambre de 4 puits, en veillant à ce que le mélange couvre tout le fond de la plaque.
    2. Placez les glissières de chambre à 35 °C dans un incubateur et laissez son contenu polymériser. Cela devrait prendre au moins 30 min. Après la polymérisation, ajouter 500 μL de BM sur le dessus de la culture.
      REMARQUE : Les cellules auraient dû se regrouper pour former de petits agrégats 3D dans les 24 premières heures de la culture.

4. Entretien organoïde

  1. Culture tous les types de modèles organoïdes à 35 °C. Pour tous les types de culture échanger la moitié de leurs médias avec BM frais tous les 2 jours. Pour s’assurer que les organoïdes ne sont pas collectés accidentellement lors de l’échange moyen, toujours recueillir les médias lentement à partir d’un coin de la boîte de diapositives de chambre, et à partir d’un point externe à l’extérieur des plats agarose 3D Petri. Tous les supports peuvent être stockés à -20 °C pour être utilisés avec des immunoassays ou d’autres analyses ultérieures (c.-à-d. quantification d’hormones reproductrices sécrétées ou de cytokines).
  2. Après 7 jours dans la culture, employer BM contenant l’hormone stimulante de follicule (concentration finale 20 mIU/mL) et la gonadotropine chorionique humaine (concentration finale 4.5 IU/mL). Cela s’applique à tous les types de culture organoïde.
  3. Imagez régulièrement toutes les cultures organoïdes (c.-à-d. imagerie en accéléré) pour caractériser la formation organoïde et quantifier les mesures de l’auto-assemblage, du développement et de la croissance au fil du temps.

5. Collection Organoïde

REMARQUE : Tous les organoïdes peuvent être fixés avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pour l’immunolabeling en aval et les analyses histologiques. Fixer à 2 h à température ambiante avec rotation, ou toute la nuit à 4 °C.

  1. Pour les cultures sans ECM 2D, rincez d’abord l’échantillon avec du PBS frais, puis ajoutez du fixatif directement au-dessus des constructions adhérentes.
  2. Pour les méthodes de culture ECM (2D et 3D), rincer une fois avec PBS, puis soit ajouter fixatif directement sur le dessus de l’échantillon ECM-organoïde (pour fixer le gel ECM et organoïdes ensemble), ou alternativement, pipette doucement les organoïdes de haut en bas pour les libérer de l’ECM environnant, et transférer dans un tube séparé pour la fixation.
  3. Pour une culture 3D sans ECM, pipette doucement les organoïdes de haut en bas dans l’encastrement central de la boîte de Pétri 3D agarose; ceci rincera les organoïdes dehors facilitant leur collection facile avec une pipette. Transférer ensuite les organoïdes dans un tube séparé pour la fixation.
  4. Avant de se transformer en paraffine, intégrer de nombreux organoïdes (≥ 20) dans un petit volume (~ 30 μL) de gel de traitement des tissus; cela aide à orienter et à concentrer les organoïdes dans une petite zone à l’intérieur des blocs de paraffine, facilitant une observation plus facile lors de la section et une identification visuelle plus facile dans les sections de paraffine.
    REMARQUE : Les organoïdes peuvent être difficiles à identifier après l’intégration de la paraffine et la section sur une microtome.

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Results

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La génération organoïde a été considérée comme infructueuse si les cellules testiculaires ne se sont pas auto-assembler dans les 72 h de culture, cependant, toutes les méthodes présentées ici se réunissent dans les 24 h lors de l’utilisation de cellules murines juvéniles (5 dpp). Échec de la génération de construction biologique présentée comme une continuation des cellules librement suspendues (colonne de 0 h dans la figure 1)même après culture étendue (72 h). En l’absence d’auto-assemblage...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avec l’achèvement de ce protocole de génération organoïde, l’utilisateur aura quatre techniques de culture différentes à leur disposition pour l’assemblage de constructions testiculaires et organoïdes dans des environnements ECM ou ECM-free. Fait important, les quatre méthodes permettent au chercheur d’observer de façon non invasive l’auto-assemblage organoïde au fil du temps par imagerie ou enregistrement vidéo en accéléré, et de recueillir non invasivement des supports conditionnés pour l’analyse des hormones sécrétées...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, le National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 et 4UH3ES029073-03, et le Thomas J. Watkin’s Memorial Professorship.

