Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7

Summary

L’article décrit la quantification de 1) la taille et le nombre d’adhérences focales et 2) l’indice de forme cellulaire et sa distribution à partir d’images confocales des monocouches confluentes des cellules MCF7.

Abstract

Les méthodes présentées ici quantifient certains paramètres des monocouches de cellules adhérentes confluentes à partir de multiples images confocales correctement tachées : adhérence au substrat en fonction du nombre et de la taille des adhérences focales, et de la forme cellulaire, caractérisée par l’indice de forme cellulaire et d’autres descripteurs de forme. Les adhérences focales ont été visualisées par la coloration de paxilline et les bordures de cellules-cellules ont été marquées par la plakoglobine de jonction et l’actine. Les méthodes de culture cellulaire et de coloration étaient standard; les images représentent des plans focals uniques; l’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’un logiciel de traitement d’images accessible au public. Les protocoles présentés sont utilisés pour quantifier le nombre et la taille des adhérences focales et les différences dans la distribution de la forme cellulaire dans les monocouches, mais ils peuvent être réutilisés pour la quantification de la taille et de la forme de toute autre structure cellulaire distincte qui peut être tachée (p. ex., mitochondries ou noyaux). L’évaluation de ces paramètres est importante dans la caractérisation des forces dynamiques dans la couche cellulaire adhérente, y compris l’adhérence cellulaire et la contractilité de l’actomyosine qui affecte la forme cellulaire.

Introduction

Les monocouches épithéliales de cellules agissent comme un collectif dans lequel l’adhérence cellule-cellule et cellule-substrat ainsi que les forces contractiles et les tensions représentent des paramètres importants et leur juste équilibre contribue à l’intégrité globale de l’unité^1,2,3. Ainsi, l’évaluation de ces paramètres représente un moyen d’établir l’état actuel de la couche cellulaire.

Les deux méthodes décrites ici représentent une analyse bidimensionnelle des monocouches confluentes des cellules épithéliales adhérentes (dans ce cas mcf7 ....

Protocol

1. Étapes préparatoires

1. Ensemencement cellulaire pour obtenir des monocouches confluentes
   1. Avant l’ensemencement, enduisez les puits d’une lame de chambre de 4 puits de collagène I (ou d’un autre composant ECM de choix). Pour le revêtement de collagène I, suivez un protocole commercial : https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html à une concentration de 8 μg/cm².
   2. Ensemencez 400 000 cellules dans un puits d’une lame de chambre de 4 puits.
   3. Culture les cellules pendant 24 h (ou plus, selon les critères d’évaluation expérimentaux) avant la coloration, dans un incubateu....

Results

Analyse focale de l’adhérence
Le knockdown du gène HAX1 a été précédemment montré pour affecter les adhérences focales⁶. Les cellules ont été cultivées sur la surface enduite de collagène I pendant 48 h. Des images des cellules témoins MCF7 et des cellules MCF7 avec un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de trois expériences indépendantes tachées de paxilline de protéine d’adhérence focale ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal (image à partir d’un s.......

Discussion

L’adhérence cellule-cellule et cell-substrat constitue des attributs inhérents des cellules épithéliales et jouent le rôle critique dans la morphogenèse des tissus et l’embriogenèse. Dans les tissus adultes, la régulation appropriée des propriétés mécaniques de la couche cellulaire est cruciale pour maintenir l’homéostasie et prévenir les réponses pathologiques comme la progression et la métastase de tumeur. La taille et le nombre d’adhérences focales dépendent de la force de l’adhérence cellule-substrat, tandis que la f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	chèvre anti-lapin, 1:500
Chlorure d’ammonium	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagène de peau de veau	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL en H2O), acide nucléique coloration
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Jonction plakoglobine	Signalisation cellulaire	2309S	lapin, 1:400
Armoire à flux laminaire classe 2	Alpina		équipement standard
MCF7-basedHAX1KD lignée cellulaire	Lignée cellulaire établie à l’Institut national d’oncologie de Varsovie, décrite dans Balcerak et al., 2019		MCF7 lignée cellulaire avecHAX1knockdown
MCF7 (CONTRÔLE)	ATCC	ATCC HTB-22	épithéliale, lignée cellulaire de cancer du sein adhérente
Olympus CK2 microscope optique Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	lapin, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
conjugué phalloïdine-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL dans le DMSO), marquage de l’actine
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST &ndash ; NaCl	Sigma	S9888
TBST &ndash ; Culot Trizma	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Microscope confocal	Zeiss