Méthodes modifiées pour le chargement des plaques d’extraction d’ADN à haut débit réduisent le risque de contamination

Les progrès récents dans le séquençage à haut débit des communautés microbiennes fournissent une profondeur de séquençage inégalée et, par conséquent, un aperçu sans précédent du fonctionnement et de la diversité du microbiome de la Terre¹. À mesure que la capacité de multiplex sur une seule voie de séquençage augmente, l’extraction de l’ADN à tube unique pourrait devenir une étape limitant les taux dans la production de données écologiques. Toutefois, les nouvelles méthodes d’extraction d’ADN à haut débit sont prometteuses pour le traitement de grandes quantités d’échantillons environnementaux avec une plus grande efficacité qu’auparavant². Ces méthodes impliquent souvent l’utilisation de plaques de 96 puits au lieu de tubes simples, augmentant ainsi le nombre possible d’extractions qui peuvent se produire simultanément. En tant que tel, l’aspect pratique et l’efficacité des méthodes d’extraction à haut débit sont évidents et ont été mis en œuvre pour le traitement d’échantillons environnementaux allant du sol^3,4 et les tissus végétaux^3,5 à la matière fécale humaine².

Bien que ces méthodes puissent accélérer considérablement le traitement des échantillons et l’extraction de l’ADN, la première étape du chargement du sol et d’autres échantillons écologiques dans des plaques de 96 puits est susceptible de contamination par des échantillons croisés. Ce type de contamination bien-à-puits peut se produire pendant les extractions d’ADN^6,,7,8 , et les puits sont^{particulièrement}vulnérables dans cette première étape avant que les échantillons soient suspendus dans une solution tampon. McPherson et coll.⁹ démontrent une méthode pour charger les sols rhizosphères en plaques de 96 puits à l’aide d’entonnoirs et de couvertures de bandes DE PCR de 8 puits, mais bien que leur méthode soit une approche plus contrôlée des plaques de chargement, elle offre encore amplement d’occasions de contamination des puits voisins lors du chargement de chaque échantillon. De plus, les puits ouverts permettent à un chercheur distrait de placer un échantillon dans le puits incorrect ou d’ajouter un échantillon dans un puits qui a déjà été chargé. En outre, une variété de types d’échantillons s’avèrent mal adaptés au chargement avec cette méthode; les échantillons humides collent souvent aux entonnoirs et les échantillons secs « sautent » entre les puits en raison de l’électricité statique.

Afin de réduire les possibilités de contamination entre les puits dans la première étape des extractions d’ADN à haut débit, nous avons développé une nouvelle approche pour charger les échantillons de sol dans des plaques de 96 puits. Nos méthodes protègent les puits contre l’exposition à l’environnement et nous empêchent de charger accidentellement plusieurs échantillons dans un puits (double chargement). Nous croyons que la méthode rapportée ci-dessous offre la promesse de réduire le potentiel de contamination et en tant que telle fournit un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits pour l’extraction ultérieure d’ADN.

1. Banc de laboratoire et préparation d’outils pour le chargement d’une plaque de 96 puits

1. Haut de banc clair en confondant avec 70% d’éthanol. Essuyez et laissez sécher l’air avant de pulvériser le dessus du banc avec 10% d’eau de Javel. Essuyez le dessus du banc à sec.
2. Stériliser la micro-scoopule, la spatule et les ciseaux chirurgicaux (courbés) en trempant dans 95% d’éthanol, puis exposer à une flamme. Tremper chacun dans 10% d’eau de Javel et laisser sécher à l’air avant l’utilisation.
   REMARQUE : Les outils doivent être stérilisés entre chaque échantillon.

