Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

Résumé

L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Résumé

Le transcriptome à haut débit et le profilage épigénome nécessitent la préparation d’une seule cellule ou d’une suspension de noyaux uniques. La préparation de la suspension avec des cellules ou des noyaux intacts implique la dissociation et la perméabilisation, des étapes qui peuvent introduire le bruit indésirable et les dommages indésirables. En particulier, certains types de cellules tels que les neurones sont difficiles à dissocier en cellules individuelles. En outre, la perméabilisation de la membrane cellulaire pour libérer des noyaux nécessite une optimisation par essais et erreurs, ce qui peut prendre du temps, de la main-d’œuvre intensive et financièrement non viable. Pour améliorer la robustesse et la reproductibilité de la préparation de l’échantillon pour le séquençage à haut débit, nous décrivons une méthode rapide d’isolement des noyaux à base d’enzymes et de noyaux sans détergent. Le protocole permet un isolement efficace des noyaux de l’ensemble du cerveau du poisson zèbre dans les 20 minutes. Les noyaux isolés présentent une morphologie nucléaire intacte et une faible propension à l’agrégat. De plus, la cytométrie du débit permet l’enrichissement des noyaux et le dégagement des débris cellulaires pour l’application en aval. Le protocole, qui devrait fonctionner sur les tissus mous et les cellules cultivées, fournit une méthode simple et accessible pour la préparation de l’échantillon qui peut être utilisée pour le profilage à haut débit, en simplifiant les étapes requises pour réussir les expériences ARN-seq et ATAC-seq.

Introduction

L’ARN-seq unicellulaire (scRNA-Seq) et l’ATAC-seq sont des outils polyvalents pour étudier les systèmes biologiques complexes à résolution unicellulaire. Ils sont largement utilisés pour définir les sous-types cellulaires et les états, les réseaux génétiques et pour évaluer l’hétérogénéité cellulaire. Une condition préalable pour effectuer scRNA-seq est la préparation d’une suspension à cellule unique par dissociation tissulaire. En raison de la variation de la composition extracellulaire de la matrice et des propriétés mécaniques, les tissus individuels nécessitent l’optimisation du protocole de dissociation pour la préparation de la suspension à cellule unique.

La dissociation des tissus en cellules individuelles implique généralement un traitement avec des enzymes digestives, y compris la collagène, la dispase ou la trypsine, à 37 °C^1,2,3,4. Comme les machines transcriptionnelles restent actives à 37 °C, la dissociation enzymatique peut introduire des artefacts d’expression d’ARNm et du bruit^5,6. Notamment, l’incubation prolongée peut induire des gènes sensibles au stress et une réponse de choc thermique d’une manière non uniforme – conduisant à une variabilité technique dans l’expérience⁷.

Un autre inconvénient de générer une suspension à cellule unique est la difficulté d’obtenir des types de cellules viables et intacts avec des morphologies complexes. En particulier, les neurones, les adipocytes et les podocytes sont difficiles à isoler^8,9,10,11. Par exemple, Wu et ses collègues ont démontré l’absence de podocytes glomerulaires dans les profils scRNA d’un rein de souris adulte¹². Des observations non optimales similaires ont été faites concernant la récupération des neurones interconnectés à partir du tissu cérébral^8,13,14. En résumé, les protocoles de dissociation peuvent introduire un biais de détection vers une plus grande dissociation des types cellulaires, conduisant à une fausse représentation de l’architecture cellulaire de l’organe.

