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Culture et dosage de populations de Caenorhabditis elegans à grande échelle au stade mixte

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DOI :

10.3791/61453

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5 mai 2021

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1Department of Genetics, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 4Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Dans cet article

Résumé

Pour utiliser Caenorhabditis elegans (C. elegans) dans la recherche omique, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations de vers où un seul échantillon peut être mesuré sur toutes les plateformes pour des analyses comparatives. Ici, une méthode pour la culture des populations de C. elegans sur des plaques de culture à grande échelle (LSCPs) et pour documenter la croissance de la population est présentée.

Résumé

Caenorhabditis elegans (C. elegans) a été et reste un organisme modèle précieux pour étudier la biologie du développement, le vieillissement, la neurobiologie et la génétique. Le vaste corpus de travaux sur C. elegans en fait un candidat idéal pour s’intégrer dans des études sur de grandes populations d’animaux entiers afin de disséquer les composants biologiques complexes et leurs relations avec un autre organisme. Afin d’utiliser C. elegans dans la recherche collaborative omique, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations d’animaux où un seul échantillon peut être divisé et analysé sur diverses plateformes pour des analyses comparatives.

Ici, une méthode pour culturer et recueillir une population abondante d’elegans de C. de mélange-étape sur un plat de culture à grande échelle (LSCP) et des données phénotypiques suivantes est présentée. Ce pipeline produit un nombre suffisant d’animaux pour recueillir des données phénotypiques et de population, ainsi que toutes les données nécessaires aux expériences omiques (c.-à-d. génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique). De plus, la méthode LSCP exige une manipulation minimale pour les animaux eux-mêmes, moins de temps de préparation de l’utilisateur, fournit un contrôle environnemental étroit et garantit que la manipulation de chaque échantillon est cohérente tout au long de l’étude pour la reproductibilité globale. Enfin, des méthodes permettant de documenter la taille de la population et la répartition de la population de C. elegans aux stades de vie dans un LSCP donné sont présentées.

Introduction

C. elegans est un petit nématode libre que l’on trouve dans le monde entier dans une variété d’habitats naturels1. Sa relative facilité de croissance, son temps de génération rapide, son système de reproduction et son corps transparent en font un organisme modèle puissant qui a été largement étudié en biologie du développement, en vieillissement, en neurobiologie et en génétique2,3. Le travail copieux sur C. elegans en fait un candidat de choix à utiliser dans les études -omiques pour relier de manière exhaustive les phénotypes aux composants biologiques complexes et à leurs relations dans un organisme donné.

Pour utiliser C. elegans dans la recherche omique collaborative, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations d’animaux à stade mixte où un seul échantillon peut être divisé et utilisé sur diverses plateformes et instruments pour des analyses comparatives. La création d’un pipeline pour générer un tel échantillon nécessite une conscience aiguë de l’alimentation, de l’environnement, du stress, de la structure de la population, ainsi que de la manipulation et de la collecte des échantillons. Par conséquent, il est crucial d’intégrer des conditions de culture standard et reproductibles dans des pipelines à grande échelle. Dans la recherche de C. elegans, deux méthodes traditionnelles sont utilisées pour la culture des vers - les boîtes de Pétri d’agar et la culture liquide4.

Historiquement, lorsque de grandes quantités de C. elegans sont nécessaires, ils sont cultivés en culture liquide4. Les étapes impliquées dans la génération d’une grande population de vers en culture liquide nécessitent de multiples étapes de manipulation qui incluent souvent la synchronisation de l’eau de Javel pour rompre les cuticules adultes gravides, libérant des embryons pour atteindre la taille de population souhaitée. Toutefois, lorsque la synchronisation de l’eau de Javel est utilisée, la croissance de la population dépend de la taille du recensement et, par conséquent, a une effet sur la croissance et les chiffres de population subséquents. De plus, les souches de C. elegans varient dans leur sensibilité à la cuticule, leur temps d’exposition et leur réponse au stress à la synchronisation de l’eau de Javel, ce qui rend difficile le dosage de nombreuses souches à un moment5,6,7,8,9.

De plus, la croissance des vers en culture liquide nécessite quelques étapes de transfert car il est souvent recommandé de ne cultiver qu’une seule génération de vers avant la récolte, car le surpeuplement peut facilement se produire s’il est cultivé pendant plusieurs générations et entraîner la formation de dauer malgré la présence de nourriture10. La formation de Dauer se produit par de petites molécules de signalisation telles que les ascarosides, souvent appelés « phéromones dauer »11,12,13,14,sont libérées dans des milieux liquides et affectent la croissance de la population. En outre, la croissance de grandes populations de vers en culture liquide entraîne une accumulation excessive de bactéries dans la culture, ce qui crée des difficultés lorsqu’un échantillon propre est nécessaire pour les essais phénotypiques en aval. Enfin, lorsqu’une culture liquide est contaminée, elle est plus difficile à maintenir car les spores fongiques ou les cellules bactériennes sont facilement dispersées dans l’ensemble du milieu15.

L’autre méthode traditionnelle de culture de C. elegans est sur des boîtes de Pétri d’agar. Les boîtes de Pétri disponibles dans le commerce permettent de cultiver facilement plusieurs générations de vers à stade mixte sans les effets rapides de la surpopulation et de la formation élevée de dauer comme on le voit dans les cultures liquides. Cependant, un inconvénient de la croissance des vers sur les boîtes de Pétri traditionnelles est que la plus grande boîte de Pétri disponible dans le commerce ne donne pas de grandes populations de vers pour une étude -omique sans ajouter une étape de synchronisation de l’eau de Javel. En résumé, la culture de populations à stade mixte de C. elegans sur des boîtes de Pétri à gélose convient mieux à la collecte de données omiques, mais nous avions besoin d’une méthode pour générer de très grandes tailles de population sans culture liquide.

Ici, nous présentons une méthode de culture et de collecte de grandes populations de C. elegans au stade mixte sur des plaques de culture à grande échelle (LSCP). La collecte d’échantillons dans ce pipeline permet de recueillir suffisamment d’échantillons pour recueillir des données phénotypiques et de population, ainsi que toutes les données nécessaires aux expériences omiques(c.-à-d.génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique). De plus, la méthode LSCP exige une manipulation minimale des animaux, moins de temps de préparation de l’utilisateur, fournit un contrôle environnemental serré et garantit que la manipulation de chaque échantillon est cohérente tout au long de l’étude pour la reproductibilité globale.