2. Sous-échantillonnage et préparation d’échantillons

1. Stériliser les gants à l’aide d’éthanol avant le sous-échantillonnage.
2. Homogénéiser les échantillons de sol à fond avant le sous-échantillonnage.
3. À l’aide d’outils stérilisés, chargez un tube de centrifugeuse étiqueté de 2 mL avec un échantillon jusqu’à ce qu’il soit à moitié plein.
4. Répétez l’étape 2.2 jusqu’à ce que les 95 échantillons aient été sous-échantillonnés en tubes de centrifugeuse de 2 mL étiquetés. Le puits^{96 e} doit être utilisé comme un blanc d’extraction.
   REMARQUE : Les étapes 2.3 et 2.4 sont effectuées afin de réduire au minimum l’espace de stockage requis et d’empêcher l’échantillonnage au-dessus ou à double.
5. Conserver 2 tubes de sous-échantillon mL sur la glace jusqu’au chargement de la plaque.
6. Étiquette 96 stériles 200 tubes PCR à capuchon plat A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Placez ces tubes dans un rack de 96 puits.
7. Affectez un exemple d’ID avec un emplacement de puits (A1\u2012H12) et enregistrez-le.

3. Préparation des plaques

1. Retirez le couvercle en caoutchouc de la plaque de 96 puits (figure 1A–1C)et placez-le dans un sac en plastique stérile (voir tableau des matériaux). Sceller le sac en plastique pour éviter la contamination.
2. Couvrir la plaque de 96 puits d’un film d’étanchéité(figure 1D–1E); par exemple, utiliser un film d’étanchéité perçable précoupé (voir le Tableau des matériaux). Assurer le joint en roulant à l’aide d’un rouleau en caoutchouc.
   NOTE : Les tapis de silicone perçables pourraient potentiellement offrir une option réutilisable, à condition d’un nettoyage approprié entre les utilisations, mais les tapis de silicone que nous avons testés se divisent facilement le long des perçages et n’offriraient pas une protection égale aux plaques suivantes.
3. Placer la plaque au réfrigérateur (4 °C) pour garder au frais.

4. Transfert de sous-échantillons

REMARQUE : Voir l’étape 4.13 pour les modifications lorsque l’échantillon de sol est très petit.

1. Placer 24 des sous-échantillons de 2 mL dans un bloc de glace pour le stockage à froid.
2. À l’aide du nom de l’échantillon et de la feuille d’emplacement du puits, choisissez le tube PCR à capuchon plat de 200 μL.
3. Prenez un tube de sous-échantillon de 2 ml et un vortex pour environ 5 s pour assurer l’homogénéisation.
4. À l’aide d’outils stérilisés à l’aide de flammes et d’eau de Javel, chargez ~200 μL du premier échantillon dans le tube PCR à capuchon plat correct (figure 1F).
5. Répétez les étapes 4.2\u20124.4 jusqu’à ce que les 24 échantillons aient été chargés. Ensuite, passez à l’étape 4.6.
6. À l’aide d’un essuie-tout trempé d’eau de Javel, nettoyez l’extérieur du tube PCR à capuchon plat de 200 μL.
7. Inversez le tube et appuyez sur le banc pour déplacer l’échantillon vers le haut du tube. À l’une des ciseaux blanchis et stérilisés par flamme, coupez le fond du tube PCR pour créer une ouverture pour que l’échantillon tombe dans la plaque de 96 puits (Figure 1G).
8. Localisez le puits correct sur une plaque de 96 puits et passez le tube à travers la plaque avec la fin de coupe face jusqu’à atteindre ce puits. Inclinez légèrement la plaque pour faciliter la perforation du film d’étanchéité perçable précut, et seulement lorsque le tube est directement au-dessus du puits correct soigneusement l’inverser de sorte que la pointe de coupe s’adapte dans le puits. À l’aide d’outils stérilisés, appuyez sur le dessus du tube pcr jusqu’à ce que tout le sol soit tombé du tube dans le puits. Laissez le tube dans le puits avec couvercle fermé (Figure 1H–1J).
9. Retirez un tube PCR à 200 μL à capuchon plat à la fois et ajoutez 750 μL de solution de perles à ce puits (Figure 1K). Poussez le tube PCR à capuchon plat de 200 μL jusqu’au puits et marquez le dessus avec sharpie pour indiquer que ce puits a été chargé. Répétez cette opération pour chaque échantillon.
10. Une fois que les 24 échantillons ont été chargés et que la solution de perles a été ajoutée, retirez les tubes sous-échantillon de 2 mL et remplacez-les par 24 tubes non momplés.
11. Répétez les étapes 4.1\u20124.10 jusqu’à ce que les 95 puits aient été chargés d’échantillons ou de solutions vierges et de perles. Retirez les tubes sans les passer par-dessus les puits ouverts (Figure 1L).
12. Retirez soigneusement le film perçable et remplacez le couvercle en caoutchouc pour protéger la plaque jusqu’à ce qu’elle commence l’extraction (figure 1M–1O).
13. Pour de très petites quantités de sol qui sont également à grain fin, ajouter 750 μL de solution de perles au tube d’échantillon et utiliser une pointe de pipette à large alésage pour transférer tout le contenu dans le puits approprié. Placez le tube PCR dans l’ouverture pour éviter le double chargement.
    REMARQUE : Lorsque vous implémentez cette modification, car les particules organiques ou les petits fragments de roche plus gros que l’alésage de la pointe de la pipette peuvent obstruer la pipette et rendre le transfert de l’échantillon de boue difficile.
14. Au besoin, congeler à -20 °C et conserver les plaques chargées de l’échantillon et de la solution de perles jusqu’à l’extraction prévue.

