Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Summary

Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.

Abstract

Un flux de travail de PCR de gouttelette multiplexe (mdPCR) et un protocole détaillé pour déterminer le nombre différentiel de globules blancs épigénétiques (WBC) sont décrits, ainsi qu’un dispositif thermoplastique de génération de gouttelettes d’élastomère (TPE). Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-typage WBC qui est d’une valeur pronostique importante dans différentes maladies. Ceci est réalisé par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN de régions spécifiques riches en CG dans le génome (CpG loci). Dans cet article, l’ADN traité en bisulfite provenant de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) est encapsulé dans des gouttelettes avec des réactifs mdPCR, y compris des amorces et des sondes fluorescentes d’hydrolyse spécifiques aux loci cpg qui sont en corrélation avec les sous-populations WBC. L’approche multiplexe permet l’interrogatoire de nombreux loci CpG sans avoir besoin de réactions mdPCR séparées, permettant une détermination paramétrique plus précise des sous-populations WBC à l’aide de l’analyse épigénétique des sites de méthylation. Cette quantification précise peut être étendue à différentes applications et met en évidence les avantages pour le diagnostic clinique et le pronostic suivant.

Introduction

L’analyse de la composition des globules blancs (CWB) est l’un des tests de laboratoire les plus fréquemment demandés dans le diagnostic hématologique. Le nombre différentiel de leucocytes sert d’indicateur pour un spectre de maladies comprenant l’infection, l’inflammation, l’anémie, et la leucémie, et est sous l’étude en tant que biomarqueur pronostique tôt pour plusieurs autres conditions aussi bien. L’étalon-or dans le sous-typage WBC implique l’immunostaining et/ou la cytométrie de flux qui exigent des anticorps fluorescents coûteux et sujets à l’instabilité et sont souvent fortement dépendants de la compétence de l’opérateur dans la préparation de l’échantillon. ....

Protocol

Toutes les expériences réalisées dans le domaine de cette étude portant sur des échantillons humains ont été approuvées par le Comité d’éthique du CNRC et ont été réalisées conformément aux politiques du CNRC régissant les sujets humains qui suivent les lignes directrices de recherche applicables et qui sont conformes aux lois du Québec, au Canada.

1. Préparation cellulaire

1. Décongeler immédiatement les cellules mononucléaires périphériques humaines congelées (PBMC) en plaçant le cryocial dans un bain d’eau à 37 °C pendant 5 min.
2. Inverser le cryocial deux fois pour resuspender doucement les cellules et à l’aide d’une pipe....

Results

Le générateur de gouttelettes microfluidiques à base de TPE a été fabriqué à l’aide du protocole décrit comme indiqué à la figure 1. Un masque de transparence a été utilisé en photolithographie pour obtenir le silicium (Si) maître. La lithographie douce a été exécutée pour obtenir une réplique inverse de PDMS du maître de Si qui a ensuite été employée pour fabriquer le moule époxy. Le précurseur d’époxy a été versé sur le PDMS et guéri pour le crosslink et le durcissement. Ce moule, représen.......

Discussion

Le protocole et les méthodes expérimentaux présentés permettent le mdPCR interne à l’aide d’un générateur de gouttelettes TPE fabriqué, d’un cycleur thermique et d’un microscope à fluorescence. L’appareil fabriqué utilisant le TPE doux au collage TPE offre des propriétés de surface hydrophobes qui sont uniformes sur tous les murs du canal, de sorte que le dispositif final ne nécessite aucun traitement de surface pour une utilisation ultérieure comme générateur de gouttelettes. Ce matériel a été couramment utilisé dans le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant		Fluoro-tensioactif
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Royaume-Uni		Caméra
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Utilisé pour l’analyse
Nikon, Japon			10x
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé ;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, États-Unis	5015 et 5010	Borosilicate Tube
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japon	LC-L1V5	DEL Source
Dolomite	3200063	Tube
Dolomite	3200302	Tube
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Microscope
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä ; rding, Autriche
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Suisse		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Allemagne
Image J		Utilisé pour évaluer le diamètre
Anachemie, Montréal, QC
Excelitas, MA, USA		Lampe
Galenvs Sciences Inc., Montréal, QC	DE1010
Hexpol TPE, & Aring ; må ; l, Suède		Élastomère thermoplastique (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japon		Utilisé pour l’acquisition d’images
3M, St Paul, MN		Huile
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Coloration fluorescente bleue à cellules vivantes (DAPI)
IDEX Santé & Science, Oak Harbor, WA	P-881	Raccords
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Allemagne
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Microscope
Nikon, Japon
Loctite	AA 352