Protocole

1. Stériliser le LSCP et l’équipement

  1. Préparez des LSSP en verre par lavage des mains, suivi d’un lavage de la vaisselle et d’un autoclavage ultérieur pour vous assurer que la verrerie est exempte de contaminants avant de commencer l’expérience. Entreposer les LSCPs autoclavés dans un endroit propre et sec jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
    REMARQUE: Assurez-vous que les LSCPs sont sûrs pour le lave-vaisselle et l’autoclave. Assurez-vous que les couvercles du LSCP sont sécuritaires pour le lave-vaisselle.
  2. Préparez les couvercles du LSCP en les lavant les mains et en les lavant la vaisselle. Rangez les couvercles LSCP dans un bac propre jusqu’à ce que nécessaire.
  3. Le jour où l’agarose des milieux de croissance des nématodes (NGMA) est préparé, essuyez les couvercles LSCP avec une solution d’eau de Javel à 10% deux fois, suivie d’éthanol à 70%. Une fois essuyés avec 10% d’eau de Javel et 70% d’éthanol, conservez les couvercles LSCP dans un bac propre dans la hotte à flux laminaire où le NGMA sera préparé.

2. Préparer l’agarose des milieux de croissance des nématodes (NGMA)

  1. Préparer le NGMA en combinant les réactifs suivants dans une fiole d’Erlenmeyer autoclavée de 2 L avec barre d’agitation sur une plaque d’agitation : 2,5 g de peptone, 3 g de NaCl, 7 g d’agarose, 10 g de gélose et 975 mL d’eau stérile16. S’assurer que le volume total est égal à 1 L. Coller un bouchon de feuille dans le ballon.
    REMARQUE : Les étapes de préparation de la NGMA décrites ici fourniront suffisamment de matière pour 2,5 LSCPs. Le protocole peut être adapté à la taille de lot LSCP nécessaire dans une expérience donnée.
  2. Autoclave sur cycle liquide à 121 °C et 21 p.s.i. pendant 45 min.
  3. Allumez le bain-marie et réglez à 50 °C. Apportez le NGMA autoclavé au bain-marie pour refroidir à 50 °C.
  4. Introduire une fiole Erlenmeyer de 2 L de NGMA dans la hotte ou dans l’espace nettoyé et la mettre sur une plaque de brassage. Utilisez un thermomètre pour suivre la température ngma.
  5. Une fois que le NGMA a atteint 50 °C, ajouter ce qui suit dans l’ordre indiqué avec une pipette stérile jetable à l’intérieur de la hotte ou de l’espace nettoyé : 25 mL de 1 MKH2 PO4 (tampon phosphate K), 1 mL de cholestérol (5mg/mL dans l’éthanol), 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de nystatine (10mg/mL), et 1 mL de streptomycine (100 mg/mL)16.
  6. Verser 400 mL de NGMA dans un LSCP en verre stérile, d’environ 1,3 cm de profondeur, permettre au LSCP de se solidifier sur une surface plane dans le capot et replacer le couvercle de feuille autoclavée sur le LSCP.
  7. Une fois la gélose réglée, retirez la feuille et placez un couvercle propre et étanche à l’air sur le LSCP et passez à 4 °C pour le stockage. Conserver le NGMA dans des LSCPs à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé et utilisé dans les 5 jours.

3. Générer des aliments pour E. coli pour la NGMA sur le LSCP

  1. Pour générer une source alimentaire stable, générez des lots de HT115 (DE3) E. coli en utilisant un concept de moyenne par petits lots compatible avec le théorème de la limite centrale17. Conserver à -80 °C. Au besoin, tirez le(s) stock(s) de bactéries E. coli de -80 °C àdécongeler 18.
    REMARQUE : Dans ce protocole, les stocks bactériens d’E. coli ont été cultivés dans un bioréacteur. À la fin de la croissance de la culture, la culture a été diluée 1:50, et la DOmesurée 600 était 0,4. Ainsi, la culture avait un ODefficace 600 de 20. Les bactéries ont été enrobées, pesées et remises en suspension dans un milieu K à une concentration de 0,5 g/mL (poids humide), transférées dans des aliquotes de 2 mL et congelées19.

4. Pelouse bactérienne sur NGMA

  1. Amener les LSCP NGMA hors de 4 °C à température ambiante (RT) pendant plusieurs heures avant d’étaler la pelouse bactérienne pour permettre à l’ensemble du LSCP d’atteindre RT.
  2. Retirer le ou les stocks de bactéries E. coli nécessaires de -80 °C à18° C.
  3. Diluer le(s) stock(s) bactérien(s) E. coli avec 2 mL de milieu K stérile pour atteindre 0,5 g E. coli dans 4 mL par LSCP NGMA. Pipetter soigneusement 4 mL de E. coli au milieu du LSCP ngma.
  4. Utilisez un épandeur stérile pour répandre les bactéries dans un rectangle laissant environ 3,8 cm de place autour des bords de la NGMA E. coli exempte.
  5. Laissez le LSCP NGMA avec E. coli dans le capot avec le ventilateur allumé pendant 1 h pour vous assurer que la suspension de E. coli sèche complètement.
  6. Une fois que la pelouse bactérienne est sèche, appuyez fermement sur le couvercle et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.

5. Vers à morceaux pour réduire le stress et la variabilité de l’âge entre les échantillons

  1. Vers de stries d’un stock de vers congelés à une plaque de 6 cm nouvellement ensemencée4. Cette plaque servira de plaque « morceau maître ».
    REMARQUE: Le chunking est une méthode optimale pour transférer des vers d’une souche homozygote20. Si une souche est hétérozygote ou doit être maintenue par la cueillette et l’accouplement, le segment n’est pas conseillé. La fréquence de segmentation peut devoir être optimisée en fonction des génotypes de vers utilisés, de la température choisie pour la croissance et des étapes en aval.
  2. Une fois que la plaque de morceaux maître est pleine d’adultes gravides en bonne santé (environ 3 jours) avec beaucoup de pelouse d’E. coli encore présente, suivez les directives standard de segmentation de C. elegans telles que décrites dans WormBook pour produire quatre plaques de morceaux au total4.
  3. Entreposer toutes les plaques de morceaux dans une pièce à température contrôlée (CT) à 20 °C, sauf indication contraire pour la croissance.
    REMARQUE: Si les utilisateurs de ce protocole n’ont pas accès à une salle de TDM comme décrit ici, il est recommandé d’utiliser soit un petit incubateur où la température peut être contrôlée, soit une pièce désignée où les conditions environnementales peuvent être contrôlées autant que possible. Si aucune de ces options de rechange n’est disponible, il est à noter que la variation de la croissance de l’échantillon peut être plus grande.
  4. Une fois que de nombreux adultes gravides sont observés dans la plaque du4 e morceau, passez à l’étape 6.