Pour surmonter le bruit technique et le biais introduits lors de la préparation de l’échantillon dans scRNA-Seq., l’isolement et le profilage du noyau offre une alternative attrayante. Comme la morphologie nucléaire est similaire entre les différents types de cellules, l’isolement des noyaux contourne la question de l’isolement des cellules intactes et viables avec des morphologies complexes. Par exemple, Wu et ses collègues ont démontré le profilage réussi des podocytes glomerulaires avec l’ARN-Seq à noyau unique (snRNA-Seq.) d’un rein de souris adulte, qui manquait de scRNA-Seq¹². Curieusement, des études comparatives entre l’ARN-seq unicellulaire et uni-noyau ont suggéré une diminution de l’induction des gènes de stress et de réponse de choc thermique avec snRNA-Seq¹². Les études suggèrent en outre une forte corrélation entre les gènes détectés par les deux méthodes. Cependant, une étude récente sur les microglies humains n’a pas détecté l’activation génétique dans la maladie d’Alzheimer¹⁵. Ainsi, dans certains contextes, snRNA-Seq est une alternative appropriée pour scRNA-Seq^16,17. En outre, l’isolement nucléaire peut être utilisé pour l’ATAC-Seq à cellule unique, fournissant des informations sur les régions de la chromatine ouverte dans les cellules individuelles.

Le protocole pour l’isolement des noyaux comporte trois étapes principales : i) la lyse à base de détergent de la membrane cellulaire pour libérer le noyau; ii) homogénéisation des tissus à l’aide d’un homogénéisateur Dence; et iii) l’enrichissement des noyaux et l’enlèvement des débris cellulaires à l’aide de la centrifugation de gradient ou de la cytométrie de flux^{18,19,20,21,22}. Parmi ceux-ci, les deux premières étapes dépendent du type de tissu et doivent être empiriquement optimisées. Le détergent doux conduit à la rupture partielle de la membrane cellulaire et à la récupération inefficace des noyaux du tissu²³. D’autre part, le niveau élevé de détergent et l’homogénéisation dure conduit à la rupture de la membrane nucléaire et leur perte^24,25. Les noyaux rompus ont en outre tendance à s’agglutiner et à former des agrégats qui, s’ils ne sont pas enlevés, peuvent mener à des artefacts dans l’expérience de profilage en aval.

Pour contourner les problèmes liés à l’optimisation des détergents pour l’isolement des noyaux, nous introduisons un protocole pour isoler les noyaux intacts à partir d’échantillons frais à l’aide d’une méthode sans détergent et à base de colonne de spin. Le protocole donne des noyaux d’organe entier dans les 20 minutes, limitant l’induction de la transcription artefactale. Les noyaux isolés peuvent être enrichis avec facs pour les noyaux simples RNA-Seq. et ATAC-seq, fournissant une méthode simple et universelle qui permet le profilage robuste et reproductible à haut débit.

Protocole

Toutes les procédures présentées ci-dessous ont été réalisées conformément aux directives et réglementations institutionnelles (Université Libre de Bruxelles) et nationales éthiques et animales, qui ont été approuvées par le Comité d’éthique pour le bien-être animal (CEBEA) de l’Université Libre de Bruxelles (protocoles 578N-579N).

1. Préparation avant dissection tissulaire

1. Préparer une solution tricaine à 0,2 % dans pbs pour euthanasier le poisson zèbre. Refroidir la solution sur la glace.
2. Préparer un plat Petri de 30 mm pour hacher le tissu.
3. Préparer le froid glacial 1x PBS (10 mL par échantillon de tissu).
4. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
5. Pour l’isolement des noyaux, utilisez un kit d’isolation des noyaux sans détergent (Table des matériaux).
6. Avant de commencer le protocole, le tampon A et B pré-réfrigérant s’est fourni dans le kit en les plaçant sur la glace pendant au moins 30 min avant l’isolement des noyaux.
7. Pour manipuler les noyaux isolés, enrobez les réactifs en plastique tels que les tubes et les pointes de pipette d’une solution BSA de 5 %. Pour cela, préparer la solution en dissolvant 2 g de BSA dans 40 mL de PBS. Le revêtement des articles en plastique avec 5% BSA réduit les noyaux coller au plastique. Cette étape améliore la récupération des noyaux isolés.
8. Enrober les pointes de pipette en pipeting 5% BSA solution 2-3 fois. Sécher à l’air les extrémités pendant 2 heures. Préparer 10 pointes de plastique par échantillon.
9. Enrober les tubes pour la collecte des noyaux en les remplissant de 5% de BSA. Inverser les tubes 3 fois pour assurer un revêtement efficace. Retirer la solution et sécher les tubes à l’envers sur un papier de soie propre pendant 2 heures. Par échantillon, enduire un tube de collecte fourni dans le kit. En outre, préparer des tubes enduits de 1,5 mL pour la collecte des noyaux après FACS.
   REMARQUE : Les pointes en verre sont fortement recommandées alternative aux bouts de pipette en plastique pour minimiser le collage.