Les auteurs remercient Eric W. Roth pour leur aide à la microscopie électronique de transmission. Ces travaux ont fait usage de l’installation BioCryo du NUANCE Center de l’Université Northwestern, qui a reçu le soutien de la Ressource expérimentale en nanotechnologie douce et hybride (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); le programme MRSEC (NSF DMR-1720139) au Materials Research Center; l’Institut international de nanotechnologie (IIN); et l’État de l’Illinois, par l’intermédiaire de l’IIN. Il a également utilisé l’équipement CryoCluster, qui a reçu le soutien du programme d’IRM (NSF DMR-1229693). Les graphiques de la figure 1 ont été conçus à l’aide BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Média de 0,22 μm Filtres stérilesMillipore Sigmascgpu05rePour média filtrant stérile
3&beta ; Anticorps primaire HSDCosmo Bio CoK0607Marqueur cellulaire de Leydig, dilution 1:500
AlexaFluor 568 &alpha ;-SourisThermo Fisher ScientificA-21202Anticorps secondaire marqué à la fluorescence
AlexaFluor 568 &alpha ;-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Anticorps secondaire marqué à la fluorescence
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Base du milieu de culture
Collagénase IWorthington BioLS004197Pour solution de dissociation 1
Matrice membranaire Corning Matrigel,Corning354234Matrice extracellulaire utilisée pour la coulée de gels de culture ECM 2D et 3D
Compteur de cellules Countess Compteur de cellulesThermo Fisher ScientificC10227Compteur de cellules automapportées (hémacytomètre)
Lames de chambre de comptage cellulaire CountessThermo Fisher ScientificC10228Lame d’hémacytomètre à utiliser avec le compteur automatisé Countess
Anticorps primaire DDX4Abcam138540Marqueur de spermatogonie, dilution 1:500
Désoxyribonucléase I (2 280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Pour solution de dissociation 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Pour la reconstitution de l’hyaluronidase
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco + Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Pour la reconstitution de la collagénase I et de la Dnase I
Sérum de bovin fœtalThermo Fisher Scientific16000044Pour le quençage des solutions de dissocation enzymatique
Follicule hormone stimulanteAbcamab51888Pour la culture organoïde à long terme
Gonadotrophine chorionique humaineMillipore SigmaC1063Pour la culture organoïde à long terme
Hyaluronidase, à partir de testicules bovinsMillipore SigmaH4272Pour la solution de dissociation 2
Inhibine B Dosage immuno-enzymatique AnshLabsAL-107Inhibine B Kit
ELISAKnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028Source de sérum pour milieux basaux
MicroTissues Boîte de Petri 3D micro-moules sphéroïdes (24-35, réseau 5x7)Millipore SigmaZ764051Pour la fabrication d’organoïdes 3D sans ECM
Nunc, Système de lames de chambre Lab Tek II, 4 puitsThermo Fisher Scientific12-565-7Pour culture 2D sans ECM et 2D, culture ECM 3D
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15-140-122Antibiotique pour milieux
Richard-Allan Scientific ; Histogel, Gel de traitement d’échantillonsThermo Fisher ScientificHG-4000-012Pour faciliter l’intégration de la paraffine
Anticorps primaire SOX9Millipore SigmaAB5535Marqueur Sertoli, dilution 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920Nourriture pour souris sans phytoestrogènes
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)Teklad Global2916Nourriture pour souris sans phytoestrogènes
Testostérone Immuno-enzymatique DosageCalbiotechTE373SKit ELISA de testostérone
Trypan Blue, 0,4Thermo Fisher Scientific15250061Pour le comptage cellulaire
&alpha ;Anticorps primaire SMAMillipore SigmaA2547Marqueur péritubulaire, dilution 1:500
beta ; Anticorps primaire à caténineBD Biosciences610154marqueur du cytoplasme de Sertoli, dilution 1:100
sans LDEV  %&

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