6. Spot blanchir les adultes gravides sur le LSCP

REMARQUE: Cette technique de blanchiment est utilisée pour éradiquer la plupart des contaminants et dissoudre la cuticule des hermaphrodites libérant des embryons du ver adulte. La solution d’eau de Javel va tremper dans le NGMA avant l’éclosion des embryons.

  1. Apportez les LSCPs à RT pendant plusieurs heures avant de repérer les vers de blanchiment.
  2. Préparer un rapport 7:2:1 deddH2O: eau de Javel : 5 M NaOH. Rendre cette solution d’hypochlorite alcaline fraîche juste avant utilisation.
    REMARQUE: Utilisez le même stock d’eau de Javel et de NaOH pendant toute la durée d’une expérience donnée pour éviter les effets de lot d’eau de Javel. L’eau de Javel utilisée dans ce protocole était de l’hypochlorite de sodium à 5-10%.
  3. Allumez un brûleur Bunsen et allumez un pic à vis sans fin avant de continuer. Prélever E. coli frais sur un pic stérile à partir du bord de la pelouse bactérienne du LSCP.
  4. Choisissez un seul adulte gravide dans la plaque du4 e morceau pour le blanchiment ponctuel.
  5. Pipetter 5 μL de la solution d’hypochlorite alcaline dans un coin du LSCP à l’écart de la pelouse de E. coli.
  6. Placer l’adulte gravide cueilli dans la solution d’hypochlorite alcalin de 5 μL. Appuyez sur le nématode pour aider à perturber la cuticule et à libérer les œufs.
  7. Répétez les étapes 6.4 à 6.6 pour un total de 4x et placez 5 adultes gravides uniformément autour de la pelouse de E. coli. Choisissez les 5 adultes gravides dans la même plaque de4 e morceaux pour vous assurer que des individus presque génétiquement isogéniques sont ajoutés à un échantillon donné.
  8. Replacez le couvercle sur le LSCP.
  9. Répétez les étapes pour tous les LSCPs.

7. Croissance des vers dans la salle à température contrôlée (CT)

  1. Après le blanchiment ponctuel, placez le couvercle hermétiquement sur le LSCP et placez-le dans la salle de tomodensitométrie réglé à 20 °C avec un flux d’air constant et une photopériode 12L:12D (12 h de lumière et 12 h d’obscurité).
  2. Notez l’heure et la position où l’échantillon a été placé dans la salle de TDM.
    NOTA : La position dans la pièce doit toujours être documentée afin d’enregistrer les différences environnementales que les échantillons pourraient rencontrer pendant la croissance. Une fois que l’échantillon est dans la salle de TDM, il doit rester à l’endroit qui lui a été assigné sans être dérangé. N’ouvrez pas le couvercle du LSCP dans la salle de TDM pour réduire le risque de contamination.
  3. Emmenez le LSCP à un microscope, à l’extérieur de la salle de TDM, pour observer la croissance et la densité de la population.
    REMARQUE: Chaque souche et échantillon de C. elegans variera dans sa croissance, alors surveillez les échantillons de près. Bien qu’il soit recommandé de ne pas perturber la croissance du LSCP dans la salle de TDM, les LSCP ont été transportés hors de la salle de TDM et les couvercles ont été ouverts tous les 2 jours pour surveiller la croissance de l’échantillon. Enlever les couvercles scellés des LSCP tous les 2 jours permet également à O2 de s’écouler dans le LSCP.
  4. Avant la récolte, assurez-vous que le LSCP est devenu plein d’une grande population de vers. Utilisez les critères suivants pour décider si le LSCP est prêt à être collecté.
    1. Assurez-vous que le LSCP est plein de vers adultes gravides.
    2. Assurez-vous que la plaque contient une grande taille de population (c.-à-d. que les vers couvrent toute la surface de la gélose).
    3. Assurez-vous que la plaque ne contient pas beaucoup d’œufs à la surface de la gélose(c.-à-d.que le nombre maximal de vers aurait dû éclore).
    4. Assurez-vous qu’il reste de la plaque peu ou pas de E. coli, ce qui indique que les vers mourraient de faim et généreraient des larves plus dauer s’ils étaient laissés sur la plaque pendant deux jours supplémentaires.
      REMARQUE : Bien que la plupart des LSCP soient prêts à récolter entre 10 et 20 jours, selon la souche et l’échantillon, vérifiez fréquemment chaque LSCP lors de l’établissement de ce protocole pour déterminer les temps de récolte normaux.
  5. Nettoyez les gants et la zone avec 70% d’éthanol entre la manipulation des LSCPs pour éviter la contamination croisée entre les souches.

8. Récolte de l’échantillon du LSCP

  1. Allumez et laissez la centrifugeuse refroidir à 4 °C avant de récolter les échantillons.
  2. Préparer trois tubes coniques de 50 mL avec 50 mL de solution M9 par LSCP à récolter.
  3. Étiqueter un tube conique de 15 mL par LSCP.
    REMARQUE: Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées dans le tube conique de 15 mL, car les vers ont tendance à bien se granuler dans ces tubes.
  4. Verser 50 mL de solution M9 (à partir d’un tube conique de 50 mL à l’étape 8.2) sur la surface LSCP et tourbillonner pour s’assurer que M9 couvre toute la surface NGMA.
  5. Alors que M9 se trouve sur la surface du LSCP, amorcez une pipette sérologique stérile avec M9.
    REMARQUE: En amorçant la pipette sérologique stérile avec M9, cela garantit que moins de vers collent à l’intérieur de la pipette en plastique, empêchant ainsi la perte d’échantillon.
  6. Inclinez le LSCP de sorte que M9 et la population de vers se rassemblent dans un coin du LSCP.
    REMARQUE: Le mélange de solution M9 et de vers du LSCP sera appelé la « suspension de ver » dans les étapes en aval.
  7. À l’aide d’une pipette sérologique amorcée avec un pipeteur automatique, une suspension de ver de pipette et placez-la dans le tube conique d’origine de 50 mL. Une fois que 50 mL de suspension de ver sont collectés, placez le tube conique sur une bascule pour perturber les touffes et les débris bactéries.
  8. Répétez les étapes 8.4 à 8.7 en collectant 150 mL de suspension de ver par LSCP.
  9. Transférer 15 mL de suspension de ver, à partir de l’un des trois tubes coniques de 50 mL, en versant dans un tube conique de 15 mL marqué mis de côté à l’étape 8.3. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 884 x g pendant 1 min à 4 °C. La majorité des vers vont granuler au fond du tube.
  10. Aspirez le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille de ver.
  11. Continuer d’ajouter environ 13 mL de suspension de ver au même tube conique de 15 mL en répétant les étapes 8.9 et 8.10 jusqu’à ce que les 150 mL de suspension de ver soient consommés. Inversez le tube et perturbez le culot entre les centrifugations pour laver et aspirer autant de bactéries et de débris que possible.
    NOTA : À cette étape, le contenu des trois tubes coniques de 50 mL est condensé dans un seul tube de 15 mL.
  12. Ajouter 10 mL de M9 propre au tube conique de 15 mL et agiter le culot de ver en inversant. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 884 x g pendant 1 min à 4 °C. Aspirez le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille de ver. Répétez deux fois.
    REMARQUE : S’il y a une grande quantité de débris ou de bactéries dans l’échantillon, répétez l’étape 8.12 jusqu’à ce que l’échantillon soit propre.
  13. Une fois l’échantillon propre, ajouter ddH2O à la pastille de ver pour un total de 10 mL de ddH2O et de vers. Agiter la pastille de ver en inversant. Passez rapidement à l’étape 9.1, car les vers doivent rester dansddH2Opendant 5 min ou moins pour éviter le stress osmotique.
    REMARQUE: La suspension des granulés de ver dans le ddH2O est le solvant préféré pour les étapes omiques en aval. Les vers peuvent être suspendus dans d’autres solvants ou tampons s’ils sont compatibles avec un flux de travail expérimental donné.