2. Dissection du cerveau de poisson zèbre

1. Pour euthanasier le poisson zèbre, préparez une boîte de Pétri de 90 mm avec 25 mL de solution tricaine glacée.
2. Prenez soigneusement le poisson zèbre du réservoir à l’aide d’un filet de pêche et placez-le dans la boîte de Pétri.
3. Euthanasier le poisson en le laissant en Tricaine pendant 5 min.
4. Décapiter l’animal avec une lame de rasoir tranchante.
5. À l’aide de forceps, ouvrez doucement le crâne et retirez les tissus mous, la peau et les os du côté ventral et dorsal du crâne.
6. Transférer doucement le cerveau dans un plat frais de 30 mm contenant du PBS glacé.
7. Hacher le cerveau en petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir pour faciliter le chargement de l’échantillon sur la colonne de rotation.

3. Isolement des noyaux uniques

1. Transférer le tissu haché à la cartouche de filtre fournie dans le kit d’isolement des noyaux et ajouter 200 μL de tampon à froid A pour sensibiliser le tissu. Broyer le tissu à l’aide de la tige en plastique fournie par le kit pendant 2 min.
2. Ajouter 300 μL de tampon froid A et incuber la cartouche de filtre sur la glace avec une calotte ouverte pendant 10 min.
3. Cap la cartouche et resuspend le tissu en inversant le tube 5 fois.
4. Centrifugeuse à 16 000 x g pour 30 s. Dans cette étape, les cellules sont rompues en passant par le filtre et la force centrifuge à grande vitesse est appliquée. Le flux à travers contient des noyaux intacts, qui pellet au fond du tube.
5. Jetez le filtre et resuspendez le granulé en vortexant vigoureusement pendant 10 s.
6. Pelleter les noyaux en centrifuant la solution à 500 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant soigneusement car le granulé de noyaux est incolore.
7. Resuspendez le granulé dans 0,8 mL de tampon B froid et centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min. Dans cette étape, les noyaux sont séparés des débris membranaires. Le granulé incolore obtenu contient des noyaux isolés.
8. Resuspendez les noyaux isolés dans 500 μL de PBS avec 5% de BSA. Gardez la suspension des noyaux sur la glace pour effectuer le FACS après la quantification.

4. Visualisation de la morphologie des noyaux

1. Confirmez la morphologie nucléaire par la coloration de Hoechst. Pour cela, retirez 100 μL de suspension de noyaux simples dans un nouveau tube à l’aide de pointes enduites de BSA. Pour tacher les noyaux, ajouter 0,1 μL de Hoechst (1 mg/mL). Vortex doucement le tube.
2. Transférer la suspension des noyaux dans le plat en verre pour l’imagerie.
3. Imagez les noyaux à l’aide d’un microscope à fluorescence avec des paramètres d’excitation laser d’une longueur d’onde de ~405 nm (Violet).