5. Comparaison des méthodes de chargement des plaques

REMARQUE : Afin de vérifier notre nouvelle méthode de chargement des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits, nous avons divisé une seule plaque de 96 puits en trois sections. Nous avons utilisé trois méthodes différentes de chargement des plaques pour comparer le potentiel de chargement involontaire du sol et de contamination croisée. Les trois méthodes que nous avons utilisées étaient les méthodes décrites dans McPherson et coll.⁹, le protocole de chargement par défaut¹⁰de Qiagen et le protocole que nous décrivons dans cette publication.

1. Chargement du sol dans la plaque
   1. Section d’une plaque de 96 puits en trois blocs à quatre colonnes. Chargez chaque bloc à l’aide de l’une des trois méthodes mentionnées ci-dessus.
   2. Chargez le sol dans tous les autres puits afin que les puits d’échantillonnage et de puits vierges soient décalés. Cet arrangement permet une possibilité maximale de chargement par inadvertance et de contamination croisée.
   3. Congeler la plaque de 96 puits à -20 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.
2. Extraction d’ADN
   1. Extraire l’ADN selon le protocole d’extraction de plaques de 96 puits du fabricant¹⁰.
   2. Conserver les extraits d’ADN à -20 °C jusqu’à une analyse plus poussée.
3. Quantification de l’ADN dans des puits vierges
   1. Décongeler les extraits d’ADN à température ambiante, vortex et tourner vers le bas à l’aide d’un spinner plaque.
   2. Mesurer et enregistrer les concentrations d’ADN des puits vierges à l’aide d’un spectrophotomètre.
   3. Utilisez le test post-hoc d’ANVOA et de Tukey pour analyser les différences de concentration moyenne d’ADN dans les puits blancs.
      REMARQUE : Des différences significatives ont été signalées à α = 0,05.

Cette nouvelle méthode a été utilisée avec succès pour charger des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits. La comparaison des méthodes de chargement des plaques a montré que notre méthode avait la plus faible concentration d’ADN dans les puits vides. La concentration d’ADN dans les puits vierges était significativement inférieure à la méthode proposée par McPherson et coll.9 (p < 0,05), bien que les concentrations d’ADN dans notre méthode n’aient pas été statistiquement différentes de la méthode par défaut de Qiagen (figure 2). Les trois méthodes ont produit des concentrations moyennes d’ADN inférieures à 2 ng/μL, bien que seule notre nouvelle méthode ait produit des puits sans concentration mesurable d’ADN.

Figure 1 : Méthodes étape par étape pour charger des échantillons dans des plaques de 96 puits pour l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée entre les puits. Les couvertures gris foncé (présentes aux étapes A, B, N et O) représentent la couverture en silicium qui accompagne le kit d’extraction. Le couvercle gris clair (appliqué à l’étape D, enlevé après l’étape L) représente le ruban PCR perçable utilisé pour couvrir la plaque pendant le chargement. Bien qu’ils ne soient pas représentés, les outils doivent être stérilisés avant de charger chaque échantillon, et les tubes PCR doivent être essuyés avec de l’eau de Javel avant de percer le ruban ADHÉSIF. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Concentrations d’ADN de puits vierges. La concentration d’ADN est représentée dans ng/μL. Les lettres indiquent des différences significatives dans les concentrations d’ADN à α = 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.