9. Estimation de la taille de la population

REMARQUE: Passez rapidement par les étapes 9.1 à 9.7. Le mélange deddH2O et de vers de l’étape 8.13 est appelé « échantillon de ver » dans les étapes suivantes.

  1. Avant de pipeter l’échantillon de ver, la pointe de pipette principale doit être utilisée avec M9 pour éviter que les vers ne collent à l’intérieur de la pipette en plastique empêchant la perte d’échantillon et réduisant la variation du compte.
  2. Prélever une aliquote de 100 μL de l’échantillon de ver et le diluer en 900 μL de M9. Bien mélanger et faire une dilution en série (1:10, 1:100, 1:1000). Répétez cette étape deux fois pour obtenir un total de trois ensembles de répliques aliquotes.
    NOTA : Les vers pipetage peuvent entraîner une grande variabilité des chiffres de population des échantillons. Assurez-vous que l’échantillon de ver est homogène avant de pipetter la partie aliquote souhaitée.
  3. Placez le tube conique de 15 mL sur une bascule pour continuer à déplacer la culture pendant que les aliquotes sont comptées.
  4. Assurez-vous que l’échantillon de ver est bien mélangé et homogène. Pipetter 5 μL de l’échantillon de ver 1:10, le distribuer sur une lame de microscopie et compter le nombre de vers. Si ce nombre est inférieur à environ 50 vers, comptez également les dilutions 1:100 et 1:1000. S’il est supérieur à 50, passez à la dilution sérielle suivante.
    Remarque : Si trop de vers ne peuvent pas être comptés avec précision, utilisez plutôt la dilution sérielle suivante pour le comptage.
  5. Comptez chaque réplique aliquote de chaque dilution 3x. À la fin du dénombrement, pour la plupart des cultures, 9 dénombrements totaux seront documentés(c.-à-d.3 dénombrements totaux pour chaque réplique aliquote).
  6. Faire la moyenne du nombre de dilutions pour déterminer la taille estimée de la population de l’échantillon de vers. Ces comptes de dilution détermineront le volume d’échantillon de ver nécessaire pour créer la taille de la partie aliquote souhaitée pour les étapes -omiques.
    REMARQUE : Dans cette expérience, des aliquotes d’environ 200 000 vers à stade mixte ont été générées. De plus, une partie aliquote d’environ 50 000 vers à stade mixte a été réservée au tri dans un grand cytomètre à flux de particules (décrit à l’étape 10).
  7. Une fois que l’échantillon de ver a été divisé en aliquotes appropriées, geler instantanément dans de l’azote liquide et stocker l’échantillon à -80 °C.
    NOTA : Ne congelez pas la partie aliquote destinée à la cytométrie en flux de particules de grande taille.

10. Échantillon de préparation (facultatif) pour la cytométrie en flux de grandes particules

NOTA : Les étapes 10, 11 et 12 sont la méthode préférée des auteurs pour consigner la croissance de l’échantillon(c.-à-d.la taille de la population et la répartition de la population aux stades du cycle de vie de C. elegans) et déterminer le succès d’une culture. Les utilisateurs de ce protocole peuvent remplacer les étapes facultatives 10, 11 et 12 par leurs propres mesures de réussite de la croissance. Les étapes 10, 11 et 12 sont décrites ici pour deux raisons ; premièrement, afin que les utilisateurs qui ont un équipement utilisé dans les étapes 10, 11 et 12 puissent répliquer ces étapes et deuxièmement, pour afficher la validation de cette méthode de croissance. L’étape 9 ci-dessus fournit une bonne estimation du nombre total de vers pour déterminer la taille des aliquotes, et l’étape 10 est une mesure plus quantitative pour estimer le nombre et la distribution de la population de vers dans un échantillon donné.

  1. Porter la partie aliquote d’environ 50 000 vers à stade mixte (mis de côté à l’étape 9.6) jusqu’à 10 mL de volume total dans une solution M9.
  2. Réaliser une solution composée de 1 mg/mL de E. coli et d’une dilution 1:50 de microsphères fluorescentes rouges de 0,5 μM19.
  3. Ajouter 200 μL de cette solution aux 10 mL de vers à stade mixte dans M9 et incuber pendant le balancement pendant 20 min.
  4. Après 20 min, centrifuger le tube conique de 15 mL à 884 x g pendant 1 min à 4 °C.
  5. Aspirez le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille de ver.
  6. Lavez le culot deux fois avec la solution M9 pour éliminer l’excès de bactéries et les microsphères fluorescentes rouges.
  7. Ajoutez 5 mL de M9 à la pastille de ver et assurez-vous que la pastille a l’air propre. Si le culot est propre, ajoutez 5 mL de M9 avec 50 mM d’azide de sodium pour redresser et tuer les vers pour un comptage et un calibrage précis21.
  8. Documenter l’heure et la date d’ajout de l’azide de sodium à l’échantillon.
  9. Mettez l’échantillon de côté sur la bascule jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour la cytométrie en flux de particules importantes.
    REMARQUE: L’azide de sodium est connu pour affecter la physiologie des nématodes(c.-à-d.la longueur du corps, le métabolisme et la thermotolérance). Par conséquent, il est essentiel de noter le temps pendant lequel les vers sont exposés à l’azide de sodium, car bon nombre de ces effets physiologiques se produisent en quelques minutes22. En raison des effets physiologiques connus de l’azide de sodium sur les vers, ce traitement affectera la qualité de l’image en aval et devrait être envisagé.

11. (Facultatif) Documenter la répartition de la population et préparer une plaque de 384 puits pour l’imagerie

REMARQUE: Étape 11 utilise un cytomètre de flux de particules de grande taille (LPFC). La connaissance de base d’un LPFC est assumée dans ce protocole. D’autres méthodes peuvent être substituées pour documenter la croissance et la répartition de la population des échantillons. Les étapes décrites ici sont destinées aux utilisateurs qui prévoient d’utiliser un LPFC dans leur pipeline23.

  1. Allumez, nettoyez et amorcez le LPFC, et laissez le ou les lasers se réchauffer pendant 1 h avant de trier les échantillons.
  2. Une fois le laser réchauffé, ouvrez le profil "Histogramme" et mettez à l’échelle un temps de vol (TOF) de 2050.
  3. Ajoutez une région de barre àl’histogrammecouvrant une plage de TOF de 100. La première région de bar couvre un TOF de 50-150.
  4. Continuez à créer vingt régions de barre couvrant chacune une plage tof de 100. Ces régions de barre couvriront toute la gamme tof de 50 à 2050. Voir le tableau supplémentaire 1 pour les régions fermées exactes à utiliser dans l’ensemble de la distribution tof.
  5. Enregistrez cet histogramme configuré comme une "expérience" à utiliser dans les futures exécutions LPFC.
  6. Choisissez une plaque calibrée de 384 puits ou un instrument étalonné sur une plaque de 384 puits dans qui distribuer des objets.
  7. Une fois dans le gabarit de plaque calibré de 384 puits, définissez le gabarit pour distribuer 20 objets à contrôle dans quatre puits (quatre répétitions techniques de chaque région fermée) pour chacune des 20 régions de barres créées au cours des étapes 11.3-4. Voir le tableau supplémentaire 2 pour un exemple de disposition sur la façon de distribuer des vers dans la plaque de 384 puits.
  8. Transférer l’échantillon de l’étape 10.9 dans un tube conique de 50 mL et ajouter une solution M9 supplémentaire pour atteindre un volume total d’environ 40 mL.
  9. Commencez à trier automatiquement l’échantillon selon les paramètres définis à l’étape 11.7 tout en remuant continuellement l’échantillon pour éviter la décantation et en distribuant simultanément des objets de l’échantillon dans la plaque calibrée de 384 puits.
    REMARQUE : Assurez-vous que le débit du LPFC fonctionne entre 15 et 20 objets par seconde et ne spécifiez aucun double à trier.
  10. Une fois que l’échantillon entier a été trié et que le nombre maximal de régions fermées a été distribué dans la plaque de 384 puits, retirez l’échantillon du LPFC et nettoyez l’instrument.
    REMARQUE: Lorsque de plus grandes régions tof sont atteintes, il peut devenir difficile de continuer à remplir la plaque de 384 puits en raison du faible nombre d’événements dans cette région tof. Remplissez autant de régions fermées que possible pour avoir la meilleure idée de l’endroit où les stades de vie de C. elegans se situent dans la distribution LPFC avant de manquer d’échantillon.
  11. Placez un film d’étanchéité sur la plaque de 384 puits jusqu’à ce qu’il soit cédée.
    REMARQUE: Plaque d’image le plus rapidement possible après le tri car les échantillons sont traités avec de l’azide de sodium22. Les microsphères fluorescentes rouges peuvent être vues dans les fichiers de données LPFC collectés(c’est-à-dire les données PH Red dans le fichier texte de sortie) en fonction du niveau de fluorescence rouge émis dans chaque objet trié pour aider à identifier quels objets sont des vers vivants, des vers morts, des dauers ou des déchets24.

12. Plaque d’imagerie 384 puits (en option)

REMARQUE: L’étape 12 utilise un micromicroscope confocal à lecture de plaques. La connaissance de base d’un microscope micro confocal est assumée dans ce protocole. D’autres méthodes peuvent être substituées pour documenter la croissance et la répartition de la population des échantillons.

  1. Utilisation d’un micromicroscope confocal à lecture de plaques avec une lentille 20x.
  2. Ouvrez l’onglet "Objectif et caméra" et réglez sur le mode "10x Plan ApoLambda« .
  3. Ouvrez l’onglet "Camera Binning" et réglez sur "2« .
  4. Ouvrez l’onglet "Sites à visiter sur la plaque" et définissez sur "4" sites par puits et "sites de chevauchement 10%" pour assembler plus tard des images.
  5. Ouvrez l’onglet "Longueur d’onde" et définissez sur "Brightfield 1« .
  6. Ouvrez l’onglet "Illumination" et réglez sur "Transmitted light, bright sample« .
  7. Placez la plaque de 384 puits dans le microscope et réglez la "Z Stack" sur "Calculate Offset" et trouvez le plan focal approprié pour les échantillons dans la plaque de 384 puits.
  8. Exécutez la plaque de 384 puits sur le micromicroscope confocal en collectant quatre images par puits.
  9. Montage des quatre images ensemble pour créer une image par puits.

Résultats

La croissance de C. elegans à l’aide de la méthode LSCP donne en moyenne environ 2,4 millions de vers à stade mixte par échantillon sur une base de 12,2 jours. La croissance de C. elegans à l’aide de la méthode LSCP permet aux utilisateurs de générer de grandes populations de stade mixte de C. elegans avec peu de manipulation et de manipulation des animaux, ce qui est idéal pour les études omiques à grande échelle (Figure 1). Une fois qu’un LSCP est devenu plein de vers adultes, a atteint une grande taille de population et a un minimum de bactéries restantes, les utilisateurs peuvent récolter et estimer la taille de la population. Ce point peut également servir de contrôle de la qualité en évaluant si la population est suffisante pour être utilisée dans un pipeline -omique (Figure 2). La dynamique de la population dépend de la souche elle-même, du comportement de la souche(c.-à-d. queles souches fouisseurs avaient tendance à avoir une récupération plus faible des vers) et du succès de croissance(c.-à-d.contamination). La méthode LSCP a été testée sur 15 souches de C. elegans contenant un mélange de mutants du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) et de souches sauvages Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR)25. Les génotypes des souches sont décrits dans le tableau supplémentaire 3.