5. Enrichissement à base de noyaux par FACS

1. Avant d’effectuer le FACS, filtrer les noyaux à l’aide d’une passoire à cellules de 40 μm dans un tube enduit de BSA.
2. Diluer la suspension filtrée en ajoutant PBS avec 5% de BSA à un volume final de 1 000 μL.
3. Étiqueter deux tubes facs de fond ronds comme « ontrôl » et « ain ». Le tube de « ontrôlemen » contiendra des noyaux non tachés, tandis que le tube « ain » aura des noyaux tachés Hoechst.
4. Transférer 250 μL de la suspension des noyaux dans le tube « ontrôlemen » à l’aide de la pointe de pipette enduite BSA.
5. Transférer la solution restante de 750 μL dans un tube FACS étiqueté comme « ain » et ajouter 1 μL de colorant Hoechst pour tacher les noyaux. Mélanger par vortex lent.
6. Chargez l’échantillon de contrôle non taché vers le trieur de cellules. Enregistrez 5000 événements.
7. Chargez les échantillons tachés et enregistrez 5000 événements.
8. Dessinez des portes FACS qui permettent l’identification de noyaux simples. Les noyaux peuvent être sélectionnés en comparant le signal de fluorescence hoechst entre le contrôle et l’échantillon taché.
9. Trier les noyaux hoechst positifs du tube taché en nouveau tube de 1,5 mL contenant 50 μL de PBS avec 5% de BSA.
   REMARQUE : Les noyaux isolés peuvent être collectés dans un milieu désiré selon les exigences de l’application en aval.

Résultats

--Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour générer la suspension de noyau simple directement à partir du tissu cérébral de poisson zèbre. L’isolement nécessite généralement 20 minutes et éviter l’utilisation de détergent ou d’enzymes digestives. Un schéma résumant les différentes étapes du protocole est fourni à la figure 1, qui peut être imprimé pour être utilisé pour être guidé.

Figure 1 : Schématique de la méthode à base de colonne de rotation sans détergent pour l’isolement des noyaux.
Représentation graphique des étapes individuelles effectuées lors de l’extraction des noyaux à partir de tissus cérébraux de poissons zèbres frais. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Visualisation de la morphologie nucléaire

Pour la confirmation qualitative de la morphologie nucléaire, les noyaux isolés ont été tachés avec Hoechst et visualisés à l’aide de la microscopie de fluorescence. Les noyaux semblaient intacts, ronds et bien séparés (figure 2). Fait important, l’agrégation nucléaire, signe de rupture de la membrane nucléaire, était absente.

Figure 2 : Isolement unique des noyaux du cerveau du poisson zèbre.
Image de microscopie de fluorescence des noyaux hoechst-tachés démontrant leur morphologie intacte. Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Enrichissement à base de FACS des noyaux intacts

L’enrichissement des noyaux isolés et l’enlèvement des débris cellulaires ont été effectués par cytométrie de flux en gating sur la présence d’un signal de fluorescence hoechst. Le signal Hoechst a été détecté lors de l’excitation avec violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Les noyaux non tachés présentaient une fluorescence de fond (figure 3A, figure supplémentaire 1A),tandis que les noyaux tachés présentaient un signal fluorescent fort (figure 3B, figure supplémentaire 1B). Comme l’illustre la figure 3C, les noyaux tachés non tachés et hoechst étaient bien séparés dans le chenal violet.

Figure 3 : Les noyaux isolés affichent un signal fluorescent Hoechst fort et spécifique dans la cytométrie du débit.
Parcelles d’histogramme pour suspension de noyaux simples affichant la distribution de la coloration de Hoechst. Hoechst est excité par violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). L’échantillon non taché (A) affiche le signal dans la gamme de 10⁰-10³, tandis que hoechst teinté noyaux (B) émettent le signal dans la gamme 10^{3-10 5.} Une superposition de l’intensité de fluorescence émise par des échantillons non tachés (gris) et tachés (bleu) (C) démontre une séparation claire entre les deux populations. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Stratégie de gating de cytométrie de flux pour les noyaux isolés. Parcelles de débit représentatives pour suspension de noyaux isolés. Des noyaux isolés ont été analysés à l’aide de la dispersion vers l’avant et du laser violet BV421 qui excite Hoechst à 405 nm. L’échantillon non taché (A) affichait le signal BV421 dans la plage 10^{0-10 3.} Sur 13130 événements, 141 événements ont été détectés comme des noyaux simples basés sur FSC-A (1,07% du total), et 0 événements pour des noyaux non tachés basés sur le signal BV421 (0% du total). Les noyaux tachés Hoechst (B) affichaient le signal BV421 dans la gamme 10^{3-10 5.} Sur 50000 événements, 2418 événements ont été détectés comme des noyaux simples basés sur FSC-A (4,84 % du total) et 2414 événements pour les noyaux hoechst positifs basés sur le signal BV421 (4,83 % du total). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Discussion

