Méthodes modifiées pour le chargement des plaques d’extraction d’ADN à haut débit réduisent le risque de contamination

Summary

Les méthodes actuelles de chargement des plaques de 96 puits pour les extractions d’ADN peuvent être sujettes à la contamination. Nous détaillons une nouvelle méthode de chargement des plaques de 96 puits qui réduit le risque de contamination croisée entre les puits. Notre méthode aidera d’autres chercheurs à tirer parti de l’efficacité des techniques d’extraction de l’ADN à haut débit et à minimiser les risques de contamination.

Abstract

Les techniques de séquençage de l’ADN à haut débit ont grandement contribué aux progrès de notre compréhension des relations entre les communautés microbiennes, des caractéristiques de l’hôte et des fonctions plus larges de l’écosystème. Avec cette augmentation rapide de l’ampleur et de la profondeur des capacités de séquençage sont venus des méthodes pour extraire, amplifier, analyser et interpréter l’ADN environnemental avec succès avec une efficacité maximale. Malheureusement, l’extraction rapide de l’ADN peut se faire au prix d’augmenter le risque de contamination entre les échantillons. En particulier, les extractions à haut débit qui sont basées sur des échantillons contenus dans une plaque de 96 puits offrent une méthode relativement rapide, par rapport aux extractions à tube unique, mais augmentent également les possibilités de contamination croisée bien-à-bien. Afin de minimiser le risque de contamination croisée entre les échantillons, tout en conservant les avantages des techniques d’extraction à haut débit, nous avons mis au point une nouvelle méthode de chargement d’échantillons environnementaux dans des plaques de 96 puits. Nous avons utilisé des films d’étanchéité PCR perçables pour couvrir chaque plaque pendant le chargement des échantillons et ajouté des échantillons d’abord aux tubes PCR avant de les déplacer dans des puits; ensemble, ces pratiques réduisent le risque de dérive des échantillons et de double chargement involontaire des puits. La méthode décrite dans le présent document fournit aux chercheurs une approche pour maximiser les techniques d’extraction à haut débit disponibles tout en réduisant le risque de contamination croisée inhérent aux plaques de 96 puits. Nous fournissons un aperçu détaillé étape par étape de la façon de passer de la collecte d’échantillons à l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée non désirée.

Introduction

Les progrès récents dans le séquençage à haut débit des communautés microbiennes fournissent une profondeur de séquençage inégalée et, par conséquent, un aperçu sans précédent du fonctionnement et de la diversité du microbiome de la Terre¹. À mesure que la capacité de multiplex sur une seule voie de séquençage augmente, l’extraction de l’ADN à tube unique pourrait devenir une étape limitant les taux dans la production de données écologiques. Toutefois, les nouvelles méthodes d’extraction d’ADN à haut débit sont prometteuses pour le traitement de grandes quantités d’échantillons environnementaux avec une plus grande efficacité qu’auparavant

Protocol

1. Banc de laboratoire et préparation d’outils pour le chargement d’une plaque de 96 puits

1. Haut de banc clair en confondant avec 70% d’éthanol. Essuyez et laissez sécher l’air avant de pulvériser le dessus du banc avec 10% d’eau de Javel. Essuyez le dessus du banc à sec.
2. Stériliser la micro-scoopule, la spatule et les ciseaux chirurgicaux (courbés) en trempant dans 95% d’éthanol, puis exposer à une flamme. Tremper chacun dans 10% d’eau de Javel et laisser sécher à l’air avant l’utilisation.
   REMARQUE : Les outils doivent être stérilisés entre chaque échantillon.

2. Sous-échantillonnage et préparation d’échantillons....

Results

Cette nouvelle méthode a été utilisée avec succès pour charger des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits. La comparaison des méthodes de chargement des plaques a montré que notre méthode avait la plus faible concentration d’ADN dans les puits vides. La concentration d’ADN dans les puits vierges était significativement inférieure à la méthode proposée par McPherson et coll.⁹ (p < 0,05), bien que les concentrations d’ADN dans notre méthode n’aient pas été statistiquement différentes de la méthod.......

Discussion

Cette méthode réduit les possibilités de contamination croisée bien à bien tout en chargeant des plaques d’extraction d’échantillons à haut débit et offre un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits au-delà des stratégies existantes de chargement des plaques^9,10. La contamination entre les puits peut être plus répandue dans les extractions de plaques de 96 puits que dans les extractions à un seul tube, en particulier lorsqu’elles sont automatisées

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL tubes à centrifuger	Fisherbrand	05-408-129
200 µ ; L Tubes micro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
96 puits PowerSoil Kit d’extraction d’ADN	Qiagen	12955-4	Nous avons utilisé un kit d’extraction de sol, mais n’importe quel kit au format 96 puits fonctionnerait.
Bloc de glace pour tubes à centrifuger de 2 mL	N’importe quel	Tout	bloc de glace conçu pour les tubes de 2 mL fonctionnera
Bloc de glace pour 200 & micro ; L tubes micro-PCR	Any Any	Bloc	glace conçu pour 200 & micro ; Les tubes L fonctionneront
Micro scoopula	N’importe quel	film
d’étanchéité perçable prédécoupé	Excel Scientific	XPS25
Spatule	n’importe quel	n’importe quel
ciseaux chirurgicaux	n’importe quel