La méthode du LSCP a donné des tailles de population d’environ 94 500 à 9 290 000. La taille moyenne de la population à l’intérieur de la souche de référence PD1074 et de l’ensemble des souches était d’environ 2,4 millions de vers (figure 3). Aucune différence significative n’a été constatée dans la taille estimée des populations entre les souches de C. elegans au cours d’une moyenne de 12,2 jours de croissance du LSCP (figure 4). PD1074 Les LSCPs ont pris entre 10 et 14 jours pour atteindre une population complète à stade mixte. Le temps de croissance moyen sur PD1074 était de 10 jours. La souche à croissance la plus lente a augmenté pendant un maximum de 20 jours, et la souche à croissance la plus rapide a augmenté pendant au moins 10 jours (Figure 4).

Par conséquent, en utilisant cette méthode LSCP, les utilisateurs peuvent facilement intégrer de nouvelles souches d’intérêt dans une étude avec peu de connaissances sur le calendrier de développement et l’expertise de base. Notez que les souches et les phénotypes qui doivent être maintenus par prélèvement, qui présentent des défauts de fécondité, qui sont hétérozygotes ou qui ont des défauts de croissance peuvent ne pas bien fonctionner dans ce pipeline.

La cytométrie en flux de particules volumineuses et l’imagerie des échantillons permettent aux utilisateurs de documenter la distribution de la population. Une grande variété de plateformes peut être utilisée pour mesurer la croissance démographique réussie.

Pour les mesures omiques reproductibles, il est important de cultiver des cultures cohérentes. Les mesures de reproductibilité de la culture sont le nombre de vers et une distribution granurale cohérente pour une souche donnée. Nous montrons la distribution de l’échantillon pour la souche de référence, PD1074 - une variante de la souche N2 Bristol originale, en utilisant les images LPFC23,26 et micromicroscope confocale comme indicateurs du succès de la croissance. Comme les vers ont été mesurés du stade L1 à l’adulte gravide sur la distribution LPFC(figure 5),l’imagerie ultérieure(figure 6)et la variation de la distribution de la population entre les échantillons(figure 7),nous pouvons voir que ce pipeline a généré une population à stade mixte de C. elegans.

Pour examiner de plus près la répartition de la population de nos échantillons à stade mixte, nous avons examiné la répartition de 35 LSP PD1074 en examinant le pourcentage de vers qui se trouvent dans chaque région sur l’ensemble de la distribution du temps de vol (TOF)(c.-à-d.la longueur du corps)(Figure 7A,B).

figure-results-1
Figure 1 : Vue d’ensemble du pipeline de croissance du ver LSCP. (A) Une fois reçues en laboratoire, toutes les souches ont été préparées et congelées pour un stockage à long terme à -80 °C2. (B) Une plaque « morceau principal » a été préparée à partir d’un ver congelé et conservée à 15 °C pour être utilisée pendant un mois au plus. (C) Chaque échantillon a franchi quatre étapes successives de segmentation afin de réduire le stress générationnel avant de croître sur le LSCP. (D) 5 adultes gravides individuels ont été cueillis dans la plaque de « morceau 4 » de 6 cm à l’étape (D) et blanchis spot sur cinq zones données du LSCP. (E) Le LSCP a été placé dans une salle à température contrôlée et cultivé à 20 °C jusqu’à ce que le LSCP soit plein de vers adultes, atteigne une grande taille de population et qu’il reste un minimum de bactéries. (F) La population de vers a été récoltée et recueillie pour les étapes en aval. (G) Des aliquotes ont été créées à partir du LSCP et ont été gelées pour les applications souhaitées en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Aperçu de la récolte du PCPS et estimation de la taille de la population. (A) 50 mL de M9 ont été utilisés pour laver les vers de la surface ngma. La suspension de ver a été pipetted dans un tube conique de 50 mL. L’étape (A) a été répétée deux fois. (B) 15 mL de suspension de ver ont été versés dans un nouveau tube conique de 15 mL. Les vers ont été granulés par centrifugation. M9 + débris ont été aspirés sans boulette de ver dérangeante. L’étape (B) a été répétée jusqu’à ce que les 150 ml de suspension de ver soient collectés. (C) La pastille de ver a été lavée et centrifugée trois fois avec M9 pour éliminer les débris restants. Une fois l’échantillon propre, la pastille de ver a été remise en suspension dans 10 mL de ddH2O.(D) Une dilution en série de l’échantillon a été créée pour estimer la taille de la population de vers. Le ou les facteurs de dilution qui permettaient de compter les vers avec précision ont été utilisés. Le ou les facteurs de dilution utilisés ont changé en fonction de la taille de la population du LSCP. (E) Une fois le ou les facteurs de dilution choisis, tous les vers des trois répliques aliquotes de cette dilution ont été pipetés sur une lame propre et les vers ont été comptés au microscope de dissection. (F) L’échantillon a été divisé en aliquotes de taille appropriée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : La méthode LSCP a généré en moyenne une population de 2,4 millions de vers à stade mixte. Le LSCP donne des tailles de population dans les plus petites croissances de population à environ 94 500 et dans les plus grandes croissances de population à environ 9 290 000. La taille moyenne de la population pour toutes les souches était de 2,4 millions de vers. Les barres sous les noms des souches de C. elegans indiquent si une souche est un mutant de la CCG ou un isolat naturel de Cendr. La taille de l’échantillon LSCP est affichée pour chaque souche. Des comparaisons pour toutes les paires utilisant le test HSD de Tukey ont été effectuées. Aucune différence significative n’a été observée entre la taille estimée des populations de C. elegans (F(14 108) = 0,7, p = 0,77). Les barres colorées indiquent des affichages de couleur standard pour la représentation de la souche C. elegans respective. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : La méthode LSCP a généré d’importantes populations de vers à stade mixte en 10 à 20 jours. Un LSCP de C. elegans donné s’est développé jusqu’à ce que l’échantillon soit rempli de vers adultes, atteigne une grande taille de population et ait laissé une pelouse bactérienne minimale. Les LSCPs ont mis entre 10 et 20 jours pour atteindre une population complète à stade mixte, selon la souche. Le temps de croissance moyen entre les souches était de 12,2 jours. La taille de l’échantillon LSCP est affichée pour chaque souche. Chaque barre d’erreur a été construite à l’aide de 1 écart type par rapport à la moyenne. Les niveaux non connectés par la même lettre sont significativement différents. Comparaisons pour toutes les paires à l’aide du test HSD de Tukey. Une différence significative a été trouvée dans la quantité de temps de croissance sur LSCP nécessaire à travers des souches de C. elegans (F (14,108) = 8,8, p < 0,0001 *). Les barres colorées indiquent des affichages de couleur standard pour la représentation de la souche C. elegans respective. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Mesure mixte de la population et de la croissance de la souche de référence de type sauvage, PD1074. Une distribution représentative de la LPFC d’une croissance LSCP de la souche de référence de type sauvage, une variante de la souche N2 Bristol originale (PD1074), documente la distribution de la taille et le nombre d’événements d’une population à stade mixte. L’axe des x affiche la longueur (Temps de vol, TOF) des vers triés. L’axe des y affiche la densité optique (extinction optique, EXT) des vers triés. Chaque point de données est un ver qui a été documenté dans l’exemple. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. Vingt régions tof ont été créées (R2 – R21) allant d’un TOF de 50 à 2050. Des détails sur chaque région du TOF se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Des images de vers triés à partir de régions TOF allant de R2 à R12 montrent la distribution PD1074 LPFC. Dans la région R2, les vers L1 peuvent être identifiés et dans la région R9, des adultes principalement gravides sont identifiés, couvrant les deux extrêmes larvaires développementaux nous donnant des régions approximatives dans la distribution du cytomètre de flux où les stades sont attendus dans la distribution. La barre d’échelle représente 1 mm. Des images représentatives ont été prises à partir de la distribution LPFC affichée à la figure 5,et les cases colorées correspondent aux régions de la figure 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-7
Figure 7 : Répartition de la population dans les régions de temps de vol (TOF) dans la souche de référence de type sauvage, PD1074. Distribution des vers dans toute la région TOF montrant les régions où les vers ont été trouvés. Chaque PD1074 LSCP est représenté sous la forme d’une couleur individuelle. (A) L’axe des x montre les vingt régions TOF (R2 – R21) observées et comptées pour le LSCP, affichant la distribution de taille entière. L’axe des y montre le pourcentage de vers d’un LSCP donné dont la taille corporelle est tombée dans une région TOF donnée. (B) Comme une plus petite fraction de la population de vers se situe entre les régions R7-R21, le log du pourcentage de vers qui se trouvait dans chaque région a été pris pour afficher la distribution de la population. L’axe des x affiche les régions TOF R7-R21. L’axe des y affiche le journal du pourcentage de vers d’un LSCP donné dont la taille corporelle est tombée dans une région TOF donnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Température quotidienne moyenne (°C) des conditions de croissance dans lesquelles le LSCP a été cultivé et manipulé. Les températures signalées dans la salle à température contrôlée (TDM) ont été documentées et recueillies tout au long de la période de six mois de croissance et de prélèvement de l’échantillon. La température quotidienne moyenne est indiquée ici. Aucune différence significative n’a été observée entre la température à laquelle le PCSV a augmenté pendant la durée du projet (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). La différence de température totale ne s’est pas étendue à plus de 0,003 °C pendant les six mois de croissance et de production de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Régions fermées TOF utilisées pour trier les vers en plaques de 384 puits à des fins d’imagerie. Les régions binned ont été créées pour couvrir un TOF de 100 sur l’ensemble de la distribution tof de 50 à 2050. Les régions fermées peuvent être modifiées et optimisées pour répondre à vos besoins. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Gabarit de plaque de 384 puits des régions tof et disposition de réplique. Chaque échantillon a été trié dans une plaque de 384 puits pour l’imagerie. Quatre répliques ont été créées pour chaque région sélectionnée pour le tri. Les régions fermées peuvent être modifiées et optimisées pour répondre à vos besoins. Voir le tableau supplémentaire 1 pour les régions fermées spécifiques créées et utilisées dans ce protocole. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 3 : Les souches de C. elegans utilisées dans le présent protocole contiennent un mélange de souches de la CCG et du Cendr. La souche, le génotype, la source de la souche et les détails sont décrits dans ce tableau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Une variété de navires peuvent être utilisés comme LSCP. Dans ce protocole, un plat de cuisson en verre standard a été utilisé. Les LSPCs utilisés avaient des dimensions extérieures de 35,56 x 20,32 cm, des dimensions intérieures de 27,94 x 17,78 cm et une profondeur d’environ 4,45 cm et étaient munis d’un couvercle. Ainsi, la quantité de bactéries utilisée ici a été optimisée pour un LSCP avec les dimensions ci-dessus pour produire une grande population de vers à stade mixte. Le volume et la concentration bactériens peuvent être ajustés pour répondre aux besoins expérimentaux.

La contamination par des moisissures, des champignons ou d’autres sources bactériennes peut se produire à n’importe quelle étape de la méthode LSCP, alors manipulez les échantillons avec soin. Avant de commencer toute étape du protocole, assurez-vous que l’espace de travail est nettoyé avec 70% d’éthanol et 10% d’eau de Javel. Si disponible, traiter les zones utilisées avec de la lumière UV pendant 30 min et allumer un filtre à air HEPA 30 min avant de commencer chaque étape.

En cultivant le LSCP dans un environnement contrôlé(c’est-à-diredans une salle de TDM réglée à 20 °C), l’utilisateur peut plus facilement suivre la croissance de l’échantillon et documenter la contamination potentielle. Si la surface du LSCP est contaminée, soit éliminer la contamination dans la mesure du possible et laisser l’échantillon continuer à croître, soit jeter l’échantillon s’il n’est pas possible de contrôler la contamination. Il est impératif de s’attaquer rapidement à la contamination afin de réduire la croissance indésirable et de s’assurer qu’elle ne surpasse pas les vers pour les ressources.

Cette méthode est destinée à ceux qui veulent cultiver des cultures de population mixte à grande échelle de C. elegans. Bien qu’il puisse être possible de cultiver des populations synchronisées de vers sur le LSCP comme cela a été fait sur des boîtes de Pétri disponibles dans le commerce et en culture liquide, les auteurs n’ont pas testé cette option. De plus, si les utilisateurs souhaitent cultiver plus d’environ 2,4 millions de vers en moyenne dans un échantillon donné, une méthode différente est recommandée4. Le succès de la croissance dépend de la souche traitée dans le pipeline. Les auteurs ont réussi à développer des populations d’environ 2,4 millions de vers dans au moins cinq répétitions biologiques de 15 souches de C. elegans, ce qui indique que la méthode est robuste.