Le profilage du transcriptome et de l’épigénome à une résolution unicellulaire a révolutionné l’étude des systèmes biologiques. Les études à la résolution d’une seule cellule pour un tissu solide dépendent de la dissociation de l’organe en cellules individuelles ou noyaux. La dissociation est une procédure destructrice qui peut introduire des artefacts techniques, ce qui peut empêcher le développement d’une représentation précise du système^5,6. Par exemple, la dissociation enzymatique peut nuire aux cellules morphologies complexes, telles que les neurones ou les podocytes, et peut induire l’expression de gènes de réponse au stress et aux chocs thermiques^7,12. En outre, l’utilisation de détergent pendant la dissociation peut rompre la membrane nucléaire et conduire à l’agrégation^23,25. Ainsi, l’optimisation de la dissociation pour obtenir une seule cellule ou une suspension de noyaux de la plus haute qualité est primordiale pour le succès des expériences de profilage à haut débit.

Ici, nous démontrons une méthode d’isolement des noyaux sans détergent et sans enzymes qui permet l’extraction de noyaux intacts du cerveau du poisson zèbre en moins de 20 minutes. Le protocole donne des noyaux avec une morphologie typique et une intégrité robuste (Figure 2). À partir d’un seul cerveau de poisson zèbre pesant 6 mg, le protocole donne un total de 60.000 noyaux déterminés par un nombre d’hémocytomètres. Les noyaux isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval, y compris le snRNA-seq, l’ATAC-seq et l’immunostaining. Les noyaux isolés peuvent inclure une contamination croisée par des fractions cytoplasmiques, en particulier à partir de composants de réticulum endoplasmique et de mitochondries. Pour les expériences de profilage à haut débit, le dégagement des débris cellulaires, en particulier les mitochondries, est fortement recommandé. La cytométrie de flux (figure 3) offre une option viable pour la purification des noyaux. Alternativement, le gradient de saccharose peut également être utilisé pour enlever des débris.

Le protocole a été testé sur la glande thyroïde de souris (données non montrées) et fournit des résultats semblables au tissu cérébral de poisson zèbre. Dans l’ensemble, le protocole fournit une méthode robuste, reproductible et universelle pour la préparation de la suspension à noyau unique, aidant à simplifier la logistique pour les expériences de profilage à haut débit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine (BSA)	Carl Roth	90604-29-8	Albumine fraction V
Trieur de cellules	BD Biosciences		FACSAria III
Centrifugeuse	Sartorius	A-14C
Tubes Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Corning	352096	Tubes
Falcon (5 mL )	Corning	352052	Tubes à essai à fond rond en polystyrène
Pince fine	Outils scientifiques	fins 11295-10
Passoire à cellules Flowmi (40 &mu ; m)	Sigma	BAH136800040
Microscope à fluorescence	Leica	DMI6000 B
Flacon en verre (250 mL)	VWR	215-1593
Plat à fond en verre	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Pipettes Pasteur en verre	VWR	612-1701
Douille de pipette en verre	Carl Roth	388.1	Aide au pipetage pi-pump 2500
Solution de colorant de coloration Hoechst	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit Invent	Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
boîte de Pétri (30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
Boîte de Pétri (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Pointes de pipette	VWR	89079	10 &mu ; L, 200 &mu ; L, 1000 &mu ; L
Pipettes	Gilson	F167380	Pipetman
Lame de rasoir	Swann-Morton	7981809
Tricaïne méthane sulfonate	Sigma	E10521
Vortex machine	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2