Avant de commencer l’expérience, notez que l’âge et la santé d’un ver donné peuvent influencer la fécondité et le temps de croissance de la population ultérieur. Assurez-vous que les vers sont maintenus dans des conditions saines avec un minimum de stress avant d’être utilisés dans ce pipeline. On suppose que des échantillons de stock ont été créés, congelés et conservés à -80 °C pour réduire la dérive génétique au fil du temps.

Selon les besoins d’une expérience donnée, le nombre d’adultes gravides partants sur un LSCP peut être modifié. La modification du nombre d’adultes gravides partants dans le LSCP modifiera le taux de croissance et, par conséquent, le temps de récolte. Cinq adultes gravides sont utilisés pour ensemencer chaque LSCP pour les raisons suivantes : (1) Un moyen simple, rapide et efficace d’ensemencer de nombreuses souches de C. elegans sur des LSCP en même temps était nécessaire et (2) pour réduire les différences d’âge parmi les adultes gravides cueillis qui pourraient mener à l’hétérogénéité de croissance.

Cette méthode permet à l’utilisateur de récolter de grandes populations de vers avec tous les stades du cycle de vie présents. Avec les méthodes actuelles disponibles, la collecte d’échantillons à grande échelle de C. elegans nécessite une synchronisation de l’eau de Javel pour obtenir le nombre de vers souhaités pour le travail en aval. Compte tenu de cette approche, on peut maintenant cultiver autant de vers que possible auparavant dans des fermenteurs ou des cultures liquides à grande échelle sans les difficultés associées à la synchronisation de l’eau de Javel et aux multiples étapes de manipulation. Notre protocole permet de cibler efficacement les souches d’intérêt, d’utiliser un temps de manipulation minimal pour la croissance de l’échantillon lui-même et d’isoler les stades des vers ou de la population au besoin dans les pipelines en aval.

Un LPFC a été utilisé comme outil pour documenter la répartition et la taille de la population dans un LSCP donné. Le LPFC utilisé est un système à flux continu qui analyse, trie et distribue les vers en fonction de leur taille (TOF) et de leur densité optique. Comme un ver donné passe à travers la cellule d’écoulement, le détecteur axial de perte de lumière capture la quantité de lumière de signal bloquée par un laser à semi-conducteurs de 488 nm pendant la durée nécessaire à un ver pour passer à travers, donnant à l’utilisateur la tof et la densité optique du ver. L’optique et les détecteurs de collecte de fluorescence peuvent également être utilisés pour maximiser la sensibilité à la fluorescence et la collecte sur chaque échantillon. Les paramètres de collecte LPFC varient en fonction de l’instrument. Les utilisateurs peuvent utiliser une variété de plates-formes pour capturer la taille des vers et ne sont pas limités à l’utilisation de ce protocole si un LPFC n’est pas disponible.

Les auteurs utilisent des échantillons cultivés selon la méthode décrite ici pour identifier des métabolites inconnus dans diverses souches de C. elegans par chromatographie liquide – spectrométrie de masse, spectroscopie RMN et séquençage de l’ARN. Les auteurs prévoient continuer à utiliser cette méthode pour la croissance d’échantillons dans ce pipeline avec une variété de souches de C. elegans, car de nouvelles souches d’intérêt peuvent être facilement traitées à l’aide de ce pipeline.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Edison pour les discussions utiles et les commentaires sur ce manuscrit; en particulier, B.M. Garcia. Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440), et cendr, qui est financé par NSF Living Collections CSBR 1930382. Ce travail a été soutenu par une subvention des NIH (U2CES030167).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pipettes sérologiques stériles de 10 mLVWR89130-898
Pointes de pipette 10 ulVWR89079-438
Pointes de pipette 100 ulVWR89079-442
Cylindre gradué de 1000 mLVWR10124-380
Pointes de pipette 1000 ulsVWR89079-488
Tubes coniques de 15 mLVWR89039-668
Éthanol à 190 degrésVWR89125-166
Flasque Erlenmeyer à large col de 2 LVWR75804-654
Tubes coniques de 50 mLVWR75874-294
AgarSigma05040-100G
AgaroseSigmaA9539-500G
Système d’aspiration de fluide G à contrôle BVCVacuubrand
Chlorure de calciumSigma449709-10G
CholestérolSigmaC3045-25G
Javel CloroxVWR89414-502
Salle de contrôle de la température du ConvironConvironhttps://www.conviron.com/environmental-rooms
Corning Low Volume 384 Well noir avec microplaque à fond plat transparent en polystyrène traitée TCVWR89089-866
Fisher Scientific Accuspin 3RFisher
Plaque à fond plat à 24 puitsVWR29443-952
Purificateur HEPA Honeywell True 465 sq ft.Home Depot204390560
HT115 E. coli (DE3)CGCHT115(DE3)https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)
KimwipesVWR470224-038
Plaque de culture à grande échelle (LSCP)Pyrex1090948Plat de cuisson en verre Pyrex de 2 pintes avec couvercle rouge
Sulfate de magnésiumSigmaC86677-25G
MgSO4VWR97062-998
Lames simples pour microscopesVWR16004-422
Filtre MilliporeMillipore1.11727.2500
Appareils moléculaires ImageXpressDispositifs moléculairesNuméro de modèle : IXMConfocalhttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , les auteurs ont utilisé MetaXpress Software Version 6.5.4.532
Nystatine (10 mg/mL)SigmaN6261-25MU
PeptoneSigmaP7750-100G
Plaques de Petri (6 cm)VWR25384-092
Contrôleur de pipetteVWR613-4180
Chlorure de potassiumFisherP217-3
Phosphate de potassium monobasiqueVWR0781-500G
Hydroxyde de potassiumFisherP250-500
Microsphères rouges fluorescentesPolysciences19507-5
Chlorure de sodiumSigma746398-500G
Hydroxyde de sodiumFisher111357
Phosphate de sodium dibase anhydreFisherBP332-500
Jeu de pipettes Gilson standardGilsonFA10002M, FA10004M, FA10006M
Streptomycine (100 mg/mL)SigmaS6501-25G
Union Biometrica COPAS BioSorterUnion Biometricahttps://www.unionbio.com/biosorter/ , les auteurs ont utilisé : Flow Pilot version 1.6.1.3.

Références

  1. Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).
  2. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).
  4. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
  5. Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7 (1), 9839(2017).
  6. Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).
  7. Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).
  8. Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).
  9. Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4 (4), 5117(2009).
  10. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
  11. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
  12. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  13. Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6 (3), 17804(2011).
  14. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
  15. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  16. Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).
  17. Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).
  18. Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
  19. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
  21. Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).
  22. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  23. Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
  24. Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).
  25. Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
  26. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).

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Culture et dosage de populations de Caenorhabditis elegans à grande échelle au stade